Mapeamento cerebral por fMRI em tempo real em animais

Resumo

O mapeamento funcional do cérebro animal pode se beneficiar da configuração experimental de ressonância magnética funcional (fMRI) em tempo real. Usando o mais recente software implementado no sistema de ressonância magnética animal, estabelecemos uma plataforma de monitoramento em tempo real para fMRI de pequenos animais.

Resumo

As respostas dinâmicas de fMRI variam em grande parte de acordo com as condições fisiológicas dos animais, sob anestesia ou em estados acordados. Desenvolvemos uma plataforma de fMRI em tempo real para orientar os experimentadores a monitorar as respostas de fMRI instantaneamente durante a aquisição, que pode ser usada para modificar a fisiologia de animais para alcançar as respostas hemodinâmicas desejadas em cérebros de animais. A configuração de fMRI em tempo real é baseada em um sistema de ressonância magnética pré-clínica de 14,1T, permitindo o mapeamento em tempo real das respostas dinâmicas de fMRI no córtex somatossensorial primário da pata dianteira (FP-S1) de ratos anestesiados. Em vez de uma análise retrospectiva para investigar fontes de confusão que levam à variabilidade dos sinais de fMRI, a plataforma de fMRI em tempo real fornece um esquema mais eficaz para identificar respostas dinâmicas de fMRI usando macrofunções personalizadas e um software comum de análise de neuroimagem no sistema de ressonância magnética. Além disso, fornece viabilidade imediata de solução de problemas e um paradigma de estimulação de biofeedback em tempo real para estudos funcionais cerebrais em animais.

Introdução

A Ressonância Magnética Funcional (RMf) é um método não invasivo para medir as respostas hemodinâmicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9, por exemplo, dependentes do nível de oxigênio no sangue (BOLD), volume sanguíneo cerebral e sinal de fluxo^, associados à atividade neural no cérebro. Em estudos com animais, os sinais hemodinâmicos podem ser afetados pela anestesia¹⁰, pelo nível de estresse de animais acordados 11, bem como pelos potenciais artefatos não fisiológicos, por exemplo, pulsação cardíaca e movimentos respiratórios^12,13,14,15. Embora muitos métodos de pós-processamento tenham sido desenvolvidos para fornecer uma análise retrospectiva do sinal de fMRI para a dinâmica funcional relacionada à tarefa e ao estado de repouso e mapeamento de conectividade^16,17,18,19, existem poucas técnicas para fornecer uma solução de mapeamento da função cerebral em tempo real e leituras instantâneas no cérebro animal 20 (a maioria das quais é usada principalmente para mapeamento cerebral humano^21, 22,23,24,25,26,27). Em particular, esse tipo de método de mapeamento de fMRI em tempo real está faltando em estudos com animais. É necessário criar uma plataforma de fMRI para permitir a investigação de estágios fisiológicos dependentes do estado cerebral em tempo real e fornecer paradigma de estimulação de biofeedback em tempo real para estudos funcionais do cérebro animal.

No presente trabalho, ilustramos uma configuração experimental de fMRI em tempo real com as macrofunções personalizadas do software de console de ressonância magnética, demonstrando o monitoramento em tempo real das respostas evocadas de BOLD-fMRI no córtex somatossensorial primário da pata dianteira (FP-S1) dos ratos anestesiados. Essa configuração em tempo real permite a visualização da ativação cerebral em curso em mapas funcionais, bem como cursos de tempo individuais de forma voxel-wise, utilizando o software de análise de neuroimagem existente, Analysis of Functional NeuroImages (AFNI)²⁸. A preparação da configuração experimental de fMRI em tempo real para o estudo em animais é descrita no protocolo. Além da configuração animal, fornecemos procedimentos detalhados para configurar a visualização e análise dos sinais de fMRI em tempo real usando o software de console mais recente em paralelo com os scripts de processamento de imagem. Em resumo, a configuração de fMRI em tempo real proposta para estudos em animais é uma ferramenta poderosa para monitorar os sinais dinâmicos de fMRI no cérebro animal usando o sistema de console de ressonância magnética.

Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal (TierSchG) e a Portaria de Animais de Laboratório de Bem-Estar Animal (TierSchVersV). O protocolo experimental aqui descrito foi revisado pela comissão de ética (§15 TierSchG) e aprovado pela autoridade estadual (Regierungspräsidium, Tübingen, Baden-Württemberg, Alemanha).

1. Preparação da instalação experimental BOLD-fMRI para estudos em pequenos animais

1. Ligue o software do console para controlar os parâmetros de imagem e adquirir dados de ressonância magnética.
   NOTA: A configuração de fMRI em tempo real proposta é implementada utilizando macrofunções do software do console (versão 6) em paralelo com as funções de processamento de imagem do AFNI.
2. Encontre sequências de RM (ou seja, Posição, Localizador, Aquisição Rápida com Aprimoramento de Relaxamento (RARE) e Imagem ecoplanar 3D (EPI) com o explorador de espaço de trabalho e, em seguida, arraste-as e anexe-as na lista de varredura.
   NOTA: As sequências de posição e localizador são usadas para identificar uma região de interesse (ROI) em um cérebro. Uma sequência RARE é usada para uma varredura de anatomia. Uma sequência EPI 3D é usada para medir respostas BOLD dinâmicas.
3. Coloque os scripts de macro predefinidos, "Setup_rt3DEPI" e "Feed2AFNI_rt3DEPI" no caminho do script de macro (por exemplo, "/opt/(versão PV)/prog/curdir/(nome de usuário)/ParaVision/macros"). Ative as opções de reconstrução de EPI 3D, "Pre Image Series Activities" e "Execute Macro" no menu de interface do usuário "Data Reconstruction" e, em seguida, vincule o script de macro predefinido, "Setup_rt3DEPI", antes de clicar no botão "Scan".
   Observação : os scripts de macro estão incluídos nos arquivos suplementares.
4. Instale o software AFNI para a análise e visualização BOLD-fMRI em tempo real.

2. Cirurgia de cateterismo e ventilação

1. Instalar um ventilador e sistemas de monitoramento do estado fisiológico, como termômetro, registro da pressão arterial e da respiração, conforme mostrado na Figura 1. Defina uma frequência constante de 60 ± 1 respiração/min com o ventilador e uma temperatura de 37 °C usando uma almofada de aquecimento compatível com RM com um conjunto de controle de feedback.
2. Anestesiar um rato Sprague-Dawley macho adulto (300-600 g) em uma câmara com isoflurano a 5% para indução e fornecer 2-2,5% de isoflurano para cirurgia a partir de um vaporizador. Verifique a profundidade da anestesia apertando a pata traseira e confirmando a falta de uma resposta de abstinência.
3. Intubar o animal com cânula plástica de 14 G para ventilação (60 ± 1 respiração/min com uma mistura de 70% de ar e 30% de oxigênio). Ajustar o dióxido de carbono da maré final (CO₂) para estar na faixa de 25 ± 5 mmHg²⁹.
   NOTA: A intubação é fundamental para manter os níveis adequados de CO₂ através de experimentos de fMRI.
4. Coloque o animal em decúbito dorsal sobre uma mesa de cirurgia e raspe a coxa com uma navalha elétrica. E então, faça uma incisão na pele raspada com tesoura cirúrgica.
   NOTA: O comprimento da incisão é de cerca de 1-2 cm em uma direção longitudinal.
5. Encontre uma artéria e veia femoral sob a região incisada para cateterismo e separe a artéria e a veia femoral individuais dos tecidos circundantes.
6. Prenda um lado da artéria femoral separada com uma sutura cirúrgica e segure o outro lado com pinça micro buldogue. Em seguida, faça uma pequena incisão entre as regiões amarradas na artéria femoral.
7. Insira um cateter na artéria femoral através da pequena incisão e amarre o cateter e a artéria juntamente com suturas cirúrgicas. Monitore a pressão arterial constantemente com o sistema de monitoramento fisiológico para estar na faixa de 80-120 mmHg e meça a gasometria arterial regularmente para manter o pO 2 de mínimo 90 mmHg e pCO₂ de 30-45 mmHg durante a varredura.
   NOTA: Este cateterismo é fundamental para o monitoramento da pressão arterial durante experimentos de fMRI.
8. Prender ambas as extremidades da veia femoral com suturas cirúrgicas trançadas de seda. Em seguida, faça uma pequena incisão entre as regiões amarradas na veia femoral. Use fórceps para realizar a sutura.
   NOTA: O tamanho da sutura é de cerca de 1-2 cm.
9. Insira um cateter na veia femoral. Amarre o cateter e a veia juntamente com suturas cirúrgicas.
   NOTA: Este cateterismo é fundamental para administrar alfa-cloralose através da veia e ajustar os níveis anestésicos durante experimentos de fMRI. Se o animal não estiver bem anestesiado, ele começará a respirar espontaneamente. Neste caso, mais alfa-cloralose deve ser administrada para evitar artefatos de movimento respiratório.
10. Suture a incisão cirúrgica na pele raspada. Uma vez concluídos os procedimentos cirúrgicos, manter o animal anestesiado por infusão de um bolo de alfa-cloralose com a dosagem de ~80 mg/kg através do cateter conectado à veia femoral e interromper a administração de isoflurano ao mesmo tempo.

3. Colocar o animal dentro do scanner de ressonância magnética

1. Transfira o animal anestesiado para o scanner de ressonância magnética assim que o passo 2.10 for feito e prenda-o em um berço personalizado.
2. Insira um termômetro retal de feedback em tempo real no animal para monitorar a temperatura do animal. Coloque uma almofada de aquecimento sob o tronco do animal para controlar a temperatura. Mantenha a temperatura corporal em 37,0 ± 0,5 °C durante exames de ressonância magnética.
3. Administrar alfa-cloralose com ~25 mg/kg/h de solução numa mistura de pancurónio (~2 mg/kg/h), um relaxante muscular, mantendo o animal anestesiado e reduzindo os artefactos de movimento nas imagens de fMRI. Monitore a pressão arterial e a respiração, ajustando a quantidade de droga e a taxa de ventilação de acordo com o estado fisiológico.
4. Administrar pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secura durante os experimentos de fMRI. Fixe a cabeça do animal com segurança com duas barras auriculares para evitar artefatos de movimento da cabeça.
5. Fixe uma bobina de superfície do transceptor na cabeça. Sintonize e combine a bobina com a frequência Larmor (por exemplo, 599 MHz em 14,1 T) na cabeça antes das medições de ressonância magnética.
   NOTA: Aqui, a bobina de 22 mm de diâmetro é usada para cobrir todo o cérebro de um rato.
6. Insira um par de eletrodos de agulha na pele da pata dianteira entre os dígitos 1 e 4 e fixe-os com fita cirúrgica. E, em seguida, confirme se a estimulação funciona corretamente depois de conectar um cabo de entrada de estimulação a esses eletrodos³⁰.
7. Insira o animal no furo da ressonância magnética e coloque-o no isocentro aproximadamente.

4. Medição de imagens anatômicas de RM

1. Clique no botão do menu de calibração na interface do usuário principal. Execute as calibrações do sistema de ressonância magnética clicando nos seguintes itens na interface do usuário da Plataforma de Ajuste (consulte o menu Ajuda no software do console): Encontre a frequência básica de ressonância, Calibre a potência de pulso de RF, Defina o ganho ideal do receptor, Meça o mapa B0 no animal para emenda, Execute calços lineares globais com base na integral de decaimento de indução livre (FID) não localizado.
   NOTA: Este passo demora menos de 2 minutos.
2. Execute uma sequência de Posição clicando no botão "Scan" para encontrar a localização da cabeça do animal dentro do furo da ressonância magnética. Se a cabeça não estiver localizada no isocentro, ajuste a localização da cabeça enquanto move o berço para frente e para trás até que a cabeça esteja localizada no isocentro.
3. Execute uma sequência do localizador clicando no botão "Scan" para identificar um ROI na cabeça. Selecione Map Shim e defina o ROI do volume do shim para cobrir todo o cérebro na imagem do localizador e, em seguida, execute um shimming de ordem alta (por exemplo, 2ª ou^3ª ordem) usando a opção "Shim to" para reduzir as principais não homogeneidades do campo magnético (B0) no ROI.
   NOTA: O deslizamento de alta ordem é uma etapa crítica para melhorar a qualidade dos dados BOLD-fMRI quando as sequências EPI são usadas.
4. Execute uma sequência RARE ponderada em T2 clicando no botão "Scan" para adquirir imagens anatômicas cobrindo todo o cérebro em uma visão coronal (por exemplo, os seguintes parâmetros de sequência são usados: tempo de repetição (TR) 4000 ms, tempo de eco efetivo (TE) 36,1 ms, matriz 128 x 128, campo de visão (FOV) 19,2x19,2 mm², número de fatias 32, espessura da fatia 0,3 mm, Fator RARE 8).
   NOTA: Na seguinte etapa de visualização de fMRI em tempo real, as imagens anatômicas são usadas para registrar imagens EPI 3D como um modelo.

5. Configuração do software de fMRI em tempo real e visualização da resposta de fMRI

1. Abra uma janela de terminal e vá para o caminho do plugin AFNI em tempo real usando o seguinte comando:
   cd /home/(nome de usuário)/rt_afni
   NOTA: O script do plug-in AFNI, "afni_rt" está incluído nos arquivos suplementares.
2. Execute o software AFNI com o plugin em tempo real usando o comando e as opções abaixo.
   afni -rt
   -yestplugouts
   -DAFNI_REALTIME_MP_HOST_PORT=localhost:(número da porta)
   -DAFNI_REALTIME_Graph=Tempo real
   -DAFNI_FIM_IDEAL=(Paradigma)
   NOTA: No primeiro caso, o código permite que programas externos troquem dados com AFNI, enquanto no segundo caso o plug-in em tempo real tentará abrir um soquete TCP para o localhost e a porta definidos pelo usuário. No terceiro e quarto casos, os códigos plotarão o curso temporal dos dados de fMRI em tempo real e plotarão o curso de tempo do paradigma definido pelo usuário no curso de tempo de fMRI, respectivamente, quando os dados de fMRI em tempo real forem adquiridos. Para mais detalhes, consulte https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/README.environment.html.
3. Monitore os próximos arquivos AFNI BRIK definidos usando o comando "Dimon", como mostra a Figura 2 , com as seguintes opções:
   Dimon -tr (TR de EPI) -nt (NRepetições de EPI)
   -rt -sair
   -infile_pattern em tempo real*. BRIK
   -AFNI file_type
   NOTA: "Dimon" é um comando para monitorar a aquisição em tempo real de arquivos de imagem AFNI usando as seguintes opções: "-rt" que executa o plugin em tempo real e "-infile_pattern (nome dos dados). BRIK -file_type AFNI", que permite ao plugin ler os arquivos BRIK específicos e enviá-los para AFNI para exibição e formatação. Para mais detalhes, consulte https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/Dimon.html.
4. Use o comando "pvcmd" com as seguintes opções:
   pvcmd -a JMacroManager JMMExecuteMacro -category $USER -macro Feed2AFNI_rt3DEPI
   Observação : esse código existe no script de macro, "Setup_rt3DEPI", para executar o script de macro em segundo plano, "Feed2AFNI_rt3DEPI", logo após clicar no botão "Scan" para aquisição de EPI.
5. Use o comando "exec pvcmd" com as seguintes opções para obter parâmetros de aquisição de EPI.
   exec pvcmd -a ParxServer -r ParamGetValue -psid $ParSpaceId -param (parâmetros PVM de EPI) -id 10 -args $AcqKey $ParSpaceId $ProcnoPath
6. Use o comando "exec to3d" com as seguintes opções para converter dados brutos EPI em arquivos AFNI em tempo real no script de macro em segundo plano, "Feed2AFNI_rt3DEPI".
   exec to3d -omri -xFOV $FOV_X -yFOV $FOV_Y -zFOV $FOV_Z -prefixo $LastVolName $ImgFormat$Path2dseq
7. Certifique-se de que as informações geométricas do EPI sejam consistentes com a orientação da anatomia.
   NOTA: O comando AFNI "to3d" será executado automaticamente com as informações geométricas, como o campo de visão (FOV) e o tamanho da matriz, para converter os dados brutos da fMRI em um dado AFNI BRIK sempre que cada dado de volume 3D for armazenado após cada TR, conforme mostrado na Figura 2. A orientação da imagem pode ser alterada com os parâmetros de informação geométrica de "to3d". Para mais detalhes, consulte https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/to3d.html.
8. Ligue um isolador de estímulo elétrico e realize estimulação elétrica da pata dianteira para um estudo de fMRI evocado (por exemplo, 3Hz, largura de pulso 4s 300us, 2,5mA) usando blocos de estimulação.
   NOTA: Aqui, o paradigma do design de blocos consiste em 10 varreduras de pré-estimulação, 3 varreduras de estimulação e 12 varreduras de interestimulação (15 varreduras por época).
9. Execute uma sequência de EPI 3D ponderada em T2* clicando no botão "Scan" para o estudo BOLD-fMRI (por exemplo, os seguintes parâmetros são usados: TR/TE 1500/14 ms, matriz 64 x 64 x 32, FOV 19,2 x 19,2 x 9,6 mm 3 e resolução 300 x 300 x 300 μm³).
   NOTA: Assim que clicar no botão "Digitalizar", o monitoramento e o processamento de dados brutos serão feitos usando os scripts de macro predefinidos em tempo real. Uma vez que um conjunto de dados AFNI BRIK é convertido, os gráficos de curso de tempo voxel para imagens EPI 3D são exibidos no software AFNI e atualizados automaticamente para cada TR.
10. Para sobrepor as imagens EPI sobre as imagens RARE anatômicas, converta as imagens RARE em um conjunto de dados AFNI BRIK usando o comando "to3d" como na etapa 5.6 e, em seguida, registre as imagens EPI nas imagens anatômicas usando o script AFNI "align_epi_anat.py" com as seguintes opções:
    align_epi_anat.py -anat anatomy_template_al+orig -epi epi.$(número de dados epi)+orig -epi_base 1 -sufixo _volreg -rat_align -custo lpa -epi2anat
    NOTA: Para obter mais detalhes, verifique https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/ align_epi_anat.py.html.
11. Para processar mapas funcionais das respostas BOLD, calcule a deconvolução do conjunto de dados 3D+time com uma série temporal de estímulo específica usando o comando "3dDeconvolve" com as seguintes opções:
    3dDeconvolve -input (nome do arquivo de entrada)+orig. -nfirst 0 -polort 3 -num_stimts 1 -stim_times 1 (nome do arquivo do paradigma de estimulação) 'BLOCK(4,1)' -stim_label 1 forepaw -tout -fout -rout
    NOTA: As etapas de processamento de imagem, como suavização espacial ou filtragem temporal, foram incorporadas em um script de processamento de dados AFNI personalizado. Para mais detalhes, consulte https://afni.nimh.nih.gov/afni/doc/help/3dDeconvolve.html.
12. Para visualizar mapas funcionais dos sinais BOLD, use um clustering interativo no software AFNI. Abra a opção "Definir sobreposição" e use a função "Clusters" no menu da interface do usuário AFNI.
13. Após a última ressonância magnética funcional, retire o animal do scanner de ressonância magnética e eutanasie-o de acordo com os protocolos aprovados.
    NOTA: As funções de processamento de imagem do AFNI e as funções de macro no software de console mais recente foram usadas para processar os dados de fMRI em tempo real. Informações detalhadas e descrições de funções de macro podem ser encontradas no menu de ajuda no software do console. O software AFNI é um freeware, que pode ser baixado diretamente através do site NIMH-AFNI. Os scripts relacionados para construir a ligação entre o AFNI e o sistema de console são anexados.

Resultados

A Figura 3 e a Figura 4 mostram um curso de tempo representativo em tempo real do BOLD-fMRI em tempo real e mapas funcionais com estimulação elétrica da pata dianteira (3 Hz, 4 s, largura de pulso 300 us, 2,5 mA). O paradigma de design da fMRI compreende 10 exames de pré-estimulação, 3 exames de estimulação e 12 exames de interestimulação com um total de 8 épocas (130 exames). O tempo total de varredura é de 3 min 15 seg (195 seg).

Discussão

O monitoramento em tempo real do sinal de fMRI ajuda os experimentadores a ajustar a fisiologia dos animais para otimizar o mapeamento funcional. Artefatos de movimento em animais acordados, bem como o efeito anestésico, são os principais fatores que medeiam a variabilidade dos sinais de fMRI, confundindo a interpretação biológica do sinal por si só 31,32,33,34,35,36,37,38

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14.1T Bruker MRI system	Bruker BioSpin MRI GmbH	N/A
A365 Stimulus Isolator	World Precision Instruments	N/A
AcqKnowledge Software	Biopac	RRID:SCR_014279, http://www.biopac.com/product/acqknowledge-software/
AFNI	Cox, 1996	RRID:SCR_005927, http://afni.nimh.nih.gov
CO2SMO (ETCO2/SpO2 Monitor), Model 7100	Novametrix Medical Systems Inc	N/A
Isoflurane	CP-Pharma	Cat# 1214
Master-9	A.M.P.I	N/A
Nanoliter Injector	World Precision Instruments	Cat# NANOFIL
Pancuronium Bromide	Inresa Arzneimittel	Cat# 34409.00.00
ParaVision 6	Bruker BioSpin MRI GmbH	RRID:SCR_001964
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	Cat# 10010-023
Rat: Sprague Dawley rat	Charles River Laboratories	Crl:CD(SD)
SAR-830/AP Ventilator	CWE	N/A
α-chloralose	Sigma-Aldrich	Cat# C0128-25G;RRID