用于分析依赖帽的翻译动力学的 体外 单分子成像测定

摘要

跟踪单个翻译事件允许对依赖上限的翻译机制进行高分辨率动能研究。在这里，我们演示了基于荧光标记抗体和表皮标记的新生肽之间的成像相互作用的 体外 单分子检测。该方法使启动和肽伸长动力学的单分子特征 在主动体外 帽依赖翻译。

摘要

依赖上限的蛋白质合成是真核细胞的主要转化途径。虽然各种生化和遗传方法允许对依赖上限的翻译及其调节进行广泛的研究，但这种翻译途径的高分辨率动能特征仍然缺乏。最近，我们开发了一种 体外 测定法，以单分子分辨率测量依赖上限的转化动力学。该检测基于荧光标记的抗体结合到新生的表皮标记的多肽。通过成像抗体与新生肽（核糖体）mRNA复合物的结合和分离，可以跟踪单个 mRNA 的翻译进展。在这里，我们提出了建立此测定的协议，包括 mRNA 和 PEGylated 幻灯片制备、翻译的实时成像以及单分子轨迹分析。此分析能够跟踪单个依赖上限的翻译事件，并解决关键的翻译动力学，如启动和拉长率。该测定可广泛应用于不同的翻译系统，在依赖上限的翻译动力学和转化控制机制的 体外研究中 应大有裨益。

引言

在真核系统的翻译主要通过7甲基瓜诺辛（m⁷G）帽依赖通路¹发生。研究表明，真核翻译的启动步骤是限速的，也是第^2、3、4条规则的共同目标。利用遗传5、生化6、7、8、结构⁹和基因组¹⁰大块方法，对上限依赖转化机制进行了广泛的研究。虽然这些方法确定了调节依赖上限启动的多种机制，但其分辨率仅限于异质和异步启动事件信号的合奏平均值。最近，在体内翻译事件中，通过测量荧光抗体与新生多肽^{11、12、13、14}上的表皮结合的方法，对个体进行了可视化。然而，这些新方法在解决单个启动事件的能力方面也受到限制，因为多个荧光抗体必须结合一种新生肽，以便从高细胞内荧光背景中解决单个转化事件。在许多生物相互作用中，解决的个体动能事件为理解在分子水平上无法同步的复杂多步骤和重复的生物过程提供了重要的见解。需要采用新的方法来跟踪各个翻译事件的动态，以便更好地了解依赖上限的启动和监管。

我们最近开发了一种体外测定，用单分子分辨率¹⁵测量依赖上限的启动动力学。考虑到这个启动途径^3、16中涉及大量已知和未知的蛋白质因子，单分子测定被开发为与现有的体外无细胞翻译系统兼容，从而受益于细胞因子的保存和强大的翻译活性17、18、19、20、21、22、23、24、25。此外，使用无细胞翻译系统可以更兼容地比较单分子观测结果和以前的批量结果。这种方法将新的单分子动力学见解直接整合到现有的依赖上限启动的机械框架中。为了建立单分子测定，传统的无细胞翻译系统被修改为三种方式:在记者mRNA的开放读取帧（ORF）的开头插入表位编码序列:记者mRNA的3+末端是生物素化，以促进mRNA末端系绳到单分子检测表面:和荧光标签抗体补充翻译提取物。这些修改只需要基本的分子生物学技术和常用的试剂。此外，这些修饰和单分子成像条件保留了无体细胞翻译反应的翻译动力学^15。

在此测定（图1），5+端封顶和3+端生物素化记者mRNA被固定在流室的链球菌涂层检测表面。然后，流室中将填充一种无细胞的转化混合物，并辅以荧光标记的抗体。在mRNA翻译发生在表位序列^26、27下游的大约30-40个子元之后，表位从核糖体出口隧道中浮现出来，并变得能够与荧光标记的抗体相互作用。这种相互作用是快速的，它通过单分子荧光成像技术进行检测，能够在无活性细胞转化过程中跟踪具有单分子分辨率的翻译动力学。这种检测在体外研究依赖上限的翻译动力学及其调节方面应大有裨益，特别是对于体外分析中具有工作量的系统。

建立这种单分子检测的先决条件是工作散装无细胞翻译分析，这可以通过翻译提取物实现，无论是商业上可用的或按照先前描述的方法²⁸准备。真核转化提取物可以从不同的细胞中获取，包括真菌、哺乳动物和植物^28。对于成像，此测定需要配备可调谐激光强度和事件角度的 TIRF 显微镜、电动样品阶段、机动流体系统和样品温度控制装置。这种要求对于现代 体外 单分子TIRF实验来说是通用的，而且可能以不同的方式实现。这里介绍的实验使用了一个客观类型的TIRF系统，该系统由商用显微镜、软件和配件组成，全部列在 材料表中。

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研究方案

1. 记者 mRNA 的一代

1. 修改DNA转录模板，通过插入N-总站表位标记编码序列来为"标记"记者mRNA生成DNA转录模板（图2A），对批量分析"未标记"的记者mRNA进行编码。
   注:3xFLAG/防 FLAG 交互建议用于此检测，因为它具有卓越的灵敏度和短的 3xFLAG 标记长度。但是，该检测与其他表皮/抗体对兼容。
2. 使用线性DNA模板和 体外 转录套件合成未标记和标记的RNA（参见 材料表）。通常，10-20 pmol的 体外 转录RNA足以进行后续RNA处理，以便进行系统的单分子研究。
3. 按照制造商的建议，用 m 7 G 封顶套件（参见材料表）盖上^{RNA 5+}端 （图 2B）。
4. 根据与工具包提供的协议，使用生物素化试剂盒（见材料表）对RNA 3+端（图2B）进行生物基化。通过酚-氯仿提取净化RNA，然后用旋转柱进行净化。10-20微升无RNA水中的埃卢特RNA。大约 40-50% 的未封顶输入 RNA 被恢复。
5. 评估RNA的完整性和浓度通过去硝化丙烯酰胺凝胶电泳和RNA染色，如前^所述29。
6. 使用 3+末生物素化标记的记者 mRNA 执行无批量细胞翻译^30， 以确认修改后的 mRNA 保留了感兴趣的翻译属性。例如，通过测量和比较无大容量无细胞翻译反应中的记者活动与未封顶和封顶的记者 mRNA（参见 代表性结果），可以确认依赖上限的翻译。

2. 流室准备

1. 根据显微镜目标规格表的规定，选择适当的盖片厚度。选择玻璃或石英幻灯片，分别用于目标或棱镜型总内部反射荧光 （TIRF） 成像系统^31。
2. 按照钱德拉多斯等人^描述 的协议进行清洁、盐碱化、PEGylation 和盖片和滑梯的室内组装，并进行以下修改。
   1. 用声波清洗10%碱性液体洗涤剂（v/v）中含有钻孔的洗涤滑梯20分钟。将幻灯片和盖片组合在一起，用于所有剩余的清洁步骤。
   2. 跳过调子洗涤步骤。将皮兰哈蚀刻孵化时间从 20 分钟延长到 1 小时。孵化第一轮 PEGylation 3 小时。用 MS （PEG） 4 以₃ 小时孵化第二轮 PEGylation。

3. 设备准备

1. 在进行单分子实验前至少 3 小时，打开显微镜培养箱，将气流降低到低速率，以避免实验的声学干扰过大。将孵化器温度设置为无细胞转换系统的最佳温度。
   注:翻译对温度极其敏感。每个细胞提取系统都特有最佳反应温度。反应温度特征是开发无体积细胞翻译系统的重要一步。这种单分子测定应在与相应的批量转换条件相同的最佳温度下进行。
2. 在进行单分子实验之前至少 1 小时，通过按下激光盒后面的激光电源按钮打开激光，打开激光安全键，然后按下启动按钮:打开显微镜，点击触摸屏控制面板，选择成像模式、目标和滤镜集。
3. 按下电源按钮打开 EMCCD 摄像机、前一阶段控制器和注射器泵。打开计算机并打开软件 安道尔索利斯 （软件1）控制EMCCD相机 ，TirfCtrl（ 软件2）控制激光 ，PriorTest（ 软件3）控制机动阶段， 冷却器 控制注射器泵。在数据采集开始之前，允许摄像机冷却并稳定到其指定的工作温度。
4. 在软件 2 中，确认正确的参数设置为激光波长、目标类型以及玻璃和样品的折射索引。单击"连接"按钮。要设置激光强度，请单击激光波长旁边的控制按钮，然后在激光控制弹出窗口时，拖动强度滑动条。通过拖动光纤位置滑杆或输入相应的穿透深度，将激光设置为所需的角度。确保检查快门框，以便在不成像时将激光保持在关闭模式下。
   注:通过检查快门框打开并关闭激光 快门 。在最初建立检测时，应测试不同的激光特性和事件角度，以获得最佳的单分子检测。最佳激光强度平衡明亮的单分子荧光和荧光素的快速光漂白。事件角度应超出临界角度，以减少扩散标记抗体的高荧光背景，直到明确解决 mRNA 绑定抗体。作为参考，532 nm 激光被设置为 10 μW 的目标与激光事件角度设置为 71.5° 在研究¹⁵ 使用 Cy3 标签防 FLAG 与标签比 2–7 染料每个抗体.
5. 在软件1中，在采集模式下选择动能，输入曝光时间、动能系列长度和EM增益值的参数。选择目录并分配文件名以保存数据图像文件。
6. 将注射器泵设置为中等到快速的流速，以便后续的管洗涤步骤。
   将 70% 乙醇的液化物放入微富格管中，将注射器泵管末端插入乙醇溶液中，并使用 Coolterm 在提取和分配模式之间切换注射器泵三次以清洗管子。重复使用无 RNase 水。
   注意:管子长度必须足够长，以便在第 5 步分配翻译组合，以便只接触管子，而不是注射器。此处的冲洗量应大于分配的翻译组合的体积，以确保第 5 步的翻译组合与消毒管保持接触。
7. 最后水冲洗后，通过在干净的组织擦拭上涂抹管末端，从管子内部取出残留的水。将管子放入干净的微管中，保持管末端干燥。

4. 3+端生物素化 mRNA 的固定化

1. 保持细胞提取物和翻译混合冻结在干冰上，直到他们使用之前。解冻剩余的冷冻试剂，并将它们保持在冰上。
2. 将流室放入显微镜样品支架中，盖片侧朝下，用胶带固定到位。使用胶带覆盖未使用的流道的入口和插座。
3. Pipette 的 1.5 倍体积（相对于通道体积;也适用于步骤 4 和步骤 5 中的其他步骤），即 0.2 毫克/mL 链球菌进入流道，并在室温下孵育 10 分钟。
4. 要去除未绑定的链球菌素，每次洗涤时，通过 3 倍容量的 T50 洗涤缓冲器（20 mM Tris HCl、pH 7.0、50 mM NaCl、0.2 U/μL RNase 抑制试剂）清洗通道三次。
   注意:防止液体废物回流到通道非常重要。如果流动通道的出口未连接到废物收集管，则在出口口附近放置折叠纸巾，以吸收流出通道的液体。
5. 将翻译提取物从干冰转移到冰中，并允许它们解冻。
6. 在目标上放一滴浸入式油。将带流室的显微镜样品支架放入显微镜阶段。将目标靠近盖片，直到将油浸入目标接触盖片。移动示例阶段，使流道的位置直接位于目标透镜上方。
7. 在软件2中，打开激光快门并调整激光强度水平。
8. 在显微镜控制触摸屏上，选择 "焦点" 选项卡并单击 "焦点搜索 和 启动" 按钮。当焦点平面成功实现时，会听到蜂鸣声。
9. 在软件 1 中实时 模式下映像流通道表面。通过在触摸屏上通过精细的步控调节目标位置，优化对焦以获得更清晰的图像。
10. 在软件 3 中，移动阶段以评估流道检测表面不同区域的荧光背景水平。如果荧光度低，请继续实验。如果荧光背景过高，请考虑丢弃流动通道。
11. 在软件 2 中，关闭激光快门。
12. Pipette 从流道中取出 T50 洗涤缓冲器，并立即以 2 倍容量的生物基化 mRNA 溶液将移液器输送到流道中。孵化15分钟。
    注意:对于每批 mRNA 制备，应测试 mRNA 浓度和潜伏时间，以达到单分子检测所需的 mRNA 表面密度。适当的 mRNA 表面密度介质抗体结合，显示荧光点的重叠不超过 +5%（参见 代表性结果）。作为起点，建议采用浓度为2-20 nM的生物基化mRNA。
13. 通过每次洗涤管道 3 倍容量的翻译兼容缓冲器来清洗通道三次。

5. 翻译组合组装并交付到单分子检测的流通道

1. 在冰上，按照第^1.7 步的批量翻译协议，将 30 个卷的翻译组合组合在微中轴管中，但省略 mRNA 和补充荧光标记抗体的优化浓度除外。短暂旋转微中心管，收集管底部的翻译组合。
   注意:在建立检测时，会测试不同的抗体浓度。最佳浓度显示与检测表面结合的非特异性抗体量较低，与新生肽结合的快速抗体（有关检测校准详细信息，请参阅步骤 7.1 和 7.2）。
2. 将翻译组合转移到 0.7 mL 微富格管盖内部。将注射器泵设置为提取模式。将泵管末端插入翻译组合中。启动注射器取款，将翻译组合收集到泵管中。将注射器泵设置反转到分配模式，并将流量设置为翻译混合交付的最佳速率。
   注意:将气泡传输到泵管时，避免在转换组合中产生气泡。避免将翻译组合太深地撤回到未消毒和按步骤 3.6 冲洗的管子部分。在建立检测时，会测试不同的交货流速率以确定最佳速率（有关检测校准的详细信息，请参阅步骤 6.2）。
3. 如果管端和翻译混合物之间有间隙，启动注射器泵并允许转化混合物到达管端，然后停止注射器泵。
4. 将泵管末端插入流量通道的入口。执行连接时，避免将气泡引入翻译组合中。将定制金属支架拧到显微镜样品支架板上，稳定连接。评估显微镜聚焦和成像区域荧光。
   注:管子可以夹在流室与自定义部分，如先前描述^的33。其他类型的流体系统也可用于此检测³⁴。连接管子之前和之后，视场应类似。如果连接后出现更多荧光点，则翻译组合可能会从输送管中泄漏。根据应用程序的不同，可能需要丢弃具有泄露翻译组合的通道。
5. 确认电影采集参数正确，并输入相应的文件名和目录以保存文件。
6. 移动舞台以映像流道检测表面中心的区域。在显微镜控制触摸屏上，选择 "连续自动对焦 "选项卡，然后单击 "焦点搜索 和 启动 "按钮，以在实验期间保持焦点位置。当焦点平面成功实现时，会听到蜂鸣声。
7. 在软件 2 中，打开激光快门。在软件 1 中，单击"接收信号"按钮即可开始录制。经过大约 5 s 的录制后，在Coolterm中输入Run命令，将翻译组合传送到流通道中。记录长达 2 小时，时间分辨率为 0.5+2 s/帧。
   注:数据采集的最大跨度取决于翻译提取物随着时间推移失去活性的速度，这可以通过使用路西法酶记者 mRNA 执行无体细胞翻译和测量不同时间点³⁵的翻译反应中的路西法酶活性来方便地进行。
8. 数据采集完成后，关闭激光，关闭显微镜控制触摸屏上的 连续自动对焦 ，并将管子从流室拆卸。
9. 从流道入口中分离出转化混合物，将其转移到微管中，并将管放入液氮中，将溶液快速冻结。稍后存储在 -80 °C。
10. 用无 RNase 水清洗注射器泵管三次，然后用 70% 乙醇清洗三次。将 70% 的乙醇提取到注射器泵管中储存。
11. 关闭显微镜和所有配件。收拾。

6. 数据分析

注:此测定的数据分析需要单分子生物物理研究中的常见方法。所有计算密集级步骤均可使用现有算法和软件实现（以下引用包含在其相应步骤中）。

1. 可选:如果适用，请将已获得的图像系列文件转换为与所选的图像处理软件或编程语言兼容的格式。
2. 确定翻译反应起点和试剂交换时间。
   注意:由于翻译组合中荧光抗体的扩散，在从翻译兼容缓冲器到翻译混合的通道试剂交换过程中，图像区域的背景荧光强度将增加。翻译反应起点设置为试剂交换完成的时间点。这个完成点是通过测量转化组合传递过程中的背景荧光强度和识别荧光强度增加¹⁵时的时间点（如下所述）找到的。
   1. 计算每个图像帧的总荧光计数，并绘制相应的时间配置文件。识别时间配置文件情节中总荧光的突然增加。
      注:荧光总量增加的原因是试剂交换过程中荧光标记抗体浓度增加。
   2. 确定总荧光增加阶段的终点，并将此时间点设置为翻译反应的起点（即时间 0）。确定总荧光增加阶段的起点和终点，并将时差设定为试剂交换时间。
      注:试剂交换的总时间跨度取决于流道尺寸和所选流速率。在试剂交换完成之前，某些翻译因子可能开始绑定到 mRNA，这可能会降低确定的第一轮启动时间的分辨率。因此，建议在设置检测和选择流速时测试不同的流率，使试剂交换在 3–4 s 内完成数据采集速度为 0.5–2 s/帧。
3. 可选:执行电影漂移校正。
   注:由于显微镜部件和配件的漂移，数据图像中绑定抗体的位置可能会随时间而改变。在进一步进行数据分析之前，电影中视觉上明显的漂移需要更正。有几个空间漂移校正算法和脚本可用36，37，38。
   1. 在每个图像中，在像素计数中查找本地最大数，以以像素级精度确定每个帧中绑定抗体的位置。为像素计数设置阈值，以便只选择明显高于背景噪声的点。
   2. 计算两个连续图像帧之间每个方向上单个抗体位置的变化。
   3. 绘制两个连续帧之间的抗体位置变化的直方图，并针对每个方向分别进行。高斯适合每个直方图，并将峰值的中心位置设置为连续两帧之间的定向漂移。
   4. 为了抵消观测到的漂移，按计算的漂移量将每个图像帧向相反的方向移动。
4. 构建单分子轨迹。
   注:检测/跟踪软件可用于识别亮点，并从数据图像系列^39，40中提取其特异性。
   1. 识别步骤 6.3.1 中描述的抗体位置。
      注意:建议进行目视检查，以确保所选阈值不会导致粒子过度过度或采摘不足。视觉检查可以通过在每个图像帧上覆盖已识别的中心位置并目视评估其协议（参见 代表结果）来实现。
   2. 将所有帧中拾取的粒子组合在一起，并去除多余的颗粒位置。
   3. 目视检查绑定抗体的图像，并选择一个方形区域，将像素包围起来，其计数明显高于背景，并代表单独绑定抗体。
      注:点传播函数（即单个分子的正方形大小）由光学设置和探测器像素大小决定。
   4. 对于每个粒子位置，通过计算粒子位置周围方形区域中所有像素的总强度来构建单分子轨迹。每个位置、每个帧和整个数据电影都构建了轨迹。
5. 可选:应用非线性前向后滤镜⁴¹ 以减少单分子轨迹中的背景噪声。
6. 可选:用现有的步进检测算法^{42、43、44、45}对轨迹进行数字化。
   注:步骤检测算法的选择取决于单分子动力学的复杂性。对于最简单的场景，只有孤立的核糖体翻译（即没有聚体形成）和良好的信号与噪声比，阈值应用到荧光计数足以识别抗体结合和分离事件在单分子轨迹的时间。建议对每个条件至少 100 个轨迹进行目视检查，以确保通过步骤检测策略适当选择轨迹步骤。
7. 确定每个轨迹的第一个抗体绑定事件的时间（即第一次到达时间 ，t_1），要么使用数字化轨迹，要么对未迁移的轨迹应用阈值。
   注:第一次到达时间分布的中值可以在不同的翻译条件之间进行比较。或者，第一次到达时间分布可以安装到一个移动的（3参数）日志正常功能，以确定平均值¹⁵ ₁& gt;。由于第一次到达时间分布通常偏斜且尾部很长，因此不要通过直接平均值计算观察到的首次到达时间的平均值。
8. 可选:Dwell 时间分析和平均肽合成率的计算。
   1. 使用数字化轨迹来识别每个轨迹中的单体（单核糖体）转换事件，并将单个绑定事件停留时间计算为相应抗体结合和分离事件之间的时差。
      注:当多个分子事件重叠时，用于数字化轨迹的步进检测算法通常不太可靠。因此，建议将聚体事件排除在居住时间分析之外。对于富含多体事件且很少显示单体事件的高度活跃的翻译系统，可以使用标记和无标签抗体的混合物来增加观察单分子轨迹中孤立的翻译事件的机会。
   2. 将分布适应日志正常功能，并使用安装的功能计算平均停留时间。
      注意:不建议直接通过平均观察到的居住时间来计算平均值，因为居住时间分布通常带有长尾。
   3. 通过从 ORF codons 总数中减去表位氨基酸长度和 35（核糖体出口隧道内新生肽的平均氨基酸长度）的总和，确定抗体结合期间转化的氨基酸数量。
   4. 要确定平均肽合成率，请将转化氨基酸的数量除以平均停留时间。
9. 可选:计算平均第一轮启动时间（>t 1_I:）。
   注:启动和拉长条件，如启动站点序列上下文和编码序列，通常被刻意保存，用于启动动力学研究。因此，从步骤6.7的平均第一次到达时间&t₁>。可直接用于计算不同条件之间第一轮启动动力学的变化。以下修正仅用于确定第一轮启动时间的实际值。
   1. 将表皮长度和 35（核糖体出口隧道内新生肽的平均氨基酸长度）之和除以平均肽合成速率（从步骤 6.8.4.）来计算此 N 端区域的平均肽拉长时间 （+lt;t_{1_tag}& gt;）。
   2. 由于第一次到达时间是第一轮启动时间和_{t 1_tag}的总和，减去<:_{t 1_tag>}从平均第一次到达时间>t_{lt:t 1>}计算平均第一轮启动时间>t 1_I>:>>t 1_I>==lt=t_{1=->t 1_tag>}

7. 分析校准

注意:在最初建立检测时执行以下校准步骤。

1. 要检查抗体绑定特异性，在第 4 节和第 5 节分别执行协议步骤，以进行未标记和标记的 mRNA（图 2）。与这些各自的 mRNA 的通道中的抗体结合水平表示非特异性抗体与检测表面结合的程度，以及与新生肽结合的特定抗体。
   注意:建议特定到非特定绑定比率为 >10，并可通过不同的表面通活策略、较低的抗体浓度或更高的 mRNA 表面密度来增加。
2. 要测量抗体结合率，在第 4 步和第 5 步之间执行协议。
   1. 第 4 步后，用缺乏抗体的转化混合物孵育通道，以预生成 mRNA/核糖体/肽复合物。
   2. 然后继续第 5 步，将抗体补充的翻译混合物流入通道。
   3. 量化平均抗体结合率到预生成的新生肽与指数适合第一次到达时间直方图。
      注意:抗体结合到预生成肽应该是快速的，按秒数顺序排列，并且应该比翻译动力学快。更高的抗体浓度可用于提高抗体结合率。
3. 荧光标记抗体的光度。
   1. 根据第 2 步的协议准备幻灯片，但跳过 PEGylation 步骤。盐化步骤后组装流室。硅烷涂层允许高效的非特异性抗体结合到检测表面。
   2. 将荧光标记抗体加入通道，实现非特异性抗体与检测表面结合的单分子密度。首先添加在 T50 洗涤缓冲器中高度稀释的荧光标记抗体，并逐渐增加抗体浓度，直到达到所需的单分子密度。
   3. 图像检测表面，直到大多数抗体荧光不再可检测。
   4. 绘制可见抗体总数，以评估氟化物光漂白导致的抗体荧光损失率。
      注:抗体标签通常产生多个氟磷每个抗体。单个抗体保持可检测，直到所有结合氟磷光漂白剂。

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结果

按照所描述的协议，在3'末端系记者mRNA（图1）的活性无细胞翻译过程中，能够与新生的N终端标记多肽进行单个抗体相互作用的成像，具有单分子分辨率。报告使用三种合成 mRNA 进行最小演示实验:LUC（编码未标记的路西法酶）、LUC_FLAG（编码 3xFLAG 标记的路西法酶）和hp-LUC_{FLAG（LUC FLAG，}在 5' 领先区...

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讨论

与典型的体外TIRF 单分子实验相比，此处描述的检测的单分子成像由于使用细胞提取物和高浓度荧光标记抗体而异常复杂。与一轮表面PEGylation的更常见做法相比，第二轮PEGylation（第2步）大大减少了非特异性抗体对检测表面¹⁵的结合。扩散荧光抗体的高浓度会导致极高的荧光背景，掩盖单分子检测抗体结合。为了减少这种荧光背景，激光事件角度远高于临界角（第 3.4 步）?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100X oil objective, N.A. 1.49	Olympus	UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1)	Bio-Rad	161-0144
Alkaline liquid detergent	Decon	5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)	UCT Specialties, LLC	A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD	Andor	DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software	Andor		For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter	Chroma	532/640/25
Band-pass filter	Chroma	NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA	Laysan Bio Inc	Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid	Prolume	309-250
Coolterm software			For controlling the syringe pump
Desktop computer	Dell		For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror	Semrock	R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX	Fisher Scientific	NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
Epoxy	Devcon	14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid	Prolume	306-250
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	BP1185500
Hydrogen perioxide	Sigma-Aldrich	216763-500ML
Immersion oil	Olympus	Z-81226A	Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System	Promega	E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit	Thermo fisher	AM1334
Methanol	Fisher Scientific	MMX04751
Microscope	Olympus	IX83
Microscope slide	Thermo Scientific	3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3	Sigma-Aldrich	A9594
mPEG-SVA	Laysan Bio Inc	mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4	Thermo Scientific	22341
NaCl (5M)	Thermo Scientific	AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass	Fisherband	12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM	Olympus digital Laser system	CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software	Olympus		For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table	TMC vibration control	63-563	With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix	Sigma-Aldrich	77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit	Thermo Scientific	20160
Potassium hydroxide pellets	Sigma-Aldrich	P1767-500G
Prior motorized XY translation stage	Prior	PS3J100
Prior PriorTest software	Prior		For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor	Promega	N2515
Stage top Incubator	In vivo scientific (world precision Instruments)	98710-1	With a custom built acrylic cage
Staining jar	Fisher Scientific	08-817
Streptavidin	Thermo Scientific	43-4301
Sulfuric acid	Fisher Scientific	A300212
SYBR green II	Fisher Scientific	S7564
Syringe	Hamilton	1725RN
Syringe pump	Harvard apparatus	55-3333
Tris (1M), pH = 7.0	Thermo Scientific	AM9850G
Ultrasonic Bath	Branson	CPX1800H
Urea	Sigma-Aldrich	U5378-500G
Vaccinia Capping system	New England Biolabs	M2080S
Zymo-Spin IC Columns	Zymo Research	C1004