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Resumen

El seguimiento de eventos de traducción individuales permite estudios cinéticos de alta resolución de mecanismos de traducción dependientes de la tapa. Aquí demostramos un ensayo in vitro de una sola molécula basado en interacciones por imágenes entre anticuerpos etiquetados fluorescentemente y péptidos nacientes etiquetados con epitopos. Este método permite la caracterización de moléculas únicas de cinética de iniciación y elongación peptídica durante la traducción activa dependiente de la tapa in vitro.

Resumen

La síntesis de proteínas dependientes de la tapa es la vía de traducción predominante en las células eucariotas. Si bien varios enfoques bioquímicos y genéticos han permitido estudios exhaustivos de traducción dependiente de la tapa y su regulación, todavía falta una caracterización cinética de alta resolución de esta vía de traducción. Recientemente, desarrollamos un ensayo in vitro para medir la cinética de traducción dependiente de la tapa con resolución de una sola molécula. El ensayo se basa en la unión de anticuerpos etiquetado fluorescentemente a polipéptido naciente etiquetado con epítopo. Al tomar imágenes de la unión y disociación de anticuerpos hacia y desde complejos nacientes de péptido–ribosoma-ARNM, se puede realizar un seguimiento de la progresión de la traducción en los ARN individuales. Aquí, presentamos un protocolo para establecer este ensayo, incluyendo preparaciones de mRNA y diapositivas PEGylated, imágenes en tiempo real de traducción y análisis de trayectorias de moléculas únicas. Este ensayo permite el seguimiento de eventos de traducción dependientes de límites individuales y resuelve la cinética de traducción clave, como las tasas de iniciación y alargamiento. El ensayo puede aplicarse ampliamente a sistemas de traducción distintos y debe beneficiar ampliamente estudios in vitro de cinética de traducción dependiente de la tapa y mecanismos de control traslacional.

Introducción

La traducción en sistemas eucariotas se produce predominantemente a través de vías dependientes de la tapa de 7-metilguanosina (m7G)1. Los estudios indican que el paso de iniciación de la traducción eucariota es la limitación de tipos y un objetivo común para lareglamentación 2,3,4. Los mecanismos de traducción dependiente de la tapa se han estudiado ampliamente utilizando enfoques genéticos5,bioquímicos6,7,8,estructurales9y genómicos agranel. Aunque estos métodos han identificado diversos mecanismos que regulan la iniciación dependiente de la tapa, su resolución los limita al ensamble de señales de eventos de iniciación heterogéneos y asincrónicos. Más recientemente, los eventos de traducción in vivo individuales han sido visualizados por métodos que miden la unión de anticuerpos fluorescentes a los epítopos en polipéptidos nacientes11,12,13,14. Sin embargo, estos nuevos enfoques también están limitados en su capacidad para resolver eventos de iniciación individuales porque múltiples anticuerpos fluorescentes deben unir un péptido naciente para permitir que los eventos de traducción única se resuelvan a partir de un alto fondo de fluorescencia intracelular. En muchas interacciones biológicas, los eventos cinéticos individuales resueltos han proporcionado información crítica sobre la comprensión de procesos biológicos complejos multipaso y repetitivos que no son posibles sincronizar a nivel molecular. Se necesitan nuevos métodos que puedan realizar un seguimiento de la dinámica de los eventos de traducción individuales para una mejor comprensión de la iniciación y la regulación dependientes de la limitación.

Recientemente desarrollamos un ensayo in vitro que mide la cinética de iniciación dependiente de la tapa con resolución de una sola molécula15. Teniendo en cuenta el gran número de factores proteicos conocidos y desconocidos implicados en esta vía de iniciación3,16,el ensayo de molécula única fue desarrollado para ser compatible con los sistemas de traducción in vitro existentes libres de células para beneficiarse de su preservación de factores celulares y su sólida actividad de traducción17,18,19,20,21,22,23,24,25. Además, el uso de sistemas de traducción sin células permite comparaciones más compatibles entre observaciones de moléculas únicas y resultados masivos anteriores. Este enfoque proporciona una integración directa de nuevos conocimientos cinéticos de molécula única en el marco mecanicista existente de la iniciación dependiente de la tapa. Para establecer el ensayo de una sola molécula, el sistema de traducción libre de células tradicional se modifica de tres maneras: se inserta una secuencia de codificación de epítopos al principio del marco de lectura abierto (ORF) de un ARNm reportero; el extremo de 3′ del ARNm reportero se biotinila para facilitar el anclaje final del ARNm a la superficie de detección de moléculas únicas; y anticuerpos con etiqueta fluorescente se complementan con el extracto de traducción. Estas modificaciones requieren únicamente técnicas básicas de biología molecular y reactivos comúnmente disponibles. Además, estas modificaciones y las condiciones de imagen de una sola molécula preservan la cinética de traducción de las reacciones de traducción masivas libres de células15.

En este ensayo(Figura 1),el ARNm de reportero biotinilado de 5'end tapado y 3′-end se inmoviliza a una superficie de detección recubierta de estreptavidina en una cámara de flujo. La cámara de flujo se llena con una mezcla de traducción libre de células complementada con anticuerpos etiquetados fluorescentemente. Después de que la traducción del ARNM se ha producido durante aproximadamente 30-40 codón aguas abajo de la secuencia de epítopos26,27,el epítopo emerge del túnel de salida ribosoma y se vuelve accesible para interactuar con anticuerpos con etiqueta fluorescente. Esta interacción es rápida y su detección mediante técnicas de imágenes de fluorescencia de una sola molécula permite el seguimiento de la cinética de traducción con resolución de una sola molécula durante la traducción activa sin células. Este ensayo debe beneficiar ampliamente los estudios in vitro de la cinética de traducción dependiente de la tapa y su regulación, particularmente para sistemas con un ensayo in vitro a granel de trabajo.

Un requisito previo para establecer este ensayo de molécula única es un ensayo de traducción a granel sin células de trabajo, que se puede lograr utilizando extracto de traducción que está disponible comercialmente o preparado siguiendo los métodos descritos anteriormente28. Extracto de traducción eucariota se puede obtener de diversas células, incluyendo hongo, mamífero, y planta28. Para la toma de imágenes, este ensayo requiere un microscopio TIRF equipado con intensidad láser ajustable y ángulo de incidente, una etapa de muestra motorizada, un sistema de fluidos motorizados y un dispositivo de control de temperatura de la muestra. Estos requisitos son genéricos para los experimentos tirf in vitro modernos de una sola molécula y pueden lograrse de manera diferente. El experimento presentado aquí utiliza un sistema TIRF de tipo objetivo compuesto por microscopio, software y accesorios disponibles comercialmente, todos enumerados en la Tabla de Materiales.

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Protocolo

1. Generación de ARNm reportero

  1. Modifique una plantilla de transcripción de ADN que codifique un ARN de reportero "sin etiquetar" mediante la inserción de una secuencia de codificación de etiquetas de epitopo N-terminus para generar una plantilla de transcripción de ADN para un ARNm de reportero "etiquetado" (Figura 2A).
    NOTA: Se recomienda la interacción 3xFLAG/anti-FLAG para este ensayo debido a su sensibilidad superior y la corta longitud de la etiqueta 3xFLAG. Sin embargo, el ensayo es compatible con otros pares de epitopos/anticuerpos.
  2. Sintetizar RNAs sin etiquetar y etiquetados utilizando plantillas de ADN linealizadas y un kit de transcripción in vitro (ver Tabla de Materiales). Por lo general, 10-20 pmol de ARN transcrito in vitro es suficiente para el procesamiento posterior de ARN para permitir un estudio sistemático de una sola molécula.
  3. Cap el final del ARN 5′(Figura 2B)con un kit de tapado m7G (ver Tabla de Materiales)siguiendo la recomendación del fabricante.
  4. Biotinilar el extremo del ARN 3′(Figura 2B)utilizando un kit de biotinilación (ver Tabla de Materiales)según el protocolo suministrado con el kit. Purifique los RNAs mediante extracción fenol-cloroformo seguida de purificación con una columna de espín. ELUTE ARN en 10-20 μL de agua libre de ARN. Aproximadamente el 40-50% del ARN de entrada sin tapar se recupera.
  5. Evaluar la integridad y concentración del ARN desnaturalizando la electroforesis del gel de acrilamida y la tinción de ARN, como se describió anteriormente29.
  6. Realice la traducción30 sin celdas a granel con el ARNM reportero etiquetado con etiqueta 3′-end-end para confirmar que el ARNm modificado preserva las propiedades de traducción que son de interés. Por ejemplo, la traducción dependiente de la tapa se puede confirmar midiendo y comparando las actividades de los reporteros en reacciones de traducción masivas sin celdas con mRNAs de reporteros sin tapa y tapados (véanse los resultados representativos).

2. Preparación de la cámara de flujo

  1. Seleccione un grosor de deslizamiento de cubierta adecuado, según lo especificado por la hoja de especificaciones objetivas del microscopio. Seleccione una diapositiva de vidrio o cuarzo para sistemas de imágenes de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de tipo objetivo o prisma (TIRF)31, respectivamente.
  2. Realice la limpieza, la salinización, la PEGylation y el conjunto de cámaras de tapadera y deslizamiento siguiendo el protocolo descrito por Chandradoss et al.32 con las siguientes modificaciones.
    1. Lave los portaobjetos que contengan orificios perforados en detergente líquido alcalino al 10% (v/v) durante 20 minutos con sonicación. Combine las diapositivas y los portaobjetos para todos los pasos de limpieza restantes.
    2. Evite el paso de lavado de acetona. Extender el tiempo de incubación de aguafuerte Piranha de 20 min a 1 h. Incubar el PEGylation de primera ronda durante 3 h. Incubar el PEGylation de segunda ronda con MS(PEG)4 para 3 h.

3. Preparación del equipo

  1. Al menos 3 h antes de realizar un experimento de una sola molécula, encienda la incubadora de microscopios y reduzca el flujo de aire a una velocidad baja para evitar perturbaciones acústicas excesivas de los experimentos. Ajuste la temperatura de la incubadora a la temperatura óptima para el sistema de traducción sin celdas.
    NOTA: La traducción es extremadamente sensible a la temperatura. La temperatura óptima de reacción es específica para cada sistema de extracción celular. La caracterización de la temperatura de reacción es un paso vital en el desarrollo de un sistema de traducción sin células a granel. Este ensayo de una sola molécula debe realizarse bajo la misma temperatura óptima que la condición de traducción a granel correspondiente.
  2. Al menos 1 h antes de realizar un experimento de una sola molécula enciende el láser pulsando el botón de encendido láser detrás de la caja láser, gire la tecla de seguridad láser y pulse el botón de inicio; encienda el microscopio y toque en el panel de control de la pantalla táctil para seleccionar el modo de imagen, el objetivo y el conjunto de filtros.
  3. Encienda la cámara EMCCD, el controlador de etapa Prior y la bomba de jeringa presionando sus botones de encendido. Encienda la computadora y abra el software Andor Solis (software 1) para controlar la cámara EMCCD, TirfCtrl (software 2) para controlar el láser, PriorTest (software 3) para controlar la etapa motorizada y Coolterm para controlar la bomba de jeringa. Permita que la cámara se enfríe y se estabilice a su temperatura de trabajo designada antes de que comience la adquisición de datos.
  4. En el software 2, confirme que los parámetros correctos están configurados para la longitud de onda láser, el tipo de objetivo y el índice refracción del vidrio y la muestra. Haga clic en el botón Conectar. Para ajustar la intensidad del láser, haga clic en el botón Control situado junto a la longitud de onda láser y, a continuación, en la ventana emergente del control láser, arrastre la barra deslizante de intensidad. Ajuste el láser al ángulo deseado arrastrando la barra deslizante de posición de fibra o introduciendo la profundidad de penetración correspondiente. Asegúrese de que la casilla Obturador esté marcada para mantener el láser en el modo Desactivado cuando no se toma imágenes.
    NOTA: Abra y cierre el obturador láser marcando la casilla Obturador. Al establecer inicialmente el ensayo, se deben probar diferentes intensidades láser y ángulos de incidente para una detección óptima de una sola molécula. La intensidad óptima del láser equilibra la fluorescencia brillante de una sola molécula y el fotobleaching rápido de los fluoróforos. El ángulo de incidente debe aumentarse más allá del ángulo crítico para reducir el alto fondo fluorescente de los anticuerpos etiquetados difusantes hasta que los anticuerpos vinculados al ARNM se resuelvan claramente. Como referencia, un láser de 532 nm se estableció en 10 μW en el objetivo con el ángulo de incidente láser establecido en 71,5° en un estudio15 utilizando anti-FLAG con etiqueta Cy3 con una relación de etiquetado de 2-7 tintes por anticuerpo.
  5. En el software 1, elija Kinetic en el modo de adquisición,introduzca los parámetros para el tiempo de exposición, la longitud de la serie cinética y el valor de ganancia em. Elija el directorio y asigne nombres de archivo para guardar el archivo de imagen de datos.
  6. Ajuste la bomba de jeringa a un caudal modesto a rápido para el paso de lavado de tubos posterior.
    Pipetear una alícuota de 70% de etanol en un tubo de microcombustible, insertar el extremo de tubo de la bomba de jeringa en la solución de etanol, y utilizar Coolterm para alternar la bomba de jeringa entre los modos de extracción y dispensación tres veces para lavar el tubo. Repita el uso de agua libre de RNase.
    NOTA: La longitud del tubo debe ser lo suficientemente larga como para permitir que la mezcla de traducción se dispense en el paso 5 para que solo se ponga en contacto con el tubo, no con la jeringa. El volumen de enjuague aquí debe ser mayor que el volumen de la mezcla de traducción dispensada para garantizar que la mezcla de traducción en el paso 5 permanezca en contacto con el tubo desinfectado.
  7. Después de que se haya dispensado el enjuague de agua final, retire el agua residual del interior del tubo frotando el extremo del tubo en una toallita de tejido limpio. Mantenga el extremo del tubo seco poniéndolo en un tubo de microcombustible limpio.

4. Inmovilización del ARNm biotinilado de 3′-end

  1. Mantenga el extracto celular y la mezcla de traducción congelada en hielo seco hasta justo antes de su uso. Descongelar los reactivos congelados restantes y mantenerlos en hielo.
  2. Coloque la cámara de flujo en el soporte de la muestra del microscopio con el lado de la cubierta hacia abajo y asegure en su lugar con cinta adhesiva. Utilice cinta para cubrir las entradas y salidas de los canales de flujo que no están en uso.
  3. Pipeta un volumen de 1,5x (en relación con el volumen del canal; también se aplica a otros pasos en el paso 4 y paso 5) de 0,2 mg/ml de estreptococo en el canal de flujo e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  4. Para eliminar la estreptocedina sin consolidar, lave el canal tres veces pipeteando en un volumen de 3 veces el tampón de lavado T50 (20 mM Tris HCl, pH 7.0, 50 mM NaCl, 0.2 U/μL RNase inhibition reagent) por lavado.
    NOTA: Es importante evitar que los residuos líquidos vuelvan al canal. Si la salida del canal de flujo no está conectada a un tubo de recogida de residuos, coloque un papel tisular doblado cerca de la salida para absorber el líquido que fluye fuera del canal.
  5. Transfiera el extracto de traducción y mezcle del hielo seco al hielo y deje que se descongelen.
  6. Ponga una gota de aceite de inmersión en el objetivo. Coloque el soporte de muestra del microscopio con la cámara de flujo en la etapa del microscopio. Acerque el objetivo a la cubierta hasta que el aceite de inmersión en el objetivo entre en contacto con el coverslip. Mueva la etapa de muestra para que la posición del canal de flujo esté directamente por encima de la lente objetivo.
  7. En el software 2, abra el obturador láser y ajuste el nivel de intensidad del láser.
  8. En la pantalla táctil del control de microscopio, seleccione la pestaña Enfoque y haga clic en el botón Búsqueda e inicio de enfoque. Se oye un pitido cuando se logra con éxito un plano de enfoque.
  9. Imagine la superficie del canal de flujo en modo live en el software 1. Optimice el enfoque de una imagen más nítida ajustando la posición objetivo con el control de paso fino en la pantalla táctil.
  10. En el software 3, mueva la etapa para evaluar el nivel de fondo de fluorescencia en varias áreas de la superficie de detección del canal de flujo. Si la fluorescencia es baja, continúe con el experimento. Si el fondo de fluorescencia es excesivamente alto, considere la posibilidad de descartar el canal de flujo.
  11. En el software 2, cierre el obturador láser.
  12. Pipeta fuera del tampón de lavado T50 desde el canal de flujo e inmediatamente pipeta en un volumen 2x de solución de ARNm biotinilada al canal de flujo. Incubar durante 15 min.
    NOTA: Para cada lote de preparación del ARNM, las concentraciones de ARNm y los tiempos de incubación deben probarse para lograr la densidad superficial del ARNm necesaria para la detección de moléculas únicas. La densidad de superficie del ARNm adecuada media la unión de anticuerpos que muestra manchas fluorescentes con no más de ~5% superpuesta (consulte Resultados representativos). Como punto de partida, se recomienda el ARNm biotinilado a una concentración de 2-20 nM.
  13. Lave el canal tres veces canalizando un volumen de 3 veces el búfer compatible con la traducción por lavado.

5. Conjunto y entrega de mezcla de traducción a un canal de flujo para la detección de moléculas únicas

  1. Sobre hielo, ensamblar volúmenes 3x de la mezcla de traducción30 en un tubo de microcentrífuga siguiendo el protocolo de traducción a granel desde el paso 1.7, excepto omitir el ARNM y complementar con una concentración optimizada de anticuerpos etiquetados fluorescentemente. Gire brevemente el tubo de microcentrífuga para recoger la mezcla de traducción en la parte inferior del tubo.
    NOTA: Al establecer el ensayo, se prueban diferentes concentraciones de anticuerpos. La concentración óptima muestra bajas cantidades de unión de anticuerpos no específicos a la superficie de detección y unión rápida de anticuerpos al péptido naciente (ver pasos 7.1. y 7.2., respectivamente, para detalles de calibración del ensayo).
  2. Transfiera la mezcla de traducción al interior de una tapa de tubo de microfugio de 0,7 ml. Ajuste la bomba de jeringa al modo de retirada. Inserte el extremo del tubo de la bomba en la mezcla de traducción. Inicie la retirada de la jeringa para recoger la mezcla de traducción en el tubo de la bomba. Invierta el ajuste de la bomba de jeringa al modo de dispensación y ajuste el flujo a una velocidad óptima para la entrega de la mezcla de traducción.
    NOTA: Evite generar burbujas en la mezcla de traducción al transferirla al tubo de la bomba. Evite retirar la mezcla de traducción demasiado profunda en la parte del tubo que no fue desinfectada y enjuagada en el paso 3.6. Al establecer el ensayo, se prueban diferentes caudales de entrega para determinar la velocidad óptima (consulte el paso 6.2. para obtener más información sobre la calibración del ensayo).
  3. Si hay un espacio entre el extremo del tubo y la mezcla de traducción, inicie la bomba de jeringa y permita que la mezcla de traducción llegue al extremo del tubo, luego detenga la bomba de jeringa.
  4. Inserte el extremo del tubo de la bomba en la entrada del canal de flujo. Evite introducir burbujas de aire en la mezcla de traducción al realizar la conexión. Estabilice la conexión atornillando el soporte metálico hecho a medida en la placa del soporte de la muestra del microscopio. Evalúe el enfoque del microscopio y la fluorescencia del área de imágenes.
    NOTA: El tubo se puede sujetar a la cámara de flujo con una pieza personalizada como se describió anteriormente33. Otros tipos de sistemas fluidos también se pueden utilizar para este ensayo34. El campo de visión debe aparecer similar antes y después de conectar el tubo. Si aparecen más manchas fluorescentes después de la conexión, es probable que la mezcla de traducción se filtre del tubo de entrega. Dependiendo de la aplicación, el canal con mezcla de traducción filtrada puede necesitar ser descartado.
  5. Confirme que los parámetros de adquisición de películas son correctos y que se han introducido el nombre de archivo y el directorio adecuados para guardar archivos.
  6. Mueva el escenario para tomar imágenes de un área en el centro de la superficie de detección del canal de flujo. En la pantalla táctil de control de microscopio, seleccione la pestaña AF continuo y haga clic en el botón Búsqueda e inicio de enfoque para mantener la posición focal durante el experimento. Se oye un pitido cuando se logra con éxito un plano de enfoque.
  7. En el software 2, abra el obturador láser. En el software 1, haga clic en el botón Tomar señal para iniciar la grabación. Después de aproximadamente 5 s de grabación, ingrese el comando Ejecutar en Coolterm para entregar la mezcla de traducción en el canal de flujo. Registre hasta 2 h con una resolución de tiempo de 0,5-2 s/frame.
    NOTA: El período máximo de adquisición de datos depende de la rapidez con la que el extracto de traducción pierde actividad con el tiempo, que se puede caracterizar convenientemente por realizar una traducción a granel sin células con ARNm de reportero luciferasa y medir la actividad luciferasa en las reacciones de traducción en diferentes puntos de tiempo35.
  8. Cuando finalice la adquisición de datos, apague el láser, apague el AF continuo en la pantalla táctil del control del microscopio y desmonte el tubo de la cámara de flujo.
  9. Canalice la mezcla de traducción de la entrada del canal de flujo, transfiérala a un tubo de microcombustible y congele la solución colocando el tubo en nitrógeno líquido. Más tarde almacenar a -80 °C.
  10. Lave el tubo de la bomba de jeringa tres veces con agua libre de RNase, luego tres veces con 70% de etanol. Retire el 70% de etanol en el tubo de la bomba de jeringa para su almacenamiento.
  11. Apague el microscopio y todos los accesorios. limpiar.

6. Análisis de datos

NOTA: El análisis de datos para este ensayo requiere métodos comunes en estudios biofísicos de molécula única. Todos los pasos computacionalmente intensivos se pueden lograr utilizando algoritmos y software existentes (las referencias se incluyen a continuación en sus pasos correspondientes).

  1. Opcional: Si procede, convierta el archivo de serie de imágenes adquirido a un formato compatible con el software de procesamiento de imágenes o el lenguaje de programación elegidos.
  2. Determine el punto de partida de la reacción de traducción y el tiempo de intercambio del reactivo.
    NOTA: Debido a los anticuerpos fluorescentes que difusan en la mezcla de traducción, la intensidad de fluorescencia de fondo de un área con imágenes aumentará durante el intercambio de reactivos en canal, desde el búfer compatible con la traducción hasta la mezcla de traducción. El punto de partida de la reacción de traducción se establece como el punto de tiempo cuando se completa el intercambio de reactivos. Este punto de finalización se encuentra midiendo la intensidad de fluorescencia de fondo durante la entrega de la mezcla de traducción e identificando el punto de tiempo cuando la creciente intensidad de fluorescencia se estanca15,como se describe a continuación.
    1. Calcule los recuentos totales de fluorescencia por fotograma de imagen y trace el perfil de tiempo correspondiente. Identifique el aumento repentino de la fluorescencia total en la gráfica de perfil de tiempo.
      NOTA: El aumento total de la fluorescencia se debe a la creciente concentración de anticuerpos etiquetados fluorescentemente durante el intercambio de reactivos.
    2. Identifique el punto final de la fase de aumento total de fluorescencia y establezca este punto de tiempo como el punto de partida (es decir, el tiempo 0) de la reacción de traducción. Identifique los puntos inicial y final de la fase de aumento total de fluorescencia y establezca la diferencia de tiempo como el tiempo de intercambio reactivo.
      NOTA: El intervalo de tiempo total del intercambio de reactivos depende de las dimensiones del canal de flujo y del caudal seleccionado. Es posible que algunos factores de traducción puedan comenzar a enlazar al ARN antes de que se complete el intercambio de reactivos, lo que podría reducir la resolución del tiempo de inicio determinado de la primera ronda. Por lo tanto, se recomienda probar diferentes caudales al configurar el ensayo y seleccionar caudales que permitan la finalización del cambio de reactivos dentro de 3-4 s para velocidades de adquisición de datos de 0,5-2 s/trama.
  3. Opcional: Realice la corrección de deriva de película.
    NOTA: Las posiciones de los anticuerpos unidos en la imagen de datos pueden cambiar con el tiempo debido a la deriva de las piezas y accesorios del microscopio. La deriva que se nota visualmente en una película requiere corrección antes de continuar con el análisis de datos. Varios algoritmos y scripts de corrección de deriva espacial están disponibles36,37,38.
    1. En cada imagen, busque la máxima local en los recuentos de píxeles para determinar las posiciones de los anticuerpos enlazados en cada fotograma con precisión a nivel de píxel. Establezca un umbral para el recuento de píxeles de modo que solo se seleccionen los puntos que están claramente por encima del ruido de fondo.
    2. Calcule los cambios de posiciones individuales de anticuerpos en cada dirección entre dos fotogramas de imagen consecutivos.
    3. Trace el histograma de los cambios posicionales de anticuerpos entre dos fotogramas consecutivos y hádalo por separado para cada dirección. Gaussian se ajusta a cada histograma y establece la posición central de los picos como la deriva direccional entre dos fotogramas consecutivos.
    4. Para contrarrestar la deriva observada, cambie cada fotograma de imagen en la dirección opuesta por la cantidad de deriva calculada.
  4. Construir trayectorias de una sola molécula.
    NOTA: El software de detección/seguimiento está disponible para identificar puntos brillantes y extraer sus intensidades de la serie de imágenes de datos39,40.
    1. Identifique las posiciones de anticuerpos como se describe en el paso 6.3.1.
      NOTA: Se recomienda una inspección visual para asegurarse de que el umbral elegido no dé lugar a una sobre-o sub-selección excesiva de partículas. La inspección visual se puede lograr superponiendo las posiciones centroide identificadas sobre cada fotograma de imagen y evaluando visualmente su acuerdo (consulte Resultados representativos).
    2. Combine las partículas seleccionadas de todos los fotogramas y elimine las posiciones de partículas redundantes.
    3. Inspeccione visualmente las imágenes de anticuerpos enlazados y seleccione un área cuadrada que encierre los píxeles con recuentos claramente por encima del fondo y representativos de anticuerpos enlazados individualmente.
      NOTA: La función de dispersión de puntos (es decir, el tamaño del cuadrado para una sola molécula) está determinada por la configuración óptica y el tamaño del píxel del detector.
    4. Para cada posición de partícula, construya una trayectoria de una sola molécula calculando la intensidad total de todos los píxeles en el área cuadrada alrededor de la posición de la partícula. Las trayectorias se construyen para cada posición, fotograma por fotograma y para toda la película de datos.
  5. Opcional: Aplique un filtro hacia atrás no lineal41 para reducir el ruido de fondo en trayectorias de una sola molécula.
  6. Opcional: Digitalice trayectorias con algoritmos de detección de pasos existentes42,43,44,45.
    NOTA: La elección del algoritmo de detección de pasos depende de la complejidad de la dinámica de una sola molécula. Para el escenario más simple de traducción ribosoma aislada (es decir, sin formación de polisomas) y buena relación señal-ruido, una aplicación umbral a los recuentos de fluorescencia es suficiente para identificar el momento de los eventos de unión y disociación de anticuerpos en las trayectorias de una sola molécula. Se recomienda la inspección visual de al menos 100 trayectorias para cada condición para asegurarse de que los pasos de trayectoria se han seleccionado adecuadamente mediante una estrategia de detección de pasos.
  7. Determine la hora del primer evento de enlace de anticuerpos para cada trayectoria (es decir, la primera hora de llegada, t1),ya sea utilizando trayectorias digitalizadas o aplicando un umbral a trayectorias no oxidadas.
    NOTA: El valor medio de la primera distribución de hora de llegada se puede comparar entre diferentes condiciones de traducción. Como alternativa, la primera distribución de la hora de llegada se puede instalar en una función log-normal desplazada (3 parámetros) para determinar el valor medio15 <t1>. Debido a que la primera distribución de la hora de llegada es típicamente sesgada y tiene una cola larga, no calcule la media promediando directamente sobre las primeras horas de llegada observadas.
  8. Opcional: Análisis de tiempo de permanencia y cálculo de la tasa media de síntesis de péptidos.
    1. Utilice trayectorias digitalizadas para identificar eventos de traducción monosómicos (solo ribosomas) en cada trayectoria y calcule los tiempos de permanencia del evento de enlace único como la diferencia de tiempo entre los eventos de unión y disociación de anticuerpos correspondientes.
      NOTA: Los algoritmos de detección de pasos para digitalizar trayectorias suelen ser menos fiables cuando varios eventos moleculares se superponen en el tiempo. Por lo tanto, se recomienda excluir los eventos de polisoma del análisis del tiempo de permanencia. Para sistemas de traducción altamente activos que se enriquecen con eventos de polisoma y muestran con poca frecuencia eventos monosóricos, se puede utilizar una mezcla de anticuerpos etiquetados y sin etiquetar para aumentar la probabilidad de observar eventos de traducción aislados en trayectorias de molécula única.
    2. Ajuste la distribución a una función log-normal y utilice la función ajustada para calcular el tiempo medio de permanencia.
      NOTA: No se recomienda calcular la media directamente promediando los tiempos de permanencia observados porque las distribuciones de tiempo de permanencia suelen estar sesgadas con colas largas.
    3. Determinar el número de aminoácidos que se traducen durante el tiempo de permanencia de unión de anticuerpos restando la suma de la longitud del aminoácido del epitopo y 35 (la longitud media del aminoácido del péptido naciente dentro del túnel de salida ribosoma) del número total de codón ORF.
    4. Para determinar la tasa media de síntesis de péptidos, divida el número de aminoácidos traducidos por el tiempo medio de permanencia.
  9. Opcional: Cálculo del tiempo medio de inicio de la primera ronda (<t1_I>).
    NOTA: Las condiciones de iniciación y alargamiento, como el contexto de secuencia del sitio de iniciación y la secuencia de codificación, generalmente se conservan deliberadamente para estudios de cinética de iniciación. Por lo tanto, la hora media de llegada <t1> desde el paso 6.7. se puede utilizar directamente para calcular el cambio en la cinética de inicio de la primera ronda entre diferentes condiciones. La siguiente corrección sólo es necesaria para determinar el valor real del tiempo de inicio de la primera ronda.
    1. Divida la suma de la longitud del epítopo y 35 (la longitud media del aminoácido del péptido naciente dentro del túnel de salida ribosoma) por la tasa media de síntesis de péptidos (desde el paso 6.8.4.) para calcular el tiempo medio de alargamiento peptídico de esta región N-terminal (<t1_tag>).
    2. Como la primera hora de llegada es la suma de la hora de inicio de la primera ronda y t1_tag, reste <t1_tag> del tiempo medio de primera llegada <t1> para calcular el tiempo medio de inicio de la primera ronda <t1_I>: <t1_I> = lt t1> - <t1_tag>

7. Calibración del ensayo

NOTA: Realice los siguientes pasos de calibración al establecer inicialmente el ensayo.

  1. Para examinar la especificidad del enlace de anticuerpos, realice los pasos de protocolo en las secciones 4 y 5 por separado para los mRNAs sin etiquetar y etiquetados (Figura 2). Los niveles de unión de anticuerpos en canales con estos respectivos mRNAs representan el alcance de la unión de anticuerpos no específicos a la superficie de detección y la unión específica de anticuerpos al péptido naciente.
    NOTA: Se recomienda que la relación de unión específica a inespecífica sea >10 y puede aumentarse con diferentes estrategias de pasivación superficial, menor concentración de anticuerpos o mayor densidad de superficie de ARNm.
  2. Para medir la tasa de unión de anticuerpos, realice el protocolo con un paso adicional entre el paso 4 y el paso 5.
    1. Después del paso 4, incuba el canal con una mezcla de traducción que carece de anticuerpos para pre-generar complejos de ARNM/ribosoma/péptido.
    2. A continuación, proceda al paso 5 y fluya la mezcla de traducción suplementada con anticuerpos en el canal.
    3. Cuantificar la tasa media de unión de anticuerpos al péptido naciente pregenerado con ajuste exponencial al histograma de la primera hora de llegada.
      NOTA: La unión de anticuerpos al péptido generado previamente debe ser rápida, en el orden de los segundos, y debe ser más rápida que la cinética de traducción. Se puede utilizar una mayor concentración de anticuerpos para aumentar la tasa de unión de anticuerpos.
  3. Fototabilidad de anticuerpos etiquetados con fluoroforo.
    1. Prepare una diapositiva según el protocolo en el paso 2, pero omita el paso PEGylation. Monte la cámara de flujo después del paso de salinización. El recubrimiento de silano permite una unión eficiente de anticuerpos no específicos a la superficie de detección.
    2. Agregue los anticuerpos etiquetados fluorescentemente en el canal para lograr una densidad de molécula única de unión de anticuerpos no específicos a la superficie de detección. Comience añadiendo anticuerpos con etiqueta fluorescente que esté altamente diluido en el tampón de lavado T50 y aumente gradualmente la concentración de anticuerpos hasta que se alcance la densidad deseada de una sola molécula.
    3. Imagine la superficie de detección hasta que la mayor parte de la fluorescencia de anticuerpos ya no sea detectable.
    4. Trace el número total de anticuerpos visibles a lo largo del tiempo para evaluar la tasa de pérdida de fluorescencia de anticuerpos debido al fotobleaching de fluoroforo.
      NOTA: El etiquetado de anticuerpos normalmente produce múltiples fluoróforos por anticuerpo. Los anticuerpos individuales permanecen detectables hasta que todos los fluoróforos conjugados fotobleach.

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Resultados

Seguir el protocolo descrito permite la toma de imágenes de interacciones individuales de anticuerpos con polipéptidos incipientes etiquetados con N-terminal con resolución de molécula única durante la traducción activa sin células de ARN de reportero de anclaje final de 3 ' (Figura 1). Se informa de un experimento de demostración mínimo con el uso de tres mRNAs sintéticos: LUC (codificación luciferasa sin etiquetar), LUCFLAG (codificación 3x...

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Discusión

En comparación con los experimentos típicos in vitro de una sola molécula TIRF, la imagen de una sola molécula con el ensayo descrito aquí es adicionalmente compleja debido al uso de extracto celular y una alta concentración de anticuerpos etiquetados fluorescentemente. En comparación con la práctica más común de una ronda de superficie PEGylation, una segunda ronda de PEGylation (paso 2) reduce en gran medida la unión de anticuerpos no específicos a la superficie de detección15

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R01GM121847]; el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); y mskcc iniciativa genómica funcional.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
100X oil objective, N.A. 1.49OlympusUAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1)Bio-Rad161-0144
Alkaline liquid detergentDecon5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)UCT Specialties, LLCA0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCDAndorDU-897U-CSO-#BV
Andor Solis softwareAndorFor controlling the Andor EMCCD
Band-pass filterChroma532/640/25
Band-pass filterChromaNF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVALaysan Bio IncBiotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acidProlume309-250
Coolterm softwareFor controlling the syringe pump
Desktop computerDellFor controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirrorSemrockR405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNXFisher ScientificNC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
EpoxyDevcon14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acidProlume306-250
Glacial acetic acidFisher ScientificBP1185500
Hydrogen perioxideSigma-Aldrich216763-500ML
Immersion oilOlympusZ-81226ALow auto-fluorescence
Luciferase Assay SystemPromegaE1500
MEGASCRIPT T7 Transcription KitThermo fisherAM1334
MethanolFisher ScientificMMX04751
MicroscopeOlympusIX83
Microscope slideThermo Scientific3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3Sigma-AldrichA9594
mPEG-SVALaysan Bio IncmPEG-SVA-5000
MS(PEG)4Thermo Scientific22341
NaCl (5M)Thermo ScientificAM9760G
No 1.5 microscope Cover glassFisherband12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mMOlympus digital Laser systemCMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl softwareOlympusFor controlling the laser intensity and incident angle
Optical tableTMC vibration control63-563With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mixSigma-Aldrich77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation KitThermo Scientific20160
Potassium hydroxide pelletsSigma-AldrichP1767-500G
Prior motorized XY translation stagePriorPS3J100
Prior PriorTest softwarePriorFor controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase InhibitorPromegaN2515
Stage top IncubatorIn vivo scientific (world precision Instruments)98710-1With a custom built acrylic cage
Staining jarFisher Scientific08-817
StreptavidinThermo Scientific43-4301
Sulfuric acidFisher ScientificA300212
SYBR green IIFisher ScientificS7564
SyringeHamilton1725RN
Syringe pumpHarvard apparatus55-3333
Tris (1M), pH = 7.0Thermo ScientificAM9850G
Ultrasonic BathBransonCPX1800H
UreaSigma-AldrichU5378-500G
Vaccinia Capping systemNew England BiolabsM2080S
Zymo-Spin IC ColumnsZymo ResearchC1004

Referencias

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