使用24小时器官保存和连续遥测的猪模型中正交肾自动移植

摘要

大型动物模型在临床前移植研究中起着至关重要的作用。由于其与临床设置的相似性，本文中描述的正畸肾自动移植的猪模型为器官保存技术和治疗干预的测试提供了极好的体内设置。

摘要

在目前器官移植严重短缺的时代，采用各种策略扩大肾移植的可用同种移植体（KT）池。尽管使用扩展标准捐赠者（ECD）的异体可以部分缓解器官捐献者短缺，但ECD器官的低级结果和术后并发症的风险可能更高。动态器官保存技术、缺血-再灌注和保存损伤的调制，以及全息疗法，在提高KT的表粒利用率和患者结果方面，都成为科学界关注的焦点。

临床前动物实验在转化研究中起着至关重要的作用，特别是在医疗器械和药物开发方面。猪正畸自移植模型与活体或小动物研究的主要优势在于手术解剖和生理相似性，临床环境。这允许研究新的治疗方法和技术，并确保促进临床翻译的发现。该协议利用24小时的保存时间和遥测监测，对猪正畸肾自动移植模型提供了全面、面向问题的描述。先进的手术技术与高度标准化和最先进的麻醉方法、动物外壳、周等随从随从和监测相结合，确保了该模型的可重复性和成功性。

引言

自1954年由诺贝尔奖获得者外科医生约瑟夫·默里1号开创性小组进行的首次成功同卵双胞胎间人类肾移植^以来，肾移植（KT）已成为治疗最终期肾病（ESRD）2的主要^支柱。与透析2相比，KT显示出优越的长期临床结果和^生活质量。由于外科技术、器官保存、免疫抑制治疗和重症监护的进步，KT后的短期和长期存活率不断提高，因此KT在全球^{范围2、3、4}中^{得到广泛应用}。

由于严重的器官短缺，三元型供需缺口^{不断扩大。}2018年，德国约有12，031名患者在等待KT，然而，由于移植器官极度短缺，只有不到20%（2，291名患者）能够接受供体^肾脏。不幸的是，不仅器官捐献者的绝对数量，而且为移植提供的骨髓移植体的质量在过去几十年中下降了^8，9。在必须接受移植¹⁰的预损伤或"边缘"肾移植数量中观察到了增加的趋势。然而，使用ECD异种移植物可能会减少等待时间和等待名单的发病率和死亡率，这与与移植有关的并发症（如原发性移植非功能性）和/或延迟移植功能^{（DGF）8，9，10等}的发病率^增加有关。进一步的研究对于优化全血利用、扩大供体和保护和修复边际全体，最终可能改善^{患者结果3，6至关重要}。

由于大型动物移植模型的资源密集和复杂性质，大量研究是使用小动物或在活体设置11，12，13，14，15。虽然这些模型可以提供重要的科学数据，但这些发现对临床环境的转化往往是有限的。正畸肾自动移植的猪模型是一个成熟和可重复的模型，允许在临床相关的体内设置中测试新的创新治疗方法，具有潜在的更长的随检周期和重复采集样品的充分^{可能性16，17。}除了可比尺寸的优势，它允许相对直接地转换到临床设置（特别是医疗器械开发和药物剂量），手术解剖和生理相似性方面缺血-再灌注损伤（IRI）反应和肾脏损伤，支持在^{转化研究17，18，19}使用这一^模型。这种模式也为年轻的移植外科医生做好了应对临床器官移植技术挑战的极好的培训^机会。

与人的环境相比，也有多重差异，在文献^{16、17、19、20、21}中可以^发现模型^{的各种技术修改}。本文全面介绍了有关建立猪正畸肾自移植模型的技术细节、缺陷和建议。所述遥测和视频监控方法以及我们专门设计的住房设施允许对动物进行特写性严重性评估和临床观察。使用皮下尿导管和指定的猪夹克提供了在不使用代谢笼的情况下详细评估肾功能的可能性。这些技术修改被描述为潜在的解决方案，以符合现代挑战的3R原则（替换，减少和精炼），并改进动物实验使用大型动物模型²²。

研究方案

本研究是按照《到达（动物研究:在Vivvo实验中的报告）》指南^{23的原则设计的}。实验是根据机构准则和德国联邦保护动物法进行的。整个道德建议得到了主管当局的批准（政府动物护理和使用委员会，LANUV NRW - "Landesamt für Natur， Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen"，德国雷克林豪森，协议ID:81-02.04.2018.A051）。本研究中的所有动物都根据《实验室动物护理和使用指南》（NIH出版物，2011年第8版，美国）和关于保护用于科学目的的动物的第2010/63/EU指令（《欧洲联盟官方杂志》，2010年）的原则得到人道照顾。雌性德国陆地猪是从卫生优化的屏障育种设施（海因里希斯GbR，海因斯堡，诺德海因-韦斯特法伦）获得的。 图 1 描述了所述实验协议的摘要。

1. 动物和住房

1. 使用女性德国陆地鼠猪（或可比）为该协议。在第一次手术前14天（遥测植入）将动物送到研究设施进行适应，并把它们放在温度和湿度控制的屏障环境中，有12小时光和暗循环（图2）。
2. 将两个遥测接收器安装在房间的天花板上，允许将注册数据直接传输到观察室中的 PC。确保兽医官员和负责的动物看护人（每 8 小时和按需）在定期检查期间目视观察动物。
   注意:此外，在此实验中，还使用了与本地网络相连的集成热成像实时摄像机素材。本研究中使用的房屋设施详情如图2 所示。

2. 基本技术和共同程序

1. 手术前一夜禁食动物。
2. 通过初次肌肉注射阿扎佩龙（4毫克/千克）和阿托平（0.1毫克/千克）进行前一次治疗，10分钟后注射氯胺酮（15毫克/千克）。
3. 预后，称量动物，并直接从住房设施转移到中央 OR 设施麻醉准备室。
4. 使用 18 G 外周静脉导管可调节其中一个大耳静脉。通过标准的心电图和脉冲氧测量仪监测动物。
5. 用异丙酚（3毫克/千克）开始麻醉。
6. 用喉镜暴露声带，插入 7.5 mm 气管管。根据制造商的建议，袖口被空气堵住。
7. 插入胃部排水管，以去除胃中的液体和空气。
8. 通过尿道插入尿导管。
9. 随后，修剪手术切口区域的皮肤。
10. 在手术过程中涂抹眼软膏以防止角膜干燥。
11. 在奥特拉奇插管后，用异氟烷（最终呼气1.45-2.0 Vol.%）和芬太尼（3-7.5 μg/kg/h）保持麻醉。
12. 确保通过加热垫和加热空气对动物进行主动的术内温度控制。插入直肠探头以监测体温（目标温度 36.5 °C - 37.5 °C）。
13. 使用西富罗西姆（35毫克/千克，即v.）管理抗生素预防。在 4 mL/kg/h 时注入振铃器溶液，皮肤切口后增加至 8 mL/kg/h。在耳静脉接触上管理潘托拉索（40毫克，即40毫克）的预防性剂量。
14. 根据手术性抗性抗原的一般原理，在无菌条件下执行所有外科手术。用波维酮碘溶液对手术场进行消毒，并盖上手术窗帘。

3. 遥测植入

1. 按照协议第2节所述的步骤为动物进行手术准备，通过降低心率和缺乏动物的自觉运动来确认适当的麻醉。
2. 收集血液和尿液样本以确定单个基线实验室值。
3. 使用永久标记标记切口站点。
4. 要植入遥测转发器的动脉传感器，在腹股沟中执行 3-4 厘米切口。以 360° 的方式暴露和解剖动脉。
5. 使用 Overholt 夹子通过动脉下方的两容器回路拉，并使用蚊子夹固定它们。
6. 使用刀刃手术#11动脉切除术后，插入动脉传感器。使用 5-0 聚丙烯缝合线与单结缝合线关闭动脉切除术，并使用其中一种缝合线固定动脉传感器。
7. 在动物的左侧做一个3-4厘米的大切口，通过钝解剖为转发器创建一个皮下袋。
8. 将遥测转发器隧道到侧翼，并固定到肌肉筋膜（3-0 聚丙烯，单结）。将红色和白色的心电图电极穿过胸部的右侧和左侧。做两个1厘米的切口，并固定肌肉组织中的电极，以确保一个良好的心电图信号与单结缝合（3-0多糖蛋白）。
9. 开始注册遥测数据并检查各种信号（例如，转发器体本身登记的体温、动脉血压和心电图信号）。
10. 使用肌肉和皮下缝合（3-0聚乳胶），关闭腹股沟、左侧侧翼和两个小胸片切口，并使用不可吸收的单丝缝合线（例如，2-0 Prolene）关闭皮肤。
11. 使用喷雾膜敷料密封切口部位。
12. 此时点准备动物穿指定的猪夹克，动物穿在研究期的其余部分。每次手术后，用干净的夹克代替夹克。
    注:要记录稳定的基线数据，遥测转发器在索引手术前14天植入（左肾切除术，另请参阅 讨论）。

4. 肾切除术和肾移植物检索

1. 按照第 2 节中描述的程序为动物进行移植取回手术做好准备。
2. 麻醉后，可以调节外静脉。在手术场进行无菌消毒后，在壶槽右侧进行了 4 厘米切口。
3. 解剖皮下组织和肌肉，以暴露外部血管。
4. 以 360° 的方式暴露和解剖静脉。
5. 使用 Overholt 夹子通过静脉下方的两容器回路拉，并使用蚊子夹固定它们。
6. 将导管挖到动物的后面。为此，将猪放在其左侧。使用塞尔丁格方法插入导管。
7. 用 5-0 聚丙烯缝合线关闭静脉上的开口并固定导管。
8. 将切口在两层中关闭（例如，肌肉和皮下的3-0聚甘蛋白和皮肤的2-0聚丙烯）。
9. 用多个缝合线（2-0 聚丙烯）将导管固定到皮肤上。
10. 测试血管导管，获得自由吸气和注射。随后，将静脉注射线从耳静脉管切换到中央静脉线。
11. 手术消毒和拖拉后，进行腹腔切除中位切除术以打开腹部（25-30厘米）。使用标准的腹部缩回器来暴露手术场。
12. 使用湿和温暖的腹部毛巾覆盖结肠和小肠。请第二助理将肠子保持到右半腹的正向，露出肾脏及其血管结构。
13. 使用单极烧灼、双极钳和细剪刀打开肾基层，从任何粘附组织中解剖左肾和尿道。
14. 将左尿素（3-0聚糖蛋白）分开并分割，留下至少10至12厘米长的段。
15. 分别从劣质静脉和主动脉完成左肾静脉和动脉的解剖。
    注:避免伤害和打开在这个解剖区域的大淋巴血管。还要注意从静脉卡瓦卡到接近其起源的肾静脉连接的阿齐戈-腰椎静脉的潜在损伤。
16. 在两个连体（3-0多糖蛋白）之间解剖和缝合腰椎静脉。
17. 使用一碗冰和无菌盖准备后桌解剖。
18. 要取回移植肾脏，用血管夹夹将肾动脉和肾静脉夹在主动脉和静脉膜附近。通过用靠近夹子的剪刀切割血管，然后将肾脏交给后桌团队，去除肾脏移植物。
19. 使用 5-0 聚丙烯缝合线关闭肾动脉的树桩。使用带 5-0 聚丙烯的双层连续缝合关闭肾静脉。拆下血管夹。
20. 检查区域有无出血或淋巴渗漏后，将腹部合上4层。
    注:佩里托内姆: 3-0多糖蛋白运行缝合;筋膜: 0 多糖蛋白运行缝合;皮下层:3-0多糖蛋白运行缝合;皮肤:皮肤订书机在肾脏取回手术后，方便第二天重新打开腹部和2-0聚丙烯单结缝合后，移植程序明确关闭。
21. 应用无菌伤口敷料后，将动物返回到外壳设施，并允许在气管外伤外伤后恢复。对于术后镇痛，使用丁丙诺啡（0.05 - 0.1毫克/千克）每8小时肌肉内，直到自动移植。

5. 后桌和器官保存

1. 移植后检索，立即可以使用标准的14G（橙色）外设导管，并立即可以修复肾动脉使用从3-0多糖蛋白准备的图尼克。
2. 用冷器官保鲜溶液冲洗肾脏。
3. 用500 mL的器官保鲜溶液冲洗后，取出动脉管，将肾移植物包裹在无菌器官袋中，并使用计算机控制的冷却回路，在4°C下以24小时的目标冷缺血时间（CIT）储存在器官保鲜溶液中。
   注:建议使用 500 mL 的 4 °C 法线盐水溶液进行短暂的保鲜后冲洗。

6. 对边肾切除术和正畸肾自动移植

1. 在受体手术期间，将预谋和初始麻醉适应受限制的肾脏代谢，避免使用氯胺酮。诱导使用异丙酚（3-5毫克/千克，即，米达佐兰（0，25毫克/千克，即）和阿托平（0.1毫克/千克.m.此后，术前准备与第2节所述的程序相同。
2. 用异氟烷（最终呼气1.45-2.0 Vol.%）和芬太尼（3 -7，5微克/千克/h）和异丙酚（2 -4毫克/千克/小时）保持麻醉。
3. 检查并持续监测心电图、脉搏血氧仪、直肠温度和遥测转发器的功能。
   注:在植入过程中，严格的麻醉和血压控制至关重要。
4. 在极少数情况下，如果通过遥测转发器注册的动脉血压信号由于动物的超量位置而不满意，则使用皮下穿刺和 Seldinger 技术将另一个动脉导管放入右股动脉。
5. 无菌拖拉后，重新打开腹腔切除术中位数，并使用腹部伸缩器暴露手术场。结肠和小肠被放置在腹部的左侧，以暴露完整的右肾。
6. 与供体程序类似，从周围组织解剖反向肾及其血管。在肾膜的方向上解剖正确的肾静脉和肾动脉，以确保足够的血管长度，以进行结膜衰竭。
7. 血管夹紧前5分钟，静脉注射血-肝素（100 I.U./kg）。
8. 使用血管夹夹夹住右肾动脉和右肾静脉。右肾被切除。在启动麻醉器之前，对船只的完整性进行检查。
9. 将保存的移植肾脏放入腹部，开始静脉和动脉肿瘤。
10. 从这一点开始，保持平均动脉压力超过80-90毫米汞柱，以确保肾移植后良好的早期灌注。部分通过适当的体积管理，部分通过去甲肾上腺素的给法（0.1 - 1 -1.0 μg/kg/min作为连续输液，使用平均动脉血压和心率来监测效率）来实现这一点。
11. 进行肾静脉的端到端性肺病:
    1. 使用 5-0 聚丙烯放置两个角缝后，连续缝合后壁。
    2. 将颅角缝合，与用于后壁的螺纹连接在一起。
    3. 完成后壁后，使用颅角缝合缝合前壁在颅骨方向。用阿不化盐水溶液（100 I.U./mL）冲洗静脉。系上考达尔角缝。
       注:如果捐赠者和接受方之间大小不匹配，可以使用一个小的增长因子来确保广泛和足够的动脉瘤。猪肾静脉分支有许多可能的变化。对于复杂的静脉解剖，有必要采用改良的动脉瘤病（参见图3）。
12. 进行肾动脉的端到端动脉瘤病:
    1. 使用 6-0 聚丙烯颅角缝合进行动脉瘤。放置一个进一步的考达尔， 支持角针， 后来被删除， 是可选的。
    2. 使用降落伞技术连续缝合后壁。到达考达尔角后，取出第二角缝线（如果适用）。
    3. 用双武装 6-0 聚丙烯缝合线的另一端缝合前壁。用肝素盐水溶液（100 I.U./mL）冲洗动脉。将两个线系在考达尔角。
13. 记录使用目标热缺血时间为 <40 分钟执行两种 anastomos 所需的时间。
14. 通过打开静脉血管夹，然后打开动脉夹来重开肾脏。检查有没有明显出血。
15. 如果观察到鼻孔的明显出血，则解开肾移植物，将温暖的正常盐水溶液倒入腹部，覆盖被切除的移植物。
16. 如果需要，重新定位移植物，以确保均匀的再灌注，避免拥塞。
17. 将木瓜顶到肾动脉外侧和动脉瘤病（5 mL 未稀释）。
18. 再灌注后，注入250 mL的20%葡萄糖溶液，以诱导渗透性模具，然后给药单剂量为80毫克的氟化碳。
    注:在此之后，可能会观察到最初的尿液生产。
19. 为了确保泌尿，通过12个法国小儿尿导管通过动物的右侧腹壁，逆行。
20. 使用连字（2-0 聚加糖）将导管固定在尿管中，并使用 2 mL 盐水阻挡导管。进一步缝合用于调整和固定尿管到腹壁的腹膜（2-0聚丙烯）。导管还用至少两个单结缝合线（2-0聚丙烯）固定在皮肤上。
21. 关闭肾脏的肾上膜层，以防止肾脏移植脱位和血管血管肿瘤（3-0多糖蛋白）的扭结。
22. 关闭腹部在类似的4层的方式，如前面描述的移植物检索。
23. 腹部闭合后，在 OR 表上保持正常性。
    注:平均动脉血压应保持在80毫米汞柱以上，直到动物清醒，处于容易的位置。
24. 腹部闭合后，使用彩色多普勒超声波，以确保肾脏移植的充分动脉和静脉灌注（图4）。密切监视动物，直到它完全清醒，可以自发地行走和饮用。在恢复阶段，动物被给予1 L的林格溶液。
25. 随后，将动物返回到住房设施的箱体中。

7. 后续、取样和数据收集

1. 动物能自发饮用就尽快提供水。提供术后第1天的固体食物。
2. 对于术后镇痛，每 8 小时服用一次 72 小时，每天服用一次 72 小时，服用丁丙诺啡（0.05 - 0.1 mg/kg），服用一次。提供抗生素治疗（cefuroxime 35 mg/kg i.v. 2x 每天）和血栓预防（500 毫克乙酰水杨酸从术后第 1 天）整个观察期，直到实验结束。
   注:如果出现出血并发症，阿司匹林将停止服用。
3. 在整个观测期间记录连续遥测数据。确保兽医官和/或经验丰富的兽医技术人员至少每 8 小时访问一次动物，并使用分数表评估它们的临床状况，如果动物的临床状况需要，该分数表用作提前终止实验的基础。
   注:这些所谓的人道端点标准定义如下前^{24 条}。
4. 使用中央静脉线和皮下尿导管进行每日样品采集。每天更换尿袋（2，000 mL）2次。
5. 在采集样品或给药后，在每次使用之间用肝素盐水溶液（100 I.U./mL）阻断中央静脉导管，以避免堵塞，并盖上新的无菌帽。
6. 在相应的观察期为5至7天后，在肾移植切除术、采集样本和切除后，在深度麻醉中牺牲动物。牺牲是使用单次注射五巴比妥（50 - 60毫克/千克即v.） 进行。
   注:根据3R原理，牺牲动物的剩余器官和组织可用于内部研究所的各种外活研究和教育目的。

结果

我们组在小型和大型动物的固体器官移植模型方面拥有多年经验，并利用猪正畸肾自移植模型，在各种实验环境中获得可重复的结果16、25、26、27。根据实验设置，我们建议进行3到5次自动移植作为初步实验，以确保整个实验团队的足够学习曲线。在目前设置中，需要5个移植培训外科医生，8年以前的实验和5年的临床手术经验，在移植手术领域，执行这些实验。这可能因外科医生之前接触这些技术而异。

在该协议的框架内，演示了一组5项猪正畸肾自动移植实验的结果。转发器植入成功在每个动物有足够的遥测信号在整个观察期（除了一个动物与部分转发器功能障碍）。转发器植入的刀对皮肤间隔为 85 分钟± 5 分钟 （表 1） 。经过移植物的取回，所有动物在住房设施中恢复良好。检索手术的刀对皮肤间隔为135分钟±32分钟（包括插入、隧道和固定导管约30-45分钟）。左肾储存在冷水浴中，目标冷缺血时间为24小时（24小时±30分钟）。第二天，麻醉诱导和复发切除术后，反向（右）肾脏被切除，随后是冷库左肾移植的正畸自移植，如前所述。自动移植手术的刀对皮肤间隔为168分钟±27分钟（包括右肾的外植）。热缺血时间是34分钟±7分钟。每个植入的肾脏移植有一个最小，但直接的尿液产生后再灌注。腹部闭合后，彩色多普勒超声波显示所有情况下肾脏的动脉和静脉灌注令人满意（图4）。所有动物从麻醉中恢复过来，在整个观察期间没有观察到重大并发症。每日采集血液和尿液样本。所有猪在随继期间临床状况良好，5天后被牺牲。血清肌氨酸和钾值在POD3-4上达到顶峰。血液pH值保持在正常范围内（图5）。尿输出在术后前四天恢复到正常值。在随发期结束时，白细胞计数略有增加（图5）。通过连续遥测监测测量的体温在术后期间显示出轻微的波动。

图1:研究流程图和协议。 使用的缩写:POD术后日;心电图。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:动物住宅设施，实时及 连续的遥测监测多达6只动物。（A） 我们设施的架构图蓝图，适合为多达6只动物提供房屋及遥测监测。单个保持箱的大小是根据欧盟指令 2010/63 和 ETS 123 附录 A. 面板 A-E 显示我们设施组织的代表性图像确定的。（B） 动物房，供6只动物住。（C） 观察室配有用于连续登记遥测数据的 PC。（D） 动物的实时视频和热镜头。（E） 个人举行确保动物与同伴的声学和嗅觉接触，以避免社会孤立。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:正畸肾自体移植及解剖变异及重建可能性。（A、B）正畸肾自移植模型在"标准"血管解剖的情况下的步骤。（C） 变异1:当一个更大的静脉与供体肾脏一起，有两个静脉在接受者侧。管理:较小的静脉通过连结闭合，并在肾静脉之间进行端到端的结扎。（D） 变异2:当一个较大的静脉与供体肾脏一起出现时，则反边端没有合适的接受者血管（例如大小不匹配）。管理:肾静脉对劣的静脉的端到端性结膜病。（E） 变异3:两侧两个大小相似的静脉。管理:由两个静脉的静脉重建。（F） 变异4:虽然两个大小相近的静脉与供体肾脏一起，则在反侧没有合适的接受者血管。管理:在两种肾静脉的情况下，肾静脉对下到侧结膜病。（G） 变异5:供体肾脏带有一条静脉，显示早期分叉，而反侧有一个大静脉。管理:在接受者侧有一个大静脉的供体肾静脉短共同通道的端到端的异位性。（H） 变异6:虽然供体肾脏带有单一肾静脉，具有早期分叉，但反侧没有合适的接受者血管。管理:对侧结膜病的供体肾静脉的短共通道到劣质的静脉膜。这个数字描绘了少数更频繁的变异，并不全面地从德国陆地猪的所有变化。使用缩写:KG肾移植;RK 右肾;IVC 劣等的维纳卡瓦;AO-aorta请点击这里查看这个数字的较大版本。

图4:代表性彩色多普勒超声图像，直接后正畸肾自动移植和腹部闭合。（A） 彩色多普勒超声波直接在肾脏和腹部闭合的植入后进行，以确保肾脏移植的动脉和静脉灌注良好，并筛查潜在的血管扭结。超声波也使用每天和按需，根据动物的临床表现，以筛选各种问题。（B-E）植入后肾脏移植的代表性超声波图像。肾移植与和没有彩色多普勒（B，C） 的图像显示一个优秀的动脉 （D） 和静脉灌注 （E）.此图显示了来自同一动物的代表性图像。请单击此处查看此图的较大版本。

图5:具有代表性的实验室发现和遥测数据，用于正畸肾自移植模型，冷缺血时间为24小时。（A） 血清钾值 （B） 血清肌氨酸值 （C） pH （D） 白血球计数 （ WBC ） （E） 尿液输出.（F） 连续四次肾移植中，通过遥测监测在观察期内登记的体温（没有因部分^转发器功能障碍而从第5只动物身上提供的数据）。使用的缩写:POD 术后日。请单击此处查看此图的较大版本。

图6:术外并发症及陷阱的例子。 （A-C） 在正畸移植后，在POD3上移植的肾脏移植物的术后充血。（D） 由于皮肤水平缝合过度，导致的塞电原因被确定为导管扭结。重新调整缝合后，在24小时内几乎完全解决了拥塞问题。Asterix （*） 显示了移植物下极周围的流体集合（血腥集合与淋巴细胞）。由于我们的技术与肾上封闭性膜，这些集合通常是自我限制，由于局部压缩的优势效果。动物应根据当地的发现、出血或感染的迹象进行密切监测。（F） 合格的彩色多普勒超声波每天（和按需）在住房设施中进行，除了其学术利用（如文件，动脉抵抗指数的注册），在识别早期亚临床阶段的潜在并发症的关键诊断作用。 请单击此处查看此图的较大版本。

实验任务/步骤	日	时间（分钟）	外科 医生	兽医干事	兽医技术员	实验室技术员	博士生	总
								星期日
前期护理	D-29 到 D-15	n. a.		1	1		1	3
遥测植入手术	D-15	85±5	1	1	1	1	1	5
遥测植入后术后护理	D-15 到 D-1	n. a.		1	1		1	3
移植检索手术	D-1	135±32	1	2	1	2	2	8
肾脏自体移植手术	D 0	168 ±27	1	2	1	2	2	8
肾脏自动移植后术后护理	D 0 到 D5	n. a.		2	1		2	5
牺牲	D 5	n. a.		2		1	1	4

表1.说明猪肾自动移植模型执行各种实验步骤所需的人力资源和时间表。

讨论

KT的猪模型允许在临床相关的大型动物环境中研究新的治疗方法和医疗器械^{15，17，21。}猪与人之间的解剖、病理生理学和手术技术相似性，可促进数据临床解释，以及将研究结果和技术迅速转化为^{临床测试15、16、17、18、19、21。}

正畸肾自体移植模型不仅符合3R原理，减少了与异体移植相比所需的动物数量，例如不需要单独的供体动物，而且为研究 IRI 和保存损伤的影响提供了独特的机会，而没有免疫反应和免疫抑制药物^17、21的^混淆作用。

对协议的轻微修改允许对广泛的临床情况进行建模。为了模拟KT使用捐赠后循环死亡（DCD）肾脏，血管结构在肾脏取回前原位夹住30至60分钟，而长时间的冷缺血时间（24小时及更长）可应用于模型广泛的保存损伤16，17，28，29。

虽然，猪KT模型在手术上不如小动物（如大鼠和小鼠）的实体器官移植模型^{更具挑战性，但为了}改善结果和避免特定的并发症，需要牢记多个技术方面和^陷阱。

由于技术错误或解剖变异，在移植检索或植入过程中，由于未能避免劣质静脉和主动脉周围的大淋巴血管，可能导致高输出淋巴管和术后腹部液体收集、感染和潜在的技术故障。在手术过程中，或用5-0或6-0聚丙烯缝合线关闭时，应完全避免淋巴血管。在淋巴泄漏的情况下，最好也避免使用双极性或任何其他凝固装置。它通常导致局势恶化。在低输出淋巴泄漏的情况下，我们的团队在应用纤维蛋白基胶原蛋白贴片（如^{Tachosil）30}方面拥有丰富的经验，然而，它们的高成本限制了他们在此设置中的应用。

在目前的协议中，我们演示了肾脏检索和自动移植的转膜方法。与临床情况相比，这是一个重大的技术差异，即肾移植通常使用外腹道法植入腹腔。虽然，大多数组使用转开体和正交方法在猪模型，异位移植到伊利亚克福萨也是可能的猪^31。然而，由于30-40公斤猪的外侧腹腔动脉直径相对较低，并且其血管膜瘤的倾向使得有时难以进行肾动脉到外侧动脉³¹的端到端动脉瘤。关于我们通过转膜方法检索左肾以执行后续的自动移植，通过重新打开同一切口和使用前向正畸方法进行植入更为可行，特别是每个协议也要求切除原生右肾，以确保动物只需一个预损伤的种类才能恢复。对模型所有可能的技术变化的全面描述超出了本议定书的范围，并在全面审查第31条中进行了^{其他人的总结}。

移植的肾移植物错位和血管肿瘤的相应扭结是猪KT模型失败的主要原因，由于手术并发症，迅速导致血管闭塞和实验完全失败。为了避免这种情况，在自动移植后，我们使用3-0多糖蛋白用运行缝合关闭肾脏的肾上膜层。此外，彩色多普勒超声波直接在肾脏和腹部闭合的植入后进行，以确保良好的动脉和静脉灌注肾脏移植。超声波也使用日常和按需，根据动物的临床表现，筛查肾脏灌注，肾后问题（如尿导管的阻塞或扭结），以及液体收集由于淋巴管，出血或感染（图4和图6）。

由于24小时的冷缺血往往导致功能障碍和延迟的移植功能，动物可能需要按需治疗，如果认为有必要由兽医官员。这可能包括输液治疗使用5%葡萄糖和/或林格溶液通过中央静脉线施用，氟化物玻利瓦尔注射（在奥利古里亚/阿努里亚的情况下取决于临床状态和实验室的结果，60-80毫克玻利瓦尔注射高达200毫克/天），和口服聚氨酯钠硫酸钠（汞A）的情况下严重高钾血症^32。为了避免实验偏差，负责动物移植后兽医护理的兽医官员必须失明进行应用治疗和分组。

虽然，肾动脉的解剖是相当直接的德国陆地猪通常有一个动脉重建，有广泛的解剖变化的肾静脉分支，需要一定的手术创造力在静脉重建期间。通常两个（或更多）肾静脉分支在肾脏和劣质静脉卡瓦之间的不同水平上连接。最常观察到的变异和可能的重建选项¹⁷ 如图 3所示。

在第一次手术干预（第-15天，遥测植入）之后，所有动物都得到一件猪夹克，在整个实验期间都穿着它。这提供了出色的保护，防止意外伤害和植入导管脱位，并为尿液收集袋的存储提供了空间。使用这些夹克也是一个可行的解决方案，消除代谢笼，评估肌氨酸清除作为一种根据3R原理的精炼方法。

我们的住房设施集成了遥测和基于视频的远程操作监控的使用。虽然这些方法不能取代兽医官和技术人员的定期访问，但它们有助于快速干预和改进严重性评估，以进一步完善我们未来的实验环境。在大型动物模型33中，使用可植入遥测装置的指标^范围很广。虽然，密切监测大手术后的临床寄生虫，如心电图，血压，温度被认为是标准在人类临床设置的手术密集和中间护理单位，在实验手术监测大多是停止时，动物从麻醉^33，34，35醒来。因此，遥测为持续监测这些动物提供了一种可行的方法。我们相信，所有这些数据有助于准确及时地早期发现可能的术后并发症（例如，出血性休克，或通过温度升高、低血糖和心动过速检测的败血症）。这可能有助于及时干预（例如，引入治疗性抗生素治疗、液体替代、停止抗凝或牺牲动物以避免痛苦）。除了这些"实时"监测方面，我们小组目前的重点是动物实验^{36，37，38的严重程度评估和完善}。回顾分析这些实验中收集的大量遥测数据，使我们能够更好地分层这种手术干预的严重程度，并优化实验室动物的周长治疗（如镇痛症）。

在可植入遥测方面，建议在植入测量系统后至少12天，以确保稳定、最优的测量数据（基于个人通信）。在与为大型动物提供遥测解决方案的制造商以及在各种实验环境中使用这些系统的其他研究小组讨论这个问题后，我们决定在遥测植入和肾移植之间集成 14 天。在早些的日子里，由于动物的移动，偏差仍可能发生，因为疤痕和愈合过程仍未完成。

尽管具有其优点，但上述模型有一定的局限性。复杂性和所需的资源和基础设施是模型最重要的限制。耗时的实验方案、复杂的技术和密集的近手术随用随从，需要有大量住房和资源能力，需要一个更大的团队参与，包括博士研究员、外科医生、兽医官员和技术人员（表1）。因此，根据我们的实证观察，每天执行两个多程序通常是不可行的。与小型动物模型相比，猪模型的一个缺点是机械和分子-生物学研究的可能性有限。在现行议定书中，只报告了5天的后续行动。这适合证明模型最重要的实验特性，但是，这种相对较短的后续研究可能不足以回答某些特定的研究问题（例如，功能的长期恢复与急性损伤）。因此，可能需要与项目相关的后续扩展。本手稿描述了我们目前在猪正畸肾自动移植的实验环境中的"最佳实践"。虽然某些步骤是成功建立这一模型的必修步骤，但次要方面（例如，膀胱导管的术中使用、动脉导管放置到股骨与心肌动脉）是具有感染性的，可由调查人员自行决定避免/改变。每个有条不紊的方面的描述和理由将超出本议定书的范围，并在其他地方^讨论过。最后，也很难复制猪模型中ECD KT的确切临床情况，其中老年捐献者、急性肾损伤的异体和患有多种共病和慢性疾病（如高血压、糖尿病或动脉硬化）的捐赠者是边际供体^{8、9的主要部分}。

尽管存在上述限制以及技术和后勤方面的挑战，但KT的这种成熟和可重复的大型动物模型为研究新的疗法和技术，以改善器官保存和临床结果提供了一个独特的机会，并且是年轻外科医生在大型动物模型中掌握器官移植技术的优秀平台。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia materials, drugs and medications
Aspirin 500mg i.v., powder for solution for injection	Bayer Vital AG, Leverkusen, Germany	4324188	antiplatelet agents
Atropine sulfate solution for injection, 100mg	Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Bensheim, Germany	1821288	parasympatholytic agent, premedication
Bepanthen ointment for eyes and nose	Bayer Vital AG, Leverkusen, Germany	1578675	eye ointment
BD Discardit II syringes, 2ml, 5ml, 10ml,20ml	Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany	300928, 309050,309110, 300296	syringes
BD Micolance 3 (20G yellow) Cannula	Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany	305888	venous catheter
BD Venflon Pro Safety (20G pink)	Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany	4491101	venous catheter
Buprenorphine (Buprenovet)	Bayer Vital AG, Leverkusen, Germany	794-996	analgesia
Cefuroxime 750mg, powder for preparing  injection solution	FRESENIUS KABI Deutschland GmbH, Bad Homburg, Germany	J01DC02	antibiotics
Covidien Hi-Contour, Endotracheal Tube 7,5 with Cuffed Murphy Eye	Covidien Deutschland GmbH,Neustadt/Donau, Germany	COV-107-75E	endotracheal Tube
FENTANYL 0,5 mg Rotexmedica solution for injection	Rotexmedica GmbH Arzneimittelwerk, Trittau, Germany	4993593	opioide analgetic agent
Furosemide-ratiopharm 250 mg/25 ml solution for injection	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany	1479542	loop diuretics
Glucose 5% solution for infusion (500ml, 250ml)	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	3705273,03705422	infusion fluid
Glucose 20% solution for infusion	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	4164483	osmotic diuresis
Heparin-Sodium 5000 I.E./ml	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	15782698	anticoagulant
Isoflurane-Piramal (Isoflurane)	Piramal Critical Care Deutschland GmbH, Hallbergmoos, Germany	9714675	volatile anaesthetic agent
Ketamine (Ketamine hydrochloride) 10%	Medistar Arzneimittelvertrieb GmbH, Ascheberg, Germany	0004230	general anaestetic agent
MIDAZOLAM 15mg/3ml	Rotexmedica GmbH Arzneimittelwerk, Trittau, Germany	828093	hybnotica, sedative agent
NaCl 0,9% solution for infusion (500ml,1000ml)	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	864671.8779	infusion fluid
Norepinephrine (Arterenol)	Sanofi-Aventis Deutschland GmbH, Frankfurt, Germany	16180	increase in blood pressure
Organ preservation solution (e.g. HTK)	Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Bensheim, Germany	should be decided based on preference and experimental design	organ preservation
Pantoprazole 40mg/solution for injection	Laboratorios Normon,Madrid, Spain	11068	proton pump inhibitor
Paveron N 25mg/ml solution for injection (Papaverine Hydrochloride)	LINDEN Arzneimittel-Vertrieb-GmbH, Heuchelheim, Germany	2748990	spasmolytic agent for vasodilatation
Pentobarbital (Narcoren)	Boehringer Ingelheim vetmedica GmbH, Ingelheim, Germany	1,204,924,565	used for euthanasia
Propofol 1% (10mg/ml) MCT Fresenius	FRESENIUS KABI Deutschland GmbH, Bad Homburg, Germany	654210	general anaesthetic agent
Ringer solution	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	1471411	infusion fluid
Sterofundin ISO solution for infusion (1000ml)	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	1078961	Infusion fluid
Stresnil (Azaperone) 40mg/ml	Elanco	797-548	sedative
Urine catheter ruffle 12CH	Wirutec Rüsch Medical Vertriebs GmbH, Sulzbach, Germany	RÜSCH-180605-12	transurethral urinecatheter
Surgical materials
Appose ULC Skin Stapler	Covidien Deutschland GmbH,Neustadt/Donau, Germany	8886803712	skin stapler
Cavafix Certo 375	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	4153758	central venous catheter
EMKA Easytel +L-EPTA Transponder	emka TECHNOLOGIES S.A.S,Paris,France	L-EEEETA 100	telemetry transponder
EMKA Reciever and Data Analyzer System	emka TECHNOLOGIES S.A.S,Paris,France	Reviever	telemetry receiver
Feather Disposable Scapel (11)(21)	Feather, Japan	8902305.395	scapel
Prolene 2-0, blue monofil VISI-BLACK, FS needle	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	EH7038H	skin
Prolene 3-0,blue monofil,FS1 needle	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	EH7694H	skin
Prolene 5-0 (simply angulated, C1 needle) blue monofil VISI-BLACK	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	EH7227H	vascular
Prolene 5-0 (double armed, C1 needle) 60cm	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	KBB5661H	vascular
Prolene 6-0 (double armed, C1 needle) 60cm	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	EH7228H	vascular
Sempermed derma PF Surgical Gloves Seril Gr. 7, 7.5, 8	Semperit investment Asia Pte Ltd, Singapore	4200782,4200871,4200894	surgical gloves
Sentinex® PRO Surgical Gowns Spunlace XL 150cm	Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG, Neuwied, Germany	19302	surgical gown
Tachosil	Takeda Pharma Vertrieb GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	MAXI 9,5 x 4,8 cm	haemostasis
Telasorp Belly wipes (green 45x45cm)	PAUL HARTMANN AG,Heidenheim, Germany	4542437	abdominal towel
Pediatric urine catheter	Uromed Kurt Drews KG, Oststeinbeck, Germany	PZN 03280856	used for the uretero-cutaneus stoma
VICRYL- 0 MH Plus	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	V324	fascial closure
VICRYL - 3-0, SH1 Plus needle, 75cm	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	W9114	subcutaneous suture, peritoneal suture,
VICRYL - 3-0, SH1 Plus needle, 4*45cm	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	V780	subcutaneous suture, peritoneal suture,
VICRYL - ligatures Sutupak purple braided, 3-0	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	V1215E	threats for ligature
3M™ Standard Surgical Mask 1810F	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	3M-ID 7000039767	surgical mask
Surgical instruments
Anatomical forceps Standard	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	PZ0260	anatomical forceps
Atraumatic tweezers steel, De Bakey Tip 1,5mm 8"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	GF0840	anatmical atraumatic forceps
Bipolar forceps 16 cm straight, Branch 0,30 mm pointed, universal fit	Bühler Instrumente Medizintechnik GmbH,Tuttlingen, Germany	08/0016-A	biopolar forceps
Bulldog clamp atraumatic,curved, De bakey 78 mm, 3"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	GF0900	bulldog clamps
DE BAKEY-SATINSKY vascular clamp 215mm	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	GF1661	vascular clamp
Dissecting scissors Mayo,250 mm, 10"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	SC2232	Scissors for dissection
Dissecting scissors Metzenbaum-Fino, 260 mm, 101/4"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	SC2290	Scissors for dissection
Draeger CATO Anesthetic machine with PM8050 Monitor	Dräger, Drägerwerk AG & Co. KGaA, Lübeck, Germany	106782	Ventilation System
Fine Tweezers, ADSON 180 mm	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	ADSONPZ0571	fine forceps
Gosset abdomenal wall spreader	CHIRU-INSTRUMENTE, Kaierstuhl,Germany	09-621512	abdominal retractor
HALSTEAD MOSQUITO,curved, surgical 125mm	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	KL2291	mosquite clamps
HF surgical device ICC 300, Electrocautery	Erbe Elektromedizin Gmbh; Tübingen, Germany	20132-043	cautery, biopolar
MICRO HALSTED-MOSQUITO 100mm, curved	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	KL2187	mosquite clamps
Micro steel needle holder straight 0,5mm, with spring lock	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	MN1324D	microsurgical needle holder
Microsurgical/watermaker tweezers LINZ 150mm 6" Ergo round handle	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	MN0087	fine microsurgical forceps
needle holder Mayo-hegar,190 mm, 71/2"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	NH1255	needle holder
Overhold Slimline Fig. 0 8 1/2"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	KL4400	overholds
Sterile Gauze 10X10	Paul HaRTMANN AG,Heidenheim, Germany	401725	sterile gauze
Suction tip OP-Flex Handpiece Yankauer	Pfm Medical AG, Köln, Germany	33032182	suction
surgical forceps Standard 5 3/4"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	PZ1260	surgical forceps
surgical scissors standard pointed-blunt (thread/cloth scissors)175 mm, 7"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	SC1522	surgical Scissors
Titanit vascular scissors POTTS-SMITH,185 mm, 71/4"60°	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	SC8562	Pott scissors
Tunneling instrument	Marina Medical Instruments Inc,Davies,US	MM-TUN06025	subcutaneous tunneling
Vessel loops	Medline International Germany GmbH,Kleve, Germany	VLMINB	hold and adjust the vessel
Wound spreaders Weitlander, Stump,110 mm, 41/4"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	WH5210	wound care
Further material
Heating pad	Eickemeyer - Medizintechnik für Tierärzte KG, Tuttlingen, Germany	648050 MHP-E1220	maintain body temperature during surgery
Laryngoscope, customized	Wittex GmbH, Simbach, Germany	333222230	expose the vocal cord
Rectal temperature probe	Asmuth Medizintechnik, Minden, Germany	ASD-RA4	measure body temperature
Spray wound film	Mepro-Dr. Jaeger und Bergmann GmbH, Vechta, Germany	2830	keep sterile condition
Sterile organ bag	Raguse Gesellschaft für medizinische Produkte, Ascheberg, Germany	800059	organ preservation
swine jacket small, adult Landrasse swine 30-50kg, customized for Emka Telemetry and urinary catheterization	Lomir Biomedical Inc., United Kingdom	SS J1LAPMP	swine jackets to pretect implanted catheters and store urine bag
Ultrasound device, Sonosite Edge-II	FUJIFILM SonoSite GmbH, Frankfurt, Germany	V21822	ultrasound and color Doppler
Urine bag 2000ml Volume	ASID BONZ GmbH, Herrenberg, Germany	2062578	disposable urine bag connected to the uretero-cutaneous fistula catheter