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  • 材料
  • 参考文献
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摘要

在这里，我们设计了两个互补的质谱流式细胞术 （CyTOF） 面板并优化了 CyTOF 染色方案，目的是在病毒感染的情况下分析自然杀伤细胞受体和配体库。

摘要

自然杀伤 （NK） 细胞是病毒感染的第一反应者之一。NK 细胞快速识别和杀死病毒感染细胞的能力受其种系编码的抑制和激活受体表达的调节。这些受体通过其同源配体与靶细胞的结合决定了细胞间相互作用是否会导致 NK 细胞杀伤。该协议详细介绍了两种互补质谱流式细胞术 （CyTOF） 面板的设计和优化。一个面板旨在根据受体表达对 NK 细胞进行表型分析。另一个面板旨在询问几个免疫细胞亚群上 NK 细胞受体的已知配体表达。这两个 panel 一起允许分析人 NK 细胞受体-配体库。此外，该协议还详细说明了我们对 CyTOF 样品进行染色的过程。该工艺已经过优化，以提高可重复性和标准化。CyTOF 的一个优点是它能够测量每个面板中的 40 多个标记物，并且信号重叠最小，使研究人员能够捕获 NK 细胞受体-配体库的广度。Palladium 条形码还减少了样品间的差异以及试剂的消耗，从而更容易使用每个面板平行对样品进行染色。该方案的局限性包括 CyTOF 的通量相对较低以及分析后无法恢复细胞。这些检测组合设计用于分析急性和慢性病毒感染（包括登革热病毒、人类免疫缺陷病毒 （HIV） 和流感）患者的临床样本。然而，它们可用于任何环境来研究人类 NK 细胞受体-配体库。重要的是，这些方法可以广泛应用于未来 CyTOF panel的设计和执行。

引言

自然杀伤 （NK） 细胞是先天免疫细胞，其主要作用是靶向和杀死恶性、感染或其他应激细胞。通过分泌 IFNγ 和 TNFα 等细胞因子以及它们的细胞毒活性，NK 细胞还可以塑造对病原体和恶性肿瘤的适应性免疫反应。NK 反应部分由种系编码的抑制和激活受体的组合信号介导，这些受体结合潜在靶细胞上表达的无数配体。几种 NK 细胞受体具有不止一种配体，并定期鉴定新的受体-配体对。

在病毒感染的背景下研究 NK 细胞特别感兴趣，它们对应激细胞的快速反应能力可能会限制病毒传播或促进 NK 细胞逃避策略的发展。对 NK 细胞生物学的兴趣延伸到癌症免疫治疗领域，研究人员正在研究 NK 细胞在肿瘤免疫监视和肿瘤微环境中的作用1。然而，由于人类 NK 细胞可以表达 30 多种受体，而这些受体又可以与 30 多种已知配体相互作用，因此分析 NK 细胞-靶细胞相互作用的能力变得复杂2。因此，同时检测多个 NK 细胞受体及其同源配体对于捕获控制 NK 功能的受体-配体相互作用的复杂性是必要的。因此，我们转向质谱流式细胞术 （CyTOF），它可以在单个细胞水平同时检测 40 多种标志物。我们的目标是创建两个 CyTOF panel 来分析 NK 细胞受体-配体库。我们还想设计一种有效处理和染色临床样本的方案。临床人体样本提供了有关身体如何应对病毒感染的大量信息。因此，我们开发了该方案来平行研究 NK 细胞受体及其同源配体的表达，以实现更好的标准化、提高回收率、减少试剂消耗和限制批次效应。

之前已经发表了几种旨在表征人 NK 细胞表型的流式细胞术panel 3,4,5,6,7,8。这些 panel 中的大多数在捕获受体-配体库的宽度的能力方面受到限制，仅允许检测有限的标记选择。此外，这些检测组合受到荧光染料之间信号重叠的限制。CyTOF 使用与金属同位素偶联的抗体，这些抗体通过飞行时间质谱法读出，从而大大减少了通道之间的溢出。

和我们一样，其他研究人员也转向 CyTOF 来研究 NK 细胞9、10、11、12、13、14，尽管通常 NK 细胞标志物较少，这降低了表型的深度。虽然这些小组使用的一般染色方案与我们的相似，但也存在一些关键差异。其他方案不涉及在染色前分离 NK 细胞，即使研究人员只对该亚群感兴趣13,14。鉴于 NK 细胞仅占外周血单核细胞 （PBMC） 的 5-20%，对全 PBMC 染色而不是分离的 NK 细胞意味着大多数收集的事件不会是 NK 细胞。这会减少在感兴趣的子集上生成的数据量，并导致机器时间的利用效率低下。此外，虽然其中许多面板询问了 NK 细胞受体的表达，例如杀伤性 Ig 样受体 （KIR）、NKG2A/C/D 和天然细胞毒性受体（NKp30、NKp44 和 NKp46），但由于缺乏有关其各自配体表达的数据，这些标志物的表达没有被置于更广泛的背景下。因此，虽然这些先前发表的通过 CyTOF 研究 NK 细胞的方法足以进行广泛的 NK 细胞表型分析，但单独使用时，它们无法提供 NK 细胞活性的全面图片。这为我们带来了此处描述的方法的主要优势，即到目前为止，还没有已发表的流式细胞术或 CyTOF panel专注于探索 NK 细胞受体配体的表达。重要的是，我们的配体检测组合具有多个开放通道，允许添加标记物，以满足每个实验的独特需求。

考虑到 CyTOF 的主要限制之一是分析后无法回收样品，这种方法可能不适用于样品有限但有兴趣进行额外实验的研究人员。此外，CyTOF 的低通量特性意味着如果起始细胞数较低，生成的数据质量将很差。如果没有这两个限制，这种方法在任何环境中都表现良好，以研究 NK 细胞和靶细胞之间的受体-配体相互作用。

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研究方案

匿名健康成人 PBMC 是从斯坦福血液中心购买的白细胞减少系统腔室中获得的。来自去识别化的健康儿科捐献者和儿科急性登革热患者的 PBMC 是从巴拿马城巴拿马城的 Gorgas 纪念健康研究所和属于卫生部、巴拿马城社会保障系统和郊区的医院获得的。登革热研究方案由尼诺医院 IRB （CBIHN-M-0634） 批准，然后由 ICGES、CSS、圣托马斯医院和斯坦福大学委员会批准。接受抗逆转录病毒治疗的 HIV 感染患者的 PBMC 来自 ACTG 研究 A5321。

1. 抗体标记、panel制备和储存

  1. 用金属同位素标记抗体
    注：为了提高染色的实验间标准化，建议对每种抗体进行多次偶联，然后将产物合并为单个预混液，以便长期储存，如下所述。
    1. 通过在偶联前测量 280 nm 处的吸光度来确定每种抗体的浓度。用于该方案的抗体是市售的，可从 材料表中列出的供应商处购买。
    2. 根据制造商的说明，使用市售的抗体标记试剂盒用金属同位素标记抗体。每个反应使用 100 μg 抗体。
    3. 通过测量 280 nm 处的吸光度来确定回收抗体的最终浓度。将抗体短期储存在 4 °C。
  2. 抗体滴定
    注意：CyTOF 技术对来自环境金属的潜在污染信号非常敏感。因此，使用的所有缓冲液/试剂都应使用超纯水制备，并储存在从未用肥皂清洗过的塑料或玻璃容器中。
    1. 为每个供体准备离心管，每瓶待解冻的 PBMC 含有 9 mL 温热的完全 RPMI（RPMI 1640、10% FBS、1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素）和 20 μL 苯并酶。在水浴中解冻 PBMC 并添加到试管中。
      注：Benzonase 可降低裂解细胞中游离 DNA 的粘度和背景。
    2. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。将 PBMC 重悬于 5 mL 完整 RPMI 培养基中并计数。
    3. 对于每个面板滴定，将 2-400 万个 PBMC/孔接种在圆底 96 孔板的 6 个孔中（每个滴度一个孔，一个未染色孔）。在室温下以 600 x g 离心板 3 分钟。轻弹板以去除上清液。将每个孔重悬于 200 μL CyPBS 中。
    4. 如下所述进行顺铂活力染色。
      注意：顺铂用于在质谱细胞术中区分活细胞和死细胞。
      1. 将细胞重悬于 100 μL 的 25 μM 顺铂原液中。在室温下孵育 1 分钟。
      2. 通过向每个孔中加入 100 μL FBS 并混合来淬灭顺铂反应。离心并轻弹板。
        注：在 4 °C 下执行所有后续离心步骤。
      3. 用 200 μL CyFACS（1x PBS，在含 0.1% BSA、0.05% 叠氮化钠的超纯水中不含重金属污染物）洗涤细胞两次。每次离心并轻弹板。
    5. 如下所述滴定表面抗体面板。
      注：应为 NK 表面面板和配体面板制备单独的预混液。
      1. 使用 CyFACS 制备浓度为 10 μg/mL 的所有表面抗体的预混液。最终体积为 150 μL。使用 CyFACS 进行连续 1：2 稀释，以获得以下浓度：10、5、2.5、1.25 和 0.625 μg/mL。
      2. 染色前，通过离心过滤装置（0.1 μm 孔径）以 10,600 x g 的离心过滤抗体混合物 3 分钟。
      3. 将铺板的细胞以相应的滴度重悬于 50 μL 表面抗体混合物中。在 CyFACS 中重悬未染色的孔。在 4 °C 孵育 30 分钟。
      4. 用 150 μL CyFACS 洗涤细胞。离心并轻弹板。
      5. 用 200 μL CyFACS 洗涤细胞。离心并轻弹板。
    6. 通过将每个孔重悬于 100 μL 2% 多聚甲醛 （PFA） 的 CyPBS 溶液中来固定细胞。将板在室温下避光孵育 20 分钟。用 100 μL CyFACS 洗涤细胞。以 700 x g 离心 5 分钟。
      注意：PFA 被怀疑会导致遗传缺陷和癌症。此外，如果它与眼睛、皮肤接触或被吸入，则有害。通过确保良好的通风、小心打开容器并防止形成气溶胶来适当处理。
      注：所有后续离心机离心均在 4 °C 下以 700 x g 进行 5 分钟。
    7. 通过在 200 μL 用超纯水中稀释的 1x 透化缓冲液（透化缓冲液）中重悬来透化细胞。离心并轻弹板。用 200 μL Perm 缓冲液洗涤细胞。离心并轻弹板。
      注意：无需在 Perm 缓冲液中孵育。
    8. 细胞内抗体面板滴定
      1. 使用 Perm 缓冲液制备浓度为 10 μg/mL 的所有细胞内抗体的预混液。最终体积为 150 μL。使用 Perm 缓冲液进行 1：2 的连续稀释，以获得以下浓度：10、5、2.5、1.25 和 0.625 μg/mL。
      2. 染色前，通过离心过滤装置（0.1 μm 孔径）以 10,600 x g 的离心过滤抗体混合物 3 分钟。
      3. 将铺板的细胞重悬于 50 μL 细胞内抗体混合物中，达到相应的滴度。在 Perm 缓冲液中重悬未染色的孔。在 4 °C 孵育 45 分钟。
        注：如果不打算滴定细胞内面板，请将孔重悬于 50 μL Perm 缓冲液中。
      4. 用 150 μL Perm 缓冲液洗涤细胞。离心并轻弹板。
      5. 用 200 μL Perm 缓冲液洗涤细胞。离心并轻弹板。
      6. 用 200 μL CyFACS 洗涤细胞两次。离心并轻弹板。
    9. DNA 嵌入剂染色
      注：嵌入剂与细胞核酸结合，用于在质谱流式细胞术中鉴定有核细胞。
      1. 将细胞重悬于 200 μL 在 CyPBS 和 2% PFA 中以 1：10,000 稀释的插层中。将板在 4 °C 下孵育过夜。
      2. 如果需要，将板在 4°C 下用石蜡膜覆盖长达一周。
        注：在 4 °C 下以 700 x g 的速度执行所有后续离心步骤 5 分钟。
      3. 在 CyTOF 上运行样品之前，从板中取出石蜡膜，并在 4 °C 下以 700 x g 离心 5 分钟。 轻弹板。用 200 μL CyFACS 洗涤细胞一次。离心并轻弹板。
      4. 用 200 μL 超纯水洗涤细胞 3 次。离心并轻弹板。将细胞重悬于 200 μL 超纯水中。在运行样品之前，将浓度调整至约 6 x 105 个细胞/mL，在超纯水中稀释至 1 倍浓度的标准化微珠中。
    10. 在 CyTOF 上运行样品。
    11. 通过选择最低的抗体滴度来分析数据并为每种抗体选择合适的滴度，从而根据目视评估获得最高的信号强度和阳性和阴性群体之间的最佳分离。
      注：NK 和配体面板的滴定分别如图 1 和 图 2 所示。如果未明确区分阳性和阴性细胞群，则可以评估多种细胞类型或细胞系的滴度，以便识别阳性和阴性细胞群。
    12. 抗体组合储存
      1. 将滴定的抗体混合到预混液中，并通过无菌 0.1 μm 针式过滤装置进行过滤。应为 NK 表面面板、NK 细胞内面板和配体面板制备单独的预混液。
      2. 对于面板的长期存放，请遵循以下两个可接受的选项之一：
      3. 将预混液送至第三方公司进行冻干。这种方法用于 NK 面板。由于存在抗体稳定剂，因此不能进行冻干，因此不能进行冻干。这些抗体在染色当天添加到面板中。
      4. 使用连续移液器将每种预混液制成 50 μL 等分试样，并将其储存在 -80 °C 下。

2. 染色方案

  1. 如步骤 1.2.1 和 1.2.2 中所述解冻外周血单核细胞 （PBMC）。留出至少 100 万个 PBMC 用于 15 mL 离心管中的配体面板染色。在 NK 细胞分离期间将这些 PBMC 保存在冰上。
  2. NK 细胞分离
    注：以下 NK 细胞分离步骤是特定供应商方案的修改版本。然而，任何对 NK 细胞进行基于磁性的阴性选择的试剂盒或方案都是合适的选择。此外，此步骤是可选的，因为该方案也适用于来自整个 PBMC 的 NK 细胞的表型分析。
    1. 将剩余的 PBMC 以 450 x g 旋转 5 分钟。每 107 个总细胞将细胞沉淀重悬于 40 μL MACS 缓冲液（PBS、0.5% BSA、2 mM EDTA）中。
    2. 每 107 个总细胞添加 10 μL NK 细胞生物素抗体混合物。充分混合并在冰上孵育 5 分钟。
    3. 每 107 个总细胞添加 30 μL MACS 缓冲液，每 107 个总细胞添加 20 μL NK 细胞 MicroBead 混合物。充分混合并在冰上孵育 10 分钟。
    4. 用 500 μL MACS 缓冲液冲洗，制备洗脱柱。将 2 mL 冷完全 RPMI 添加到 15 mL 收集管中。
    5. 将 MACS 缓冲液添加到含有细胞的试管中，使体积达到 500 μL。将整个 500 μL 体积移液到准备好的洗脱柱上。用另外 500 μL MACS 缓冲液冲洗试管并转移到色谱柱中。
    6. 液流停止后，用 500 μL MACS 缓冲液冲洗洗脱柱两次。流停止后，对 NK 细胞进行计数。
  3. 铺板和洗涤细胞。
    1. 在室温下以 300 x g 离心分离的 NK 细胞和 PBMC 10 分钟。在 CyPBS（1x PBS，在超纯水中不含重金属污染物）中以 500 万个细胞/mL 的浓度重悬细胞。在 U 形底 96 孔板中接种细胞。
      注：NK 细胞检测组合的每等分试样可染色多达 300 万个细胞。如果在染色前对 6 个单独的 NK 细胞样品进行条形码编码和合并，则 NK 细胞的总总数不应超过 300 万个。配体检测组合每个样品可染色多达 600 万个 PBMC。如果在染色前对 6 个单独的样品进行条形码标记和合并，则 PBMC 的总总数不应超过 600 万个。
    2. 在室温下以 600 x g 离心板 3 分钟。轻弹板以去除上清液。
      注：以 600 x g 的速度进行所有后续离心机离心 3 分钟，直至第 2.7 步。
    3. 将细胞重悬于 200 μL CyPBS 中。离心并轻弹板。
  4. 如步骤 1.2.4 中所述进行顺铂活力染色。
  5. 条形码染色
    注：这些检测组合与改良的 4 分之二、基于 Palladium 的条形码方法结合使用，用于未固定的活细胞，以最大限度地减少批次效应并最大限度地提高细胞回收率15。但是，此步骤是可选的，因为无需条形码即可获得质量数据。
    1. 将每个孔重悬于 50 μL 相应的预混条形码中，并在 4 °C 下孵育 30 分钟。用 150 μL CyFACS 洗涤细胞。离心并轻弹板。
    2. 用 200 μL CyFACS 洗涤细胞两次。离心并轻弹板。将所有孔重悬于 30 μL CyFACS 中。将最多 6 个用独特条形码染色的细胞孔合并到一个孔中，然后进行离心和轻弹板。
  6. 表面染色
    1. 将表面 NK 面板冻晶球溶解在 50 μL CyFACS 中，并加入额外的表面抗体（抗 CD16、抗 HLA-DR、抗 LILRB1）。解冻储存在 -80 °C 的配体面板，并使用微型离心机旋转管。其他配体面板表面标志物（抗 CD16、抗 CD19）的加标。
      注：任何先前未过滤的抗体混合物（即冻干或冷冻之前）应在染色前通过 10,600 x g 的离心过滤装置（0.1 μm 孔径）过滤 3 分钟。
    2. 将每个孔重悬于 50 μL 的相应检测组合中。在 4 °C 孵育 30 分钟。用 150 μL CyFACS 洗涤细胞。离心并轻弹板。用 200 μL CyFACS 再次洗涤细胞。离心并轻弹板。
  7. 按照步骤 1.2.6 中的说明修复单元格。
    注：在 4 °C 下以 700 x g 的速度离心 5 分钟。
  8. 如步骤 1.2.7 中所述透化细胞。
  9. 细胞内染色
    1. 将细胞内 NK 面板冻晶球溶解在 50 μL Perm 缓冲液中。如果需要，为 PBMC 样品制备细胞内抗体混合物。
      注：任何先前未过滤的抗体混合物（即冻干或冷冻之前）应在染色前通过 10,600 x g 的离心过滤装置（0.1 μm 孔径）过滤 3 分钟。
    2. 将孔重悬于 50 μL 的相应细胞内面板中。如果细胞内检测组合未与配体表面检测组合结合使用，则将 PBMC 孔重悬于 50 μL Perm 缓冲液中。在 4 °C 孵育 45 分钟。
    3. 用 150 μL Perm 缓冲液洗涤细胞。离心并轻弹板。用 200 μL Perm 缓冲液洗涤细胞。离心并轻弹板。
    4. 用 200 μL CyFACS 洗涤细胞两次。离心并轻弹板。
  10. DNA 嵌入剂染色。如步骤 1.2.9.1 中所述进行 DNA 嵌入剂染色。将板在 4 °C 下孵育过夜。
    注：嵌入剂与细胞核酸结合，用于在质谱流式细胞术中鉴定有核细胞。板可以在 4 °C 下覆盖石蜡膜储存长达一周。
  11. 在 CyTOF 上运行样品之前，请按照步骤 1.2.9.3 和 1.2.9.4 中的说明洗涤细胞。
  12. 在 CyTOF 上运行样品。

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结果

根据制造商的说明，使用市售标记试剂盒将抗体与金属同位素偶联。抗体克隆在用于该组合之前通过流式细胞术和质谱流式细胞术进行验证。根据文献回顾和抗体可用性选择初始克隆列表。NK 细胞受体的一些配体的表达水平在健康的 PBMC 上很低或检测不到。因此，通过对健康的 PBMC、慢性粒细胞白血病 K562 细胞、急性淋巴细胞白血病 NALM6 细胞或 B ...

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讨论

在这里，我们描述了两个互补的 CyTOF panel 的设计和应用，旨在分析 NK 细胞受体-配体库。该协议包括对获得高质量数据至关重要的几个步骤。CyTOF 使用重金属离子而不是荧光染料作为抗体的标记探针19。因此，该技术会受到来自环境金属的潜在污染信号的影响 20。金属杂质的潜在来源包括实验室洗洁精（钡）和实验室缓冲液（汞、铅、?...

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披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

作者要感谢 Blish 实验室的所有现任和前任成员，他们为本次小组会议做出了贡献。感谢艾滋病临床试验组和 ACTG A5321 团队以及 Gorgas Memorial Institute for Health Studies 的 Sandra López-Vergès 博士和 Davis Beltrán 的样本策展。最后，感谢 Michael Leipold、Holden Maecker 和斯坦福大学人类免疫监测中心使用他们的 Helios 机器。这项工作得到了 NIH U19AI057229、NIH R21 AI135287、NIH R21 AI130532、NIH DP1 DA046089 和 Burroughs Wellcome 基金研究人员的支持传染病发病机制 #1016687 到 CB、NIH Ruth L. Kirschstein 机构国家研究服务奖 T32 AI007502、TL1 TR001084 和 NIH/NIAID K08 AI138640 到 EV、美国国家科学基金会研究生研究奖学金 DGE-1656518 到 JM 和 NIH 培训补助金 T32-AI-007290（PI Olivia Martinez）。ACTG 研究获得了 AI-68634（统计和数据管理中心）、UM1-A1-26617、AI-131798 和 AI-68636 （ACTG） 的资助支持。CB 是斯坦福妇幼健康研究所儿科转化医学的 Tashia 和 John Morgridge 教师学者，也是 Chan Zuckerberg Biohub 的研究员。

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材料

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anti-KIR2DL3R&D SystemsMAB2014Clone 180701.
anti-KIR2DL5Miltenyi Biotec130-096-200Clone UP-R1.
anti-KIR2DS4R&D SystemsMAB1847Clone 179315.
anti-KIR3DL1BD Biosciences555964Clone DX-9.
anti-LFA-3Biolegend330902Clone TS2/9.
anti-LILRB1R&D Systems292319Clone MAB20172.
anti-LLT-1R&D SystemsAF3480Clone 402659.
anti-MICAR&D SystemsMAB1300-100Clone 159227.
anti-MICBR&D SystemsMAB1599-100Clone 236511.
anti-Nectin-1Biolegend340402Clone R1.302.
anti-Nectin-2Biolegend337402Clone TX31.
anti-NKG2AR&D SystemsMAB1059Clone 131411.
anti-NKG2CR&D SystemsMAB1381Clone 134522.
anti-NKG2DBiolegend320802Clone 1D11.
anti-NKp30Biolegend325202Clone P30-15.
anti-NKp44Biolegend325102Clone P44-8.
anti-NKp46Biolegend331902Clone 9E2.
anti-NTB-ABiolegend317202Clone NT-7.
anti-Pan HLA class IBiolegend311402Clone W6/32.
anti-PD1Biolegend329902Clone EH12.2H7.
anti-PerforinAbcamab47225Clone B-D48.
anti-Siglec-7Biolegend347702Clone S7.7.
anti-SykBiolegend644302Clone 4D10.2.
anti-TACTILEBiolegend338402Clone NK92.39.
anti-TIGITR&D SystemsMAB7898Clone 741182.
anti-ULBP-1R&D SystemsMAB1380-100Clone 170818.
anti-ULBP-2, 5, 6R&D SystemsMAB1298-100Clone 165903.
Antibody StabilizerCandor Bioscience131 050
Benzonase NucleaseMillipore70664
Bond-Breaker TCEP SolutionThermo Fisher Scientific77720
Bovine Serum Albumin solutionSigma-AldrichA9576
Calcium chloride dihydrate (CaCl2+2H2O)Sigma-Aldrich223506-25G
Cis-Platinum(II)diamine dichloride (cisplatin)Enzo Life SciencesALX-400-040-M250A 100 mM stock solution was prepared in DMSO and divided into 25 µL aliquots. Used at a 25 µM dilution for live/dead stain. Signal appears in 194Pt and 195Pt channels.
DMSOSigma-AldrichD2650
eBioscience Permeabilization BufferThermo Fisher Scientific00-8333-56
EDTA (0.5 M)HoeferGR123-100A double-concentrated HEPES buffer with EDTA was made according to the following recipe: 1.3 g NaCl (Thermo Fisher Scientific), 27 mg CaCl2+2H2O (Sigma-Aldrich), 23 mg MgCl2 (Sigma-Aldrich), 83.6 mg KH2PO4 (Thermo Fisher Scientific), 4 mL of 1M HEPES (Thermo Fisher Scientific), 2 mL of 0.5M EDTA (Hoefer, Holliston, MA, USA), and 100mL H2O. The pH of this double-concentrated HEPES buffer was adjusted to a pH of 7.3 using 1M HCl and 1M NaOH.
EQ Four Element Calibration BeadsFluidigm201078
Fetal Bovine SerumThermo Fisher ScientificN/A
Helios mass cytometerFluidigmN/A
HEPES (1M)Thermo Fisher Scientific15630080
HyClone Antibiotic/Antimycotic Solution (Pen/Strep/Fungiezone) solutionFisher ScientificSV3007901
Iridium - 191Ir/193Ir intercalatorDVS Sciences (Fluidigm)201192BUsed at a 1:10000 dilution.
Isothiocyanobenzyl-EDTA (ITCB-EDTA)Dojindo Molecular Technologies, Inc.M030-10Diluted to 1.25 mg/mL in anhydrous acetonitrile.
K562 cellsAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC CCL-243
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher ScientificSH30034
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
Maxpar X8 Antibody Labeling KitsFluidigmN/ANo catalog number as kits come with metals. 
Millex-VV Syringe Filter Unit, 0.1 µmMilliporeSLVV033RS
Milli-Q Advantage A10 Water Purification SystemMilliporeZ00Q0V0WW
MS ColumnsMiltenyi Biotec
NALM6 cellsAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC CRL-3273
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 3KPall CorporationOD003C35
NK Cell Isolation Kit, humanMiltenyi Biotec130-092-657
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15710
PBSThermo Fisher Scientific10010023
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificMP021954531
Qdot 655 anti-CD19Thermo Fisher ScientificQ10179Clone SJ25-C1. Used at a 1:50 dilution. Signal appears in 112Cd-114Cd channels. 
Qdot 655 anti-HLA-DRThermo Fisher ScientificQ22158Clone Tü36. Used at a 1:200 dilution.
Rockland PBSRockland Immunochemicals, Inc.MB-008 Used to make CyPBS (10X Rockland PBS diluted to 1X in Milli-Q water) and CyFACS buffers (10X Rockland PBS diluted to 1X in Milli-Q water with 0.1% BSA and 0.05% sodium azide). Buffers were sterile-filtered through a 0.22 µM filter and sotred at 4°C in Stericup bottles. 
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific21870092
Sodium azide (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration SystemMillipore SigmaS2GPU10RE
Tuning solutionFluidigm201072
Washing solution Fluidigm201070

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