大鼠骨髓骨髓的隔离和培养

摘要

本文提出了一种结合整个骨髓粘附性和流动细胞测量分拣的方法，用于从大鼠的骨髓中分离、培养、分拣和识别骨髓中甲基干细胞。

摘要

在这里，我们提出了一种有效的方法，在体外分离和培养男性骨髓骨髓中性干细胞（mBMSC），以迅速获得许多高质量的细胞的实验要求。mBMSC由于具有出色的自我更新能力和多系分化潜力，将来可广泛应用于组织工程细胞的治疗应用，以防颅面疾病和颅面再生。因此，大量获取 MBMSC 非常重要。

在这项研究中，骨髓从可溶性中冲洗，通过整个骨髓粘附培养分离出原发性mBMSC。此外，CD29⁺CD90⁺CD45⁻ mBMSC 通过荧光电池分类进行了纯化。第二代纯化mBMSC用于进一步研究，并显示出区分成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的潜力。利用这种体外模型，可以获得大量的增殖MBMSC，从而有助于研究MBMSC的生物特征、对微环境的后续反应以及其他应用。

引言

骨髓间质干细胞（BMSCs）是来自骨髓的非造血干细胞，具有很强的增殖能力和多系分化潜力^。事实上，自发现以来，BMSC一直被认为是骨组织工程和再生的理想候选者。多年来，头骨和股骨等骨骼或长骨一直是BMSC颅面再生的最常见来源。然而，或社会BMSC，如曼迪布细胞BMSC（MBMSC），显示与长骨BMSC的一些差异，如不同的胚胎起源和发展模式。可溶性产生于神经结肠细胞的神经顶细胞，并经历膜内骨化，而轴向和近视骨骼则来自中皮，并经历内皮骨化。此外，临床观察和实验动物研究一直表明，5^{号、6号、7}号^、8号兽体和腹腔之间存在功能差异。报告显示，来自颅面骨（如可硬骨、最大细骨和血管骨）的BMSC比轴向骨和近足骨^骼的BMSC表现出优越的增殖、寿命和分化能力。因此，mBMSC被认为是未来颅面疾病治疗应用的首选资源，如颅骨病、下颚肿瘤、下颚骨骨骨质疏松症和牙周组织缺陷^{10、11、12。}为了了解在细胞前实验中的治疗潜力，必须建立一种在体外快速隔离和培养mBMSC的方法。

在这项研究中，目的是通过整个骨髓的粘性和流动细胞分拣获得纯化的MBMSC。通过微计算断层扫描（Micro-CT）和组织学部分清楚地观察到的可解剖形态表明，可硬骨的血管骨在切口髓空间和肺骨之间。从血管骨的骨髓被冲洗，以获得男性骨髓细胞，但以这种方式培养的细胞不是纯MBMC，并可能包括多种类型的细胞与不确定的效力和不同的血统，如细胞从骨，脂肪和内皮细胞^13，14。细胞净化的下一步尤为重要。流动细胞学通过识别细胞表面蛋白质的组合来过滤细胞，并在中性干细胞的富集中被广泛采用。细胞同质性是流动细胞学的主要优点，但这个过程不能决定细胞的生存能力，并可能导致细胞产量有限。在这项研究中，从整个骨髓粘性中获得的P0 mBMSC通过流动细胞学进行排序，以获得纯度高、增殖能力强的MBMS。

本研究引入了一个可重复和可靠的协议，用于使用整个骨髓粘性和流动细胞分拣相结合的大鼠男性BMSC的隔离、培养和分化。它是相关领域研究人员使用可靠、方便的方法。

研究方案

本论文所有动物实验程序均经上海市第九人民医院动物护理委员会、上海交通大学医学院批准。

1. 准备

1. 使用两只5周大的雄性斯普拉格道利大鼠进行实验。
2. 消毒所有仪器，包括针架、钳子和剪刀在高温下或浸入75%乙醇10分钟。
   注意:乙醇浸入不应太长，以避免细胞损伤。
3. 事先准备文化媒体，其组成在 表1中提供。补充下文所述的每个介质。
   1. 准备α-MEM培养介质（含10%FBS）:补充最低基本中等α（α-MEM）与10%胎儿牛血清和1%青霉素和链霉素。
   2. 骨质分化介质的制备:补充骨质分化基础介质，10%胎儿牛血清，1%谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素，0.20%抗皮质酸，1%β甘油磷酸盐和0.01%脱氧酮。
   3. 骨质诱导介质的制备:混合 70% α-MEM 培养介质（10% FBS）和 30% 骨质分化介质。
   4. 制备脂肪分化介质A:补充脂肪分化基础介质，10%胎儿牛血清，1%谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素，0.20%胰岛素，0.10%IBMX，0.10%罗西格利塔酮和0.01%德西美酮。
   5. 制备脂肪分化介质 B:补充脂肪分化基础介质，含10%胎儿牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和0.20%胰岛素。
   6. 制备致胆分化介质:补充致胆分化基底介质，含0.01%德萨美松、0.30%抗酸、1%ITS、0.10%丙酸钠、0.10%蛋白酶和1%TGF-β3。
      注意:骨质分化介质必须在配置后一个月内用完。配置的软骨分化介质的有效周期为 12 h。

2. 大鼠MBMSC的隔离和栽培

注:所有实验操作应尽可能在冰上进行，以保持细胞的生存能力。

1. 收获老鼠可食用物
   1. 通过_二氧化碳 窒息对两只5周大的雄性斯普拉格·道利大鼠实施安乐死。在进行实验之前，确保动物的呼吸停止。
   2. 在含有75%乙醇的烧瓶中冲洗这些老鼠3分钟。
   3. 将老鼠放在一个干净的烟罩里，以收获可食用的。
      注意:使用前通过紫外线辐射对烟罩消毒30分钟。
   4. 将鼠放在一个苏平的位置。将皮肤和布奇纳托肌肉从双边角臂或角肌结合到可切割物的后部区域，这是唯一具有较低切口的可移动骨骼。
      注意:建议在角角的每一侧切口2厘米，以获得一个清晰的操作场。
   5. 用两个大拇指将最大细管和下垂切口向相反的方向向前推开大鼠的嘴，以露出附着在可操纵的齿上的下垂牙齿。
   6. 完全断开胸肌和肌腱连接到线骨和下部边界的可操纵。
      注意:由于缺乏肌肉张力，在此步骤中观察到可操纵性增强。
   7. 按下下下角的齿，向后旋转，直到两侧的圆锥体明显暴露。
      注意:此步骤是为了人为地打开大鼠的嘴，尽可能使宽体脱位。可操纵物通过双面圆锥体与头骨相连，因此孔迪的暴露导致头骨和可操纵性之间的脱节。
   8. 将可操纵的身体与头骨分开。
   9. 使用湿纱布清洁骨表面的粘附软组织。
   10. 将骨骼放在一个10厘米的无菌玻璃盘中，里面装满了预冷的最小基本中α（α-MEM）或磷酸盐缓冲盐水（PBS），以保持生存能力。
2. MBMS 的隔离和培养
   1. 沿着第一个摩尔的中缘从曼迪布勒身体切断前骨。沿着第三摩尔的解剖边缘取出包括共生体和康赛尔在内的曼迪布拉拉穆斯，以暴露骨髓腔。
   2. 用 10 毫升的α-MEM（10% FBS）填充 10 厘米无菌玻璃盘。
   3. 使用 1 mL 注射器吸气α-MEM 培养介质。将注射针插入骨髓腔，反复将骨髓冲入盘中。分别从骨的中度和解剖面冲洗骨腔至少3次，直到骨变白。
      注:这是最关键的一步，因为大鼠的骨髓腔不像长骨那么明显，插入针头的正确点需要经验确定。以上所有实验样品应储存在冰上，以保持细胞的生存能力，因此操作时间不得超过2小时。
   4. 将含有冲洗细胞的介质转移到 15 mL 离心管和离心机中，在 4 °C 中以 800 x g 的速度传输 5 分钟。丢弃超自然人。
   5. 用3毫升的α-MEM（10%FBS）来补充细胞。将细胞板入新的 10 厘米培养皿中，并在 5% CO₂ 孵化器中以 37 °C 孵化。
   6. 在培养的第三天检查这些细胞的形态变化和生长。用不相干的细胞和组织片段去除培养介质。轻轻添加10毫升的新鲜α-MEM（带10%FBS）。
   7. 经过7天的培养，P0 mBMSC达到70%至80%的交汇点。
3. 流单元分拣
   注:P0 mBMSC 通过流细胞分类进行表型识别和主要纯化。
   1. 吸气并丢弃培养介质，然后用 PBS 清洗盘子。丢弃PBS。
   2. 加入 1 mL 的 0.25% 三氯辛与 0.02% EDTA 在菜中。在37°C下消化细胞5分钟，然后加入2毫升的α-MEM（10%FBS）来停止反应。
   3. 将细胞悬浮液转移到 15 mL 离心管和离心机中，800 x g 5 分钟。
   4. 离心后，将细胞在 120μL 的 PBS（10% FBS）中重新供用。
   5. 在 4 °C 下用 1μL 抗体阻断这些细胞悬架，以 15 分钟的速度对抗 CD16/CD32。
   6. 将细胞悬浮液的 100 μL 传输到新的微中微富管中， 在黑暗的^13、15中，用植物红素（PE）结合抗体对CD45、氟辛-异氰酸酯（FITC）-共聚抗体对CD90和阿洛菲科恰宁（APC）-抗体对CD29的抗体在4°C上对CD29进行污渍，在^13、15的黑暗中持续1小时。本实验中使用的抗体浓度显示在表2中。将细胞悬浮的其他 20 μL 用作未染色的负控制。
   7. 然后以 800 x g 的速度将管子离心 5 分钟，丢弃悬架，并在 0.5 mL PBS（10% FBS）中重新注入细胞。
   8. 在分析前 10 分钟添加 10 微升 0.01 毫克/mL DAPI。
   9. 使用放置在离心管上的 40 纳米滤镜来过滤细胞。
   10. 分析荧光激活细胞排序器上的细胞。将面板设置如下。首先，通过在选定的细胞中作为目标 MBMSC，将 DAPI^（细胞，然后门 CD29⁺CD90⁺CD45） 从总细胞计数中去除死细胞。
   11. 将排序的 CD29⁺CD90⁺CD45^- 将电池放入 15 mL 离心机管中，预制 3 mL 的α-MEM（FBS 为 10%）。
   12. 以800 x g 的离心管5分钟。取出收集缓冲，并添加 1 mL 的新鲜α-MEM（带 10% FBS）以补充细胞。然后用6厘米的文化菜盘。

3. 殖民地形成能力

注:执行此步骤是为了检查 MBMSC 的划分能力。¹⁵

1. 为此实验选择第二通道 mBMSC （P2）。当细胞汇合达到80%至90%时，在6个井板中连续梯度地重新给细胞进行种子，以评估其克隆增殖能力。
   注意:建议将梯度从每口井1×10² 到^{1×10 3} 细胞设置，但人类或动物起源的不同细胞系的最终稀释是经验确定的。
2. 培养α-MEM中的细胞（FBS为10%）大约两周，直到在光显微镜下可以看到大量的菌落形成单元。每 3 天刷新一次文化介质。
3. 吸气并丢弃培养介质，每次用 PBS 洗两次油井 5 分钟。接下来，为每口井添加4%的甲醛溶液，并修复至少10分钟。
4. 去除甲醛，用PBS冲洗两次井。
5. 用水晶紫罗兰色溶液染色细胞，在37°C中孵育约10分钟。
   注意:染色时间适当调整，直到达到所需的阴影。
6. 取出染色溶液，用蒸馏水清洗样品，以阻止反应。
7. 立体显微镜下的图像，并计算由至少50个细胞组成的分散细胞群落。

4. MBMSC 的多线分化

注:P2 mBMSC 用于后续实验，除非另有说明。

1. mBMSC 的骨源诱导
   1. 摘要上述 mBMSC。种子细胞的密度为2.5 x 10^5/cm2在12井板补充1 mL α-MEM（10%FBS）。
   2. 当细胞汇合达到60-70%时，将介质更改为30%的骨感应介质。培养具有α-MEM（10%FBS）作为负控的细胞，每 2 天更换一次介质。
      注:在骨质疏松期间出现大量钙结核后，建议每2天将中等交换模式改为半体积中等交换，以防止骨细胞漂浮。
   3. 经过7天的培养，评估这些细胞的钙化通过碱性磷酸污渍^16，17。
   4. 取出培养介质，用4%的副甲醛固定细胞10分钟。使用每口井1mL PBS冲洗细胞3分钟两次。
   5. 然后用碱性磷酸盐染色液染色细胞，在37°C孵育10-30分钟。
      注:可以在室温下进行夜间孵化，以获得所需的颜色。
   6. 用蒸馏水清洗水井，以阻止反应。在光显微镜下拍照。红色色素颗粒代表碱性磷酸酶 （ALP） 活性。
   7. 在再培养剩余的细胞7天后，进行阿利扎林红色染色，以评估细胞的矿化能力。
   8. 在细胞固定10分钟^16，18分钟后，用0.5%的阿利扎林红色染色溶液染色细胞。3-5分钟后停止蒸馏水的染色反应。
      注意:反应时间可以根据开发的颜色延长。
   9. 最后，将培养板放在光显微镜下观察骨质污渍的作用:红色结核表示这些细胞的钙沉积。
2. mBMSC 的辅助诱导
   1. 种子 P2 mBMSC 在 12 井板如上所述。
   2. 井成为90%的汇合物后，培养具有脂肪分化介质A的细胞，使用在α-MEM培养介质培养的细胞（10%FBS）作为负控制。
   3. 上岗2天后，从井中吸气介质A，并在每口井中加入1mL的增生分化介质B。
   4. 一天后，取出中B，然后用中等A重新加入井中重新开始循环。培养细胞交替使用中等A和B。
   5. 将分化介质A和B交替应用三个周期，通过油红色O染色^16、18检测这些细胞的脂肪生成。
      注意:通过用分化介质B培养这些细胞，可以观察到大量的圆形和大脂质液滴，再延长2至3天。
   6. 取出介质，用4%的副甲醛固定细胞10分钟。用 PBS 洗掉细胞。
   7. 用油红色 O 染色溶液染色细胞，在 37 °C 孵育约 3 分钟。
   8. 取出染色溶液，用蒸馏水清洗井。
   9. 在光显微镜下观察脂肪生成。
3. MBMS 的琼德罗根西斯诱导
   1. 种子P2 mBMSC在15mL离心管的密度为5×10^5/厘米^2。
   2. 将管子在300 x g 下离心5分钟。丢弃超自然人。
   3. 用0.5 mL的软骨分化介质补充细胞。以300 x g 的离心力将细胞分化5分钟。
   4. 松开离心管的盖子，在 5% 的 CO₂ 孵化器中以 37 °C 孵育。每 2 天更新一次介质。
      注:细胞在24小时后开始打动。建议不要将离心机管移动 48 小时。改变介质时，要小心不要吸气细胞颗粒。
   5. 在21天的感应后，用4%的甲醛固定细胞颗粒，然后脱水、石蜡嵌入和分割。
   6. 去水化和水化后，用阿尔西亚蓝色溶液将滑梯染色至少15分钟18、19、20、21，然后用蒸馏水清洗以阻止反应。在光显微镜下拍摄照片。
   7. 对于胶原蛋白 II 型的免疫荧光染色，执行以下步骤。
      1. 脱水和水化步骤后，在 37 °C 时用 5μg/mL 蛋白酶 K 孵化幻灯片 15 分钟。
      2. 在 37 °C 时将幻灯片孵化在阻塞缓冲区中 1 小时。
      3. 在 200 μL 阻塞缓冲器中应用 1μL 胶原蛋白 II 型抗体，并在 4 °C 下过夜孵化。
      4. 第二天，用PBS洗两次幻灯片，在37°C下用二次抗体孵育1小时。
      5. 用 40，6-迪亚米迪诺-2-苯林多 （DAPI） 孵化切片 10 分钟。
   8. 在荧光显微镜下拍摄每张幻灯片的照片。

5. 实时 PCR

1. 使用基于商业可用试剂的异氰酸钛从 mBMSCs 中提取总RNA。
2. 使用市售工具包将RNA反向转录为补充性DNA。反向转录的反应条件如下:5 分钟 65 °C，15 分钟 37 °C，15 秒 85 °C。
3. 使用 表 3 中列出的引物执行实时 PCR 以检测骨质生成和脂肪生成特定基因。PCR 放大过程如下: 95 °C 5 分钟 95 °C 5 秒， 60 °C 30°C 40 周期。

结果

使用此协议，在初始培养后的第三天，很大一部分细胞粘附在板上。通常，经过额外的3-4天的培养，细胞汇合达到70至80%（图1B）。通过荧光细胞分类，DAPI^-CD29⁺CD90⁺CD45⁻ mBMSC 被纯化^18，22，其中约占 81.1% 的 P0 细胞 （图 1C）.

在6口井板每口井的100个细胞上?...

讨论

该协议描述了一种通过结合整个骨髓的粘合性和荧光细胞分拣，将BMSC与体外大鼠的可支配物分离的方法，这是获得具有很强分化能力的增殖性MBMSC的简单可靠的方法。这种方法可以通过流细胞分拣初步净化mBMSC，但如果对细胞均质性有更高的要求，可能需要更精确的纯化方法。

目前，用于分离MBMSC的有四种主要技术，包括全骨髓依从性、密度梯度离心、荧光细胞分拣和磁激活?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA(1X)	Gibco	25200072
10cm culture dish	Corning
acutenaculum
Adipogenic differentiation medium	Cyagen biosciences inc.	MUBMX-90031
Alcian Blue	Beyotime Biotechnology
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Alkaline Phosphatase Color Development Kit	Beyotime Biotechnology	C3206
alpha-Minimum essential medium	GE Healthcare HyClone Cell Culture	SH30265.01B
Anti -CollagenII Rabbit pAb	Abcam	ab34712
Antibodies against CD16/CD32
Antifade Mounting Medium with DAPI	Beyotime Biotechnology	P0131
APC anti-mouse/rat CD29 Antibody	biolegend inc	102215
Biosafety cabinet	Esco	AC2-4S8-CN
CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience	Invitrogen	11-0900-85
Centrifuge	cence	L500
Chondrogenesis differentiation medium	cyagen biosciences inc.
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM880
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
Crystal Violet Staining Solution	Beyotime Biotechnology	C0121
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare HyClone Cell Culture	SH30084.03
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150077
Incubator	Esco	CCL-170B-8
Inverted microscope	olympus	CKX53
Magzol reagent(Trizol reagent)	Magen
micropipettor	Eppendorf
Oil Red O
Osteogenic differentiation medium	cyagen biosciences inc.	MUBMX-90021
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate-buffered saline(1X)	Gibco	20012027
PrimeScript RT Master Kit	TakaRa Bio Inc	RR036A
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
QuickBlock Blocking Buffer	Beyotime Biotechnology	P0260
scissor
SYBR1 Premix	TakaRa Bio Inc
Toluidine Blue	Beyotime Biotechnology
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061