动物实时功能磁共振成像大脑映射

摘要

动物大脑功能映射可以从实时功能磁共振成像（fMRI）实验设置中受益。利用动物MRI系统中实施的最新软件，我们建立了小动物功能磁共振成像的实时监测平台。

摘要

动态功能磁共振成像反应在很大程度上取决于动物在麻醉或清醒状态下的生理状况。我们开发了一个实时fMRI平台，指导实验者在采集过程中即时监测fMRI反应，可用于修改动物的生理机能，以实现动物大脑中所需的血流动力学反应。实时功能磁共振成像设置基于14.1T临床前MRI系统，能够实时映射麻醉大鼠初级前爪体感皮层（FP-S1）中的动态fMRI反应。实时fMRI平台不是回顾性分析来研究导致fMRI信号变异性的混杂来源，而是提供了一种更有效的方案，使用定制的宏功能和MRI系统中的通用神经图像分析软件来识别动态fMRI反应。此外，它还为动物的大脑功能研究提供了即时故障排除可行性和实时生物反馈刺激范式。

引言

功能磁共振成像（fMRI）是一种非侵入性方法，用于测量与大脑神经活动相关的血流动力学反应¹，²，^3，4，⁵，⁶，⁷，⁸，^9，例如血氧水平依赖性（BOLD），脑血容量和流量信号。在动物研究中，血流动力学信号可受到麻醉10、清醒动物¹¹的应激水平以及潜在的非生理伪影（例如心脏搏动和呼吸运动¹²、13、^14、15）的影响。尽管已经开发了许多后处理方法来为任务相关和静息状态功能动力学和连接映射提供fMRI信号的回顾性分析¹⁶，¹⁷，¹⁸，¹⁹，但很少有技术可以提供实时脑功能映射解决方案和动物大脑中的瞬时读数²⁰（其中大部分主要用于人脑映射^21， 22，^23，24，²⁵，^26，27）。特别是这种实时功能磁共振成像成像方法在动物研究中是缺乏的。有必要建立一个功能磁共振成像平台，以实现实时脑状态依赖性生理阶段的研究，并为动物脑功能研究提供实时生物反馈刺激范式。

在本工作中，我们说明了使用MRI控制台软件的定制宏功能的实时fMRI实验设置，展示了对麻醉大鼠初级前爪体感皮层（FP-S1）中诱发的BOLD-fMRI反应的实时监测。这种实时设置允许使用现有的神经图像分析软件功能神经图像分析（AFNI）²⁸，在功能图中可视化正在进行的大脑激活，以及以体素方式显示单个时间过程。用于动物研究的实时fMRI实验装置的制备在协议中描述。除了动物设置外，我们还提供详细的程序，使用最新的控制台软件和图像处理脚本来设置实时fMRI信号的可视化和分析。总之，拟议的用于动物研究的实时功能磁共振成像设置是使用MRI控制台系统监测动物大脑中动态功能磁共振成像信号的有力工具。

研究方案

这项研究是根据德国动物福利法（TierSchG）和动物福利实验动物条例（TierSchVersV）进行的。此处描述的实验方案由伦理委员会（§15 TierSchG）审查，并由国家当局批准（Regierungspräsidium，图宾根，巴登 - 符腾堡州，德国）。

1. 为小动物研究准备BOLD-fMRI实验装置

1. 打开控制台软件以控制成像参数并获取MRI数据。
   注意:建议的实时功能磁共振成像设置是利用控制台软件（版本6）的宏功能与AFNI的图像处理功能并行实现的。
2. 使用工作区资源管理器查找 MR 序列（即位置、定位器、弛豫增强快速采集 （RARE） 和 3D 回波平面成像 （EPI），然后将它们拖动并附加到扫描列表中。
   注意:位置和定位器序列用于识别大脑中的感兴趣区域（ROI）。RARE序列用于解剖扫描。3D EPI 序列用于测量动态粗体响应。
3. 将预定义的宏脚本"Setup_rt3DEPI"和"Feed2AFNI_rt3DEPI"放在宏脚本路径中（例如，"/opt/（PV version）/prog/curdir/（用户名）/ParaVision/macros"）。激活"数据重建"用户界面菜单中的3D EPI重建选项，"图像前系列活动"和"执行宏"，然后在单击"扫描"按钮之前链接预定义的宏脚本"Setup_rt3DEPI"。
   注意:宏脚本包含在 补充文件中。
4. 安装 AFNI 软件以进行实时 BOLD-fMRI 分析和可视化。

2. 导尿通气手术

1. 设置呼吸机和生理状态监测系统，如温度计、血压和呼吸记录，如图 1所示。使用呼吸机设置60±1呼吸/分钟的恒定频率，并使用带有反馈控制装置的MR兼容加热垫设置37°C的温度。
2. 在含有5%异氟醚的腔室中麻醉成年雄性Sprague-Dawley大鼠（300-600g）进行诱导，并从蒸发器提供2-2.5%异氟烷用于手术。通过捏住后爪并确认缺乏戒断反应来检查麻醉深度。
3. 用14G塑料插管插管动物进行通气（60±1次呼吸/分钟，70%空气和30%氧气的混合物）。将潮气末二氧化碳 （_{CO 2}） 调整为 25 ± 5 mmHg²⁹ 范围内。
   注意:插管对于通过功能磁共振成像实验维持适当的CO₂ 水平至关重要。
4. 将动物仰卧放在手术台上，并用电动剃须刀剃大腿。然后，用手术剪刀在剃光的皮肤上切开一个切口。
   注意:切口的长度在纵向上约为1-2厘米。
5. 在切开区域下找到股动脉和静脉进行导管插入，并将单个股动脉和静脉与周围组织分开。
6. 用手术缝合线固定分离的股动脉的一侧，并用微型斗牛犬镊子固定另一侧。然后，在股动脉上的连接区域之间做一个小切口。
7. 通过小切口将导管插入股动脉，并用手术缝合线将导管和动脉绑在一起。使用生理监测系统持续监测动脉血压，使其在 80-120 mmHg 范围内，并定期测量动脉血气，以在扫描过程中保持最低 90 mmHg 的 pO 2 和 30-45 mmHg 的 pCO₂。
   注意:这种导尿对于在功能磁共振成像实验期间监测动脉血压至关重要。
8. 用丝编织手术缝合线固定股静脉的两端。然后，在股静脉的绑扎区域之间做一个小切口。使用镊子进行缝合。
   注意:缝合线的大小约为1-2厘米。
9. 将导管插入股静脉。用手术缝合线将导管和静脉绑在一起。
   注意:这种导管插入对于通过静脉施用α-氯蔗糖和在fMRI实验期间调整麻醉水平至关重要。如果动物没有很好地麻醉，它会开始自主呼吸。在这种情况下，必须给予更多的α-氯蔗糖以避免呼吸运动伪影。
10. 在剃光的皮肤上缝合手术切口。一旦外科手术完成，通过连接到股静脉的导管输注剂量为~80mg / kg的α-氯蔗糖推注，保持动物麻醉，并同时停止异氟醚给药。

3. 将动物放入 MRI 扫描仪内

1. 完成2.10步骤后，立即将麻醉动物转移到MRI扫描仪上，并将其固定在定制的摇篮上。
2. 在动物身上插入实时反馈直肠温度计以监测动物的温度。在动物的躯干下放置一个加热垫以控制温度。在MRI扫描期间将体温保持在37.0±0.5°C。
3. 在肌肉松弛剂泮库溴铵（~2 mg/kg/h）的混合物中连续递送具有~25mg / kg / h溶液的α-氯蔗糖，同时保持动物麻醉并减少fMRI图像中的运动伪影。根据生理状态调整药物量和通气速率，监测血压和呼吸。
4. 在动物的眼睛上施用眼药膏，以防止在fMRI实验期间干燥。用两个耳杆安全地固定动物的头部，以避免头部运动伪影。
5. 将收发器表面线圈固定在磁头上。在 MRI 测量之前，将线圈调谐并匹配到头部的拉莫尔频率（例如，14.1 T 上的 599 MHz）。
   注意:在这里，直径为22毫米的线圈用于覆盖大鼠的整个大脑。
6. 将一对针状电极插入前爪皮肤中的手指 1 和 4 之间，并用手术胶带固定它们。然后，确认在将刺激输入电缆连接到这些电极³⁰之后刺激工作正常。
7. 将动物插入MRI孔中，并将其大约放置在等中心。

4. 测量解剖学磁共振成像

1. 单击主用户界面中的校准菜单按钮。单击 调整平台 用户界面中的以下项目（请参阅控制台软件中的 "帮助 "菜单）执行MRI系统的校准:查找基本谐振频率，校准RF脉冲功率，设置最佳接收器增益，测量动物中的B0图以进行匀场，基于非局部自由感应衰减（FID）积分运行全局线性匀场。
   注意:此步骤不到 2 分钟。
2. 通过单击"扫描"按钮运行位置序列，以找到MRI孔内动物的头部位置。如果磁头不在等中心，请在来回移动底座的同时调整磁头位置，直到磁头位于等心处。
3. 通过单击"扫描"按钮运行本地化器序列，以识别头部的投资回报率。选择映射填充程序并定义填充程序体积的 ROI 以覆盖定位器图像中的整个大脑，然后使用"填充程序最多"选项运行高阶（例如，2^{阶或 3 阶）}匀场，以减少 ROI 处的主磁场 （B0） 不均匀性。
   注意:当使用EPI序列时，高阶匀场是提高BOLD-fMRI数据质量的关键步骤。
4. 通过单击"扫描"按钮运行 T2 加权 RARE 序列，以获取冠状视图中覆盖整个大脑的解剖图像（例如，使用以下序列参数:重复时间 （TR） 4000 ms，有效回波时间 （TE） 36.1 ms，矩阵 128 x 128，视野 （FOV） 19.2x19.2 mm²、切片数 32、切片厚度 0.3 mm， 稀有系数 8）。
   注意:在以下实时fMRI可视化步骤中，解剖图像用于将3D EPI图像注册为模板。

5. 实时功能磁共振成像软件设置和功能磁共振成像响应可视化

1. 打开终端窗口并使用以下命令转到实时 AFNI 插件路径:
   cd /home/（用户名）/rt_afni
   注意:AFNI 插件脚本"afni_rt"包含在 补充文件中。
2. 使用以下命令和选项使用实时插件执行 AFNI 软件。
   AFNI -RT
   -yestplugouts
   -DAFNI_REALTIME_MP_HOST_PORT=本地主机:（端口号）
   -DAFNI_REALTIME_Graph=实时
   -DAFNI_FIM_IDEAL=（范式）
   注意:在第一种情况下，代码允许外部程序与 AFNI 交换数据，而在第二种情况下，实时插件将尝试打开用户定义的本地主机和端口的 TCP 套接字。在第三种和第四种情况下，当获取实时功能磁共振成像数据时，代码将实时绘制功能磁共振成像数据的时间过程，并分别绘制用户定义范式在功能磁共振成像时间过程中的时间过程。有关更多详细信息，请查看 https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/README.environment.html。
3. 监视使用命令"Dimon"定义的即将发布的 AFNI BRIK 文件，如图 2 所示，具有以下选项:
   Dimon -tr （TR of EPI） -nt （NRepetitions of EPI）
   -RT -退出
   -infile_pattern实时*。布里克
   -file_type AFNI
   注意:"Dimon"是使用以下选项监视AFNI图像文件的实时采集的命令:"-rt"执行实时插件和"-infile_pattern（数据名称）。BRIK -file_type AFNI"，它允许插件读取特定的BRIK文件并将其发送到AFNI进行显示和格式化。有关更多详细信息，请查看 https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/Dimon.html。
4. 使用带有以下选项的"pvcmd"命令:
   pvcmd -a JMacroManager JMMExecuteMacro -category $USER -macro Feed2AFNI_rt3DEPI
   注意:此代码存在于宏脚本"Setup_rt3DEPI"中，用于在单击"扫描"按钮进行EPI采集后立即运行后台宏脚本"Feed2AFNI_rt3DEPI"。
5. 使用带有以下选项的"exec pvcmd"命令获取 EPI 采集参数。
   exec pvcmd -a ParxServer -r ParamGetValue -psid $ParSpaceId -param （PVM parameters of EPI） -id 10 -args $AcqKey $ParSpaceId $ProcnoPath
6. 使用带有以下选项的"exec to3d"命令，在后台宏脚本"Feed2AFNI_rt3DEPI"中实时将EPI原始数据转换为AFNI文件。
   exec to3d -omri -xFOV $FOV_X -yFOV $FOV_Y -zFOV $FOV_Z -prefix $LastVolName $ImgFormat$Path2dseq
7. 确保EPI几何信息与解剖方向一致。
   注意:"to3d"AFNI 命令将自动运行，其中包含视场 （FOV） 和矩阵大小等几何信息，以将 fMRI 原始数据转换为一个 AFNI BRIK 数据，只要每个 TR 之后存储每个 3D 体积数据，如图 2 所示。可以使用"to3d"的几何信息参数更改图像方向。有关更多详细信息，请查看 https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/to3d.html。
8. 打开电刺激隔离器并使用刺激块进行电前爪刺激，以进行一个诱发的 fMRI 研究（例如，3Hz，4s 脉冲宽度 300us，2.5mA）。
   注意:在这里，模块设计范式包括 10 次刺激前扫描、3 次刺激扫描和 12 次刺激间扫描（每个时期 15 次扫描）。
9. 通过单击BOLD-fMRI研究的"扫描"按钮运行T2*加权3D EPI序列（例如，使用以下参数:TR / TE 1500 / 14 ms，矩阵64 x 64 x 32，FOV 19.2 x 19.2 x 9.6 mm 3和分辨率300 x 300 x 300 μm³）。
   注意:单击"扫描"按钮后，将使用预定义的宏脚本实时监视和处理原始数据。转换一个 AFNI BRIK 数据集后，3D EPI 图像的体素时程图将显示在 AFNI 软件中，并针对每个 TR 自动更新。
10. 要将 EPI 图像叠加在解剖学 RARE 图像之上，请使用步骤 5.6 中的命令"to3d"将 RARE 图像转换为 AFNI BRIK 数据集，然后使用以下选项使用"align_epi_anat.py"AFNI 脚本将 EPI 图像注册到解剖图像:
    align_epi_anat.py -anat anatomy_template_al+orig -epi epi.$（epi data number）+orig -epi_base 1 -后缀 _volreg -rat_align -成本 LPA -epi2anat
    注意:有关更多详细信息，请查看 https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/ align_epi_anat.py.html。
11. 要处理粗体响应的功能图，请使用具有以下选项的"3dDeconvolve"命令计算具有特定刺激时间序列的 3D+time 数据集的反卷积:
    3d去卷积 -输入 （输入文件名）+原始 -nfirst 0 -polort 3 -num_stimts 1 -stim_times 1 （刺激范式文件名） 'BLOCK（4，1）' -stim_label 1 前爪 -tout -fout -rout
    注意:空间平滑或时间过滤等图像处理步骤已合并到自定义的 AFNI 数据处理脚本中。有关更多详细信息，请查看 https://afni.nimh.nih.gov/afni/doc/help/3dDeconvolve.html。
12. 要可视化粗体信号的功能图，请使用 AFNI 软件中的交互式聚类。打开"定义叠加"选项，然后使用 AFNI 用户界面菜单中的"集群"功能。
13. 最后一次fMRI扫描后，将动物从MRI扫描仪中取出，并根据批准的方案对其进行安乐死。
    注意:AFNI的图像处理功能和最新控制台软件中的宏功能用于处理实时fMRI数据。宏功能的详细信息和说明可以从控制台软件的帮助菜单中找到。AFNI软件是一个免费软件，可以通过NIMH-AFNI网站直接下载。附上了用于在 AFNI 和控制台系统之间构建链接的相关脚本。

结果

图 3 和图 4 显示了具有电前爪刺激（3 Hz，4 s，脉冲宽度 300 us，2.5 mA）的代表性实时体素 BOLD-fMRI 时间过程和功能图。fMRI设计范式包括10次刺激前扫描，3次刺激扫描和12次刺激间扫描，总共8个时期（130次扫描）。总扫描时间为 3 分 15 秒（195 秒）。图3显示了实时采集格式中对侧FP-S1的体素时间过程（黑线），对应于块设计范式（红...

讨论

功能磁共振成像信号的实时监测有助于实验者调整动物的生理机能，以优化功能映射。清醒动物的运动伪影以及麻醉作用是介导fMRI信号变异性的主要因素，混淆了信号本身的生物学解释³¹，^32，33，^34，35，³⁶，^37，38...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14.1T Bruker MRI system	Bruker BioSpin MRI GmbH	N/A
A365 Stimulus Isolator	World Precision Instruments	N/A
AcqKnowledge Software	Biopac	RRID:SCR_014279, http://www.biopac.com/product/acqknowledge-software/
AFNI	Cox, 1996	RRID:SCR_005927, http://afni.nimh.nih.gov
CO2SMO (ETCO2/SpO2 Monitor), Model 7100	Novametrix Medical Systems Inc	N/A
Isoflurane	CP-Pharma	Cat# 1214
Master-9	A.M.P.I	N/A
Nanoliter Injector	World Precision Instruments	Cat# NANOFIL
Pancuronium Bromide	Inresa Arzneimittel	Cat# 34409.00.00
ParaVision 6	Bruker BioSpin MRI GmbH	RRID:SCR_001964
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	Cat# 10010-023
Rat: Sprague Dawley rat	Charles River Laboratories	Crl:CD(SD)
SAR-830/AP Ventilator	CWE	N/A
α-chloralose	Sigma-Aldrich	Cat# C0128-25G;RRID