JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתכננים שני פאנלים משלימים של ציטומטריית מסה (CyTOF) ומייעלים פרוטוקול צביעה של CyTOF במטרה ליצור פרופיל של קולטן תאי ההרג הטבעי ורפרטואר הליגנד בהקשר של זיהומים ויראליים.

Abstract

תאי הרג טבעיים (NK) הם בין המגיבים הראשונים לזיהומים נגיפיים. היכולת של תאי NK לזהות ולהרוג במהירות תאים נגועים בנגיף מווסתת על ידי ביטוים של קולטנים מעכבים ומפעילים מקודדים בקו הנבט. המעורבות של קולטנים אלה על ידי הליגנדים הקוגנטיים שלהם על תאי המטרה קובעת אם האינטראקציה הבין-תאית תביא להרג תאי NK. פרוטוקול זה מפרט את התכנון והאופטימיזציה של שני לוחות ציטומטריית מסה משלימה (CyTOF). פאנל אחד תוכנן לפנוטיפ של תאי NK על סמך ביטוי הקולטן. הפאנל השני תוכנן לחקור ביטוי של ליגנדים ידועים לקולטני תאי NK במספר תת-קבוצות של תאים חיסוניים. יחד, שני הפאנלים הללו מאפשרים פרופיל של רפרטואר הקולטן-ליגנד של תאי NK אנושיים. יתר על כן, פרוטוקול זה מפרט גם את התהליך שבו אנו מכתימים דגימות עבור CyTOF. תהליך זה עבר אופטימיזציה לשיפור יכולת השחזור והסטנדרטיזציה. היתרון של CyTOF הוא היכולת שלו למדוד למעלה מ-40 סמנים בכל פאנל, עם חפיפה מינימלית של אותות, מה שמאפשר לחוקרים ללכוד את רוחב הרפרטואר של קולטן-ליגנד של תאי NK. ברקוד פלדיום גם מפחית את השונות בין הדגימות, כמו גם את צריכת הריאגנטים, מה שמקל על צביעת דגימות עם כל פאנל במקביל. המגבלות של פרוטוקול זה כוללות את התפוקה הנמוכה יחסית של CyTOF וחוסר היכולת לשחזר תאים לאחר הניתוח. לוחות אלה תוכננו לניתוח דגימות קליניות מחולים הסובלים מזיהומים נגיפיים חריפים וכרוניים, כולל נגיף דנגי, נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) ושפעת. עם זאת, ניתן להשתמש בהם בכל מסגרת כדי לחקור את רפרטואר הקולטן-ליגנד של תאי NK אנושיים. חשוב לציין, ניתן ליישם שיטות אלה באופן נרחב לתכנון וביצוע של לוחות CyTOF עתידיים.

Introduction

תאי הרג טבעיים (NK) הם תאי חיסון מולדים שתפקידם העיקרי הוא למקד ולהרוג תאים ממאירים, נגועים או סטרס אחר. באמצעות הפרשת ציטוקינים כגון IFNγ ו-TNFα, כמו גם פעילותם הציטוטוקסית, תאי NK יכולים גם לעצב את התגובה החיסונית הנרכשת לפתוגנים וממאירות. תגובת ה-NK מתווכת בחלקה על ידי איתות קומבינטורי של קולטנים מעכבים ומפעילים מקודדים בקו הנבט, הקושרים מספר עצום של ליגנדים המתבטאים בתאי מטרה פוטנציאליים. למספר קולטנים של תאי NK יש יותר מליגנד אחד עם זוגות קולטנים-ליגנדים חדשים המזוהים באופן קבוע.

יש עניין מיוחד בחקר תאי NK בהקשר של זיהומים ויראליים, כאשר יכולתם להגיב במהירות לתאי לחץ עשויה להגביל את התפשטות הנגיף או לקדם פיתוח אסטרטגיות התחמקות מתאי NK. עניין זה בביולוגיה של תאי NK משתרע על תחום האימונותרפיה של סרטן, שם חוקרים חוקרים את תפקידם של תאי NK במעקב חיסוני של גידול ובמיקרו-סביבת הגידול1. עם זאת, היכולת ליצור פרופיל של אינטראקציות בין תאי NK לתאי מטרה מסובכת בשל העובדה שתאי NK אנושיים יכולים לבטא למעלה מ-30 קולטנים אשר בתורם יכולים לקיים אינטראקציה עם למעלה מ-30 ליגנדים ידועים2. זיהוי בו-זמני של קולטני תאי NK מרובים והליגנדים הקוגנטיים שלהם הוא, אם כן, הכרחי כדי ללכוד את המורכבות של אינטראקציות הקולטן-ליגנד השולטות בתפקוד NK. כתוצאה מכך, פנינו לציטומטריית מסה (CyTOF), המאפשרת זיהוי בו זמנית של למעלה מ-40 סמנים ברמת התא הבודד. המטרה שלנו הייתה ליצור שני לוחות CyTOF כדי ליצור פרופיל של רפרטואר קולטן-ליגנד של תאי NK. רצינו גם לעצב פרוטוקול לעיבוד וצביעה יעילים של דגימות קליניות. דגימות אנושיות קליניות מספקות שפע של מידע על האופן שבו הגוף מגיב לזיהום ויראלי. לכן, פיתחנו פרוטוקול זה כדי לחקור את הביטוי של קולטני תאי NK והליגנדים הקוגנטיים שלהם במקביל לסטנדרטיזציה טובה יותר, התאוששות משופרת, צריכת ריאגנטים מופחתת והשפעות אצווה מוגבלות.

מספר לוחות ציטומטריית זרימה שנועדו לאפיין את הפנוטיפ של תאי NK אנושיים פורסמו בעבר 3,4,5,6,7,8. רוב הפאנלים הללו מוגבלים ביכולתם ללכוד את רוחב רפרטואר הקולטן-ליגנד, מה שמאפשר רק זיהוי של מבחר מוגבל של סמנים. יתר על כן, לוחות אלה מוגבלים על ידי חפיפת אותות בין פלואורוכרומים. CyTOF משתמש בנוגדנים מצומדים לאיזוטופים מתכתיים, הנקראים על ידי ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה, ובכך מפחיתים באופן דרמטי את הזליגה בין הערוצים.

כמונו, חוקרים אחרים פנו ל-CyTOF כדי לחקור תאי NK 9,10,11,12,13,14, אם כי בדרך כלל עם פחות סמנים של תאי NK, מה שמפחית את עומק הפנוטיפ. בעוד שפרוטוקולי הצביעה הכלליים המשמשים את הקבוצות הללו דומים לשלנו, ישנם כמה הבדלים עיקריים. פרוטוקולים אחרים אינם כוללים בידוד תאי NK לפני הצביעה, למרות שהחוקרים מתעניינים רק בתת-קבוצה זו13,14. בהתחשב בכך שתאי NK מהווים רק 5-20% מהתאים החד-גרעיניים בדם ההיקפי (PBMCs), צביעת PBMCs שלמים במקום תאי NK מבודדים פירושה שרוב האירועים שנאספו לא יהיו תאי NK. זה מפחית את כמות הנתונים שנוצרים בתת-קבוצת העניין וגורם לניצול לא יעיל של זמן המכונה. בנוסף, בעוד שרבים מהפאנלים הללו חוקרים ביטוי של קולטני תאי NK כגון קולטנים דמויי Ig קטלניים (KIRs), NKG2A/C/D וקולטני הציטוטוקסיות הטבעיים (NKp30, NKp44 ו-NKp46), ביטוי סמנים אלה אינו מובא בהקשר רחב יותר בשל היעדר נתונים על ביטוי הליגנדים שלהם. כתוצאה מכך, בעוד ששיטות אלה שפורסמו בעבר לחקירת תאי NK באמצעות CyTOF מספיקות לפנוטיפ רחב של תאי NK, המשמשים בבידוד, הן אינן יכולות לספק תמונה מקיפה של פעילות תאי NK. זה מביא אותנו ליתרון העיקרי של השיטות המתוארות כאן, והוא שעד לנקודה זו לא פורסמו ציטומטריית זרימה או פאנלים של CyTOF המתמקדים בחקר הביטוי של ליגנדים לקולטני תאי NK. חשוב לציין, ללוח הליגנד שלנו יש מספר ערוצים פתוחים המאפשרים הוספת סמנים שיתאימו לצרכים הייחודיים של כל ניסוי.

בהתחשב בכך שאחת המגבלות העיקריות של CyTOF היא חוסר היכולת לשחזר את הדגימה לאחר הניתוח, ייתכן ששיטה זו לא תתאים לחוקרים שיש להם דגימות מוגבלות איתן הם מעוניינים לבצע ניסויים נוספים. בנוסף, אופי התפוקה הנמוך של CyTOF פירושו שהנתונים שנוצרו יהיו באיכות ירודה אם מספר התאים ההתחלתי נמוך. למעט שתי המגבלות הללו, שיטה זו תפעל היטב בכל סביבה כדי לחקור אינטראקציות קולטן-ליגנד בין תאי NK לתאי מטרה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

PBMCs אנונימיים למבוגרים בריאים הושגו מתאי מערכת הפחתת לויקוגרפיה שנרכשו ממרכז הדם של סטנפורד. PBMCs מתורמי ילדים בריאים וחולי דנגי חריפה בילדים התקבלו ממכון גורגס ללימודי בריאות בפנמה סיטי, פנמה ובתי חולים השייכים למשרד הבריאות, מערכת הביטוח הלאומי בפנמה סיטי ואזורים פרבריים. פרוטוקול מחקר הדנגי אושר על ידי ה-IRB של בית החולים דל ניניו (CBIHN-M-0634), ולאחר מכן אושר על ידי הוועדות של ICGES, CSS, בית החולים סנטו תומאס ואוניברסיטת סטנפורד. PBMCs מחולים נגועים ב-HIV בטיפול אנטי-רטרו-ויראלי התקבלו ממחקר ACTG A5321.

1. תיוג נוגדנים, הכנת פאנל ואחסון

  1. תיוג נוגדנים עם איזוטופים מתכתיים
    הערה: כדי להגביר את הסטנדרטיזציה הבין-ניסויית של צביעה, מומלץ לבצע צימודים מרובים עבור כל נוגדן ולאחר מכן לשלב את המוצרים לתערובת מאסטר אחת לאחסון לטווח ארוך כמתואר להלן.
    1. קבע את הריכוז של כל נוגדן על ידי מדידת הספיגה ב-280 ננומטר לפני ההצמדה. נוגדנים המשמשים לפרוטוקול זה זמינים מסחרית ונרכשו מהספקים המפורטים בטבלת החומרים.
    2. סמן נוגדנים עם איזוטופים מתכתיים באמצעות ערכות תיוג נוגדנים זמינות מסחרית בהתאם להוראות היצרן. השתמש ב-100 מיקרוגרם נוגדן לכל תגובה.
    3. קבע את הריכוז הסופי של הנוגדן המוחזר על ידי מדידת הספיגה ב-280 ננומטר. אחסן נוגדנים לטווח קצר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. טיטרציות נוגדנים
    הערה: טכנולוגיית CyTOF רגישה מאוד לאותות מזהמים פוטנציאליים ממתכות סביבתיות. לכן, יש להכין את כל המאגרים/ריאגנטים המשמשים עם מים טהורים במיוחד ולאחסן במיכלי פלסטיק או זכוכית שמעולם לא נשטפו בסבון.
    1. הכן צינורות צנטריפוגות לכל תורם המכילים 9 מ"ל RPMI חם ושלם (RPMI 1640, 10% FBS, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) ו-20 מיקרוליטר בנזונאז לכל בקבוקון של PBMCs להפשרה. מפשירים את ה-PBMCs באמבט מים ומוסיפים לצינורות.
      הערה: בנזונאז מפחית את הצמיגות והרקע מ-DNA חופשי מתאים ליזים.
    2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. השעו מחדש את ה-PBMCs ב-5 מ"ל של מדיית RPMI מלאה וספירה.
    3. עבור כל טיטרציה של פאנל, צלח 2-4 מיליון PBMCs / באר ב -6 בארות של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות (באר אחת לכל טיטר ואחת ללא מוכתמים). צנטריפוגה את הצלחת בחום של 600 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. יש להזיז את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט. השעו מחדש כל באר ב-200 מיקרוליטר של CyPBS.
    4. בצע צביעת כדאיות ציספלטין כמתואר להלן.
      הערה: ציספלטין משמש להבחנה בין תאים חיים לתאים מתים בציטומטריה המונית.
      1. השעו מחדש תאים ב-100 מיקרוליטר של מלאי ציספלטין של 25 מיקרומטר. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך דקה.
      2. להרוות את תגובת הציספלטין על ידי הוספת 100 מיקרוליטר FBS לכל באר וערבוב. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
        הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה הבאים ב-4 מעלות צלזיוס.
      3. שטפו תאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS (1x PBS ללא מזהמי מתכות כבדות במים טהורים במיוחד עם 0.1% BSA, 0.05% נתרן אזיד). צנטריפוגה והעיף את הצלחת בכל פעם.
    5. יש לטטר את לוח הנוגדנים על פני השטח כמתואר להלן.
      הערה: יש לבצע תערובות מאסטר נפרדות עבור לוח המשטח של NK ולוח הליגנד.
      1. צור תערובת מאסטר של כל הנוגדנים על פני השטח בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות CyFACS. כוון לנפח סופי של 150 מיקרוליטר. בצע דילולים סדרתיים של 1:2 באמצעות CyFACS, כדי להשיג את הריכוזים הבאים: 10, 5, 2.5, 1.25 ו-0.625 מיקרוגרם/מ"ל.
      2. סנן קוקטיילים של נוגדנים דרך יחידת סינון צנטריפוגלית (גודל נקבוביות של 0.1 מיקרומטר) ב-10,600 x גרם למשך 3 דקות לפני הצביעה.
      3. השעו מחדש את התאים המצופים ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים על פני השטח בטיטר המתאים. השעו מחדש את הבאר הלא מוכתמת ב-CyFACS. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      4. שטפו תאים עם 150 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
      5. שטפו תאים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
    6. בצע קיבוע של תאים על ידי השעיה מחדש של כל באר ב-100 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד (PFA) ב-CyPBS. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 20 דקות. שטפו תאים עם 100 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה ב 700 x גרם למשך 5 דקות.
      זהירות: PFA חשוד כגורם לפגמים גנטיים כמו גם לסרטן. בנוסף, הוא מזיק אם הוא בא במגע עם העיניים, העור או נשאפ. טפל כראוי על ידי הקפדה על אוורור טוב, פתיחת השקע בזהירות ומניעת היווצרות אירוסולים.
      הערה: כל סיבובי הצנטריפוגות הבאים מבוצעים ב-700 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    7. לחדור תאים על ידי השעיה מחדש ב-200 מיקרוליטר של 1x מאגר פרמביליזציה (מאגר סלסול) מדולל במים טהורים במיוחד. צנטריפוגה והעיף את הצלחת. שטפו תאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר פרם. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
      הערה: אין צורך בדגירה במאגר Perm.
    8. טיטרציה של פאנל נוגדנים תוך-תאיים
      1. הכינו תערובת מאסטר של כל הנוגדנים התוך-תאיים בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות Perm Buffer. כוון לנפח סופי של 150 מיקרוליטר. בצע דילולים סדרתיים של 1:2 באמצעות Perm Buffer כדי להשיג את הריכוזים הבאים: 10, 5, 2.5, 1.25 ו-0.625 מיקרוגרם/מ"ל.
      2. סנן קוקטיילים של נוגדנים דרך יחידת סינון צנטריפוגלית (גודל נקבוביות של 0.1 מיקרומטר) ב-10,600 x גרם למשך 3 דקות לפני הצביעה.
      3. השעו מחדש את התאים המצופים ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים התוך תאי בטיטר המתאים. השעו מחדש את הבאר הלא מוכתמת במאגר פרם. יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
        הערה: אם פאנל תוך-תאי לא הולך לעבור טיטרציה, השהה מחדש בארות ב-50 מיקרוליטר של מאגר פרם.
      4. שטפו תאים עם 150 מיקרוליטר של מאגר פרם. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
      5. שטפו תאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר פרם. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
      6. שטפו תאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
    9. צביעת אינטרקלטור DNA
      הערה: אינטרקלטור נקשר לחומצת גרעין תאית ומשמש לזיהוי תאים גרעיניים בציטומטריית מסה.
      1. השעיה מחדש של תאים ב-200 מיקרוליטר של אינטרקלטור מדולל 1:10,000 ב-CyPBS ו-2% PFA. דוגרים את הצלחת למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס.
      2. יש לאחסן צלחות, במידת הצורך, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מכוסות בניילון פרפין עד שבוע.
        הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה הבאים ב-700 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      3. לפני הפעלת הדגימות ב-CyTOF, הסר את סרט הפרפין מהצלחת והצנטריפוגה ב-700 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. החלק את הצלחת. שטפו תאים פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
      4. שטפו תאים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. צנטריפוגה והעיף את הצלחת. השעו מחדש תאים ב-200 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד. מיד לפני הפעלת הדגימה, התאם את הריכוז לכ-6 x 105 תאים/מ"ל בחרוזי נורמליזציה מדוללים לריכוז פי 1 במים טהורים במיוחד.
    10. הפעל את הדוגמאות ב-CyTOF.
    11. נתח נתונים ובחר טיטרים מתאימים לכל נוגדן על ידי בחירת טיטר הנוגדנים הנמוך ביותר שמביא לעוצמת האות הגבוהה ביותר ולהפרדה הטובה ביותר בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות על סמך הערכה חזותית.
      הערה: טיטרציות עבור לוחות NK וליגנד מוצגות באיור 1 ובאיור 2 בהתאמה. אם לא מזוהה הבחנה ברורה בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות, ניתן להעריך טיטרים על סוגי תאים מרובים או על קווי תאים, כדי לאפשר זיהוי של אוכלוסיות תאים חיוביות ושליליות כאחד.
    12. אחסון פאנל נוגדנים
      1. שלב נוגדנים עם טיטרציה לתערובת מאסטר וסנן דרך יחידת מסנן מזרק סטרילית של 0.1 מיקרומטר. יש לבצע תערובות מאסטר נפרדות עבור לוח המשטח של NK, הפאנל התוך-תאי של NK ולוח הליגנד.
      2. לאחסון לוחות לטווח הארוך, עקוב אחר אחת משתי האפשרויות המקובלות:
      3. שלח מיקס מאסטר לחברת צד שלישי לליופיליזציה. שיטה זו משמשת עבור החלונית NK. נוגדנים שאינם מצומדים בתוך הבית אינם ניתנים לליופיליזציה, בשל נוכחותו של מייצב נוגדנים, המפריע לתהליך הליופיליזציה. נוגדנים אלה מתווספים לפאנל ביום הצביעה.
      4. השתמש בפיפטה משחזרת כדי להכין 50 מיקרוליטר מכל תערובת מאסטר ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

2. פרוטוקול מכתים

  1. להפשיר תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) כמתואר בשלבים 1.2.1 ו-1.2.2. הקצו לפחות מיליון PBMCs לצביעה של פאנל ליגנד בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. שמור את ה-PBMCs הללו על קרח במהלך בידוד תאי ה-NK.
  2. בידוד תאי NK
    הערה: השלבים הבאים של בידוד תאי NK הם גרסה שונה של פרוטוקול של ספק ספציפי. עם זאת, כל ערכה או פרוטוקול המבצעים ברירה שלילית מבוססת מגנטית של תאי NK יהיו חלופה מתאימה. בנוסף, שלב זה הוא אופציונלי מכיוון שפרוטוקול זה מתאים גם לפנוטיפ של תאי NK מ-PBMCs שלמים.
    1. סובב את ה-PBMCs הנותרים ב-450 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את כדור התא ב-40 מיקרוליטר של מאגר MACS (PBS, 0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA) לכל 107 תאים בסך הכל.
    2. הוסף 10 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים ביוטין של תאי NK לכל 107 תאים בסך הכל. מערבבים היטב ומדגרים 5 דקות על קרח.
    3. הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר MACS לכל 107 תאים בסך הכל ו-20 מיקרוליטר של קוקטייל MicroBead של תא NK לכל 107 תאים בסך הכל. מערבבים היטב ומדגרים 10 דקות על קרח.
    4. הכן עמודות פליטה על ידי שטיפה עם 500 מיקרוליטר של מאגר MACS. הוסף 2 מ"ל של RPMI שלם קר לצינורות איסוף של 15 מ"ל.
    5. הוסף מאגר MACS לצינורות המכילים תאים כדי להביא את הנפח עד 500 מיקרוליטר. שוטפים את הצינור עם עוד 500 מיקרוליטר של מאגר MACS ומעבירים לעמודה.
    6. לאחר הפסקת הזרימה, שטפו את עמוד הפליטה עם מאגר MACS של 500 מיקרוליטר פעמיים. לאחר הפסקת הזרימה, ספור תאי NK.
  3. צלחת ושטיפה של תאים.
    1. צנטריפוגה בודדה תאי NK ו-PBMCs ב-300 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. השעיית תאים בריכוז של 5 מיליון תאים/מ"ל ב-CyPBS (1x PBS ללא מזהמי מתכות כבדות במים טהורים במיוחד). תאי צלחת בצלחת U תחתונה, 96 בארות.
      הערה: כל ציטוט של לוח התאים NK יכול לצבוע עד 3 מיליון תאים. אם שש דגימות תאי NK בודדות עוברות ברקוד ומאוגדות לפני הצביעה, המספר הכולל הכולל של תאי NK לא יעלה על 3 מיליון. לוח הליגנד יכול להכתים עד 6 מיליון PBMCs לכל דגימה. אם שש דגימות בודדות מקודדות ומאוגדות לפני הצביעה, המספר הכולל הכולל של PBMCs לא יעלה על 6 מיליון.
    2. צלחת צנטריפוגה ב 600 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. יש להזיז את הצלחת כדי להסיר את הנוזל העל.
      הערה: בצע את כל סיבובי הצנטריפוגה הבאים ב-600 x גרם למשך 3 דקות עד לשלב 2.7.
    3. השעו מחדש תאים ב-200 מיקרוליטר של CyPBS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
  4. בצע צביעת כדאיות ציספלטין כמתואר בשלב 1.2.4.
  5. צביעת ברקוד
    הערה: לוחות אלה משמשים בשילוב עם שיטת ברקוד מבוססת פלדיום ששתיים מתוך ארבע על תאים חיים לא קבועים כדי למזער את השפעות האצווה ולמקסם את התאוששות התאים15. עם זאת, שלב זה הוא אופציונלי מכיוון שברקוד אינו הכרחי כדי להשיג נתונים איכותיים.
    1. השעו מחדש כל באר ב-50 מיקרוליטר של ברקוד מעורבב מראש בהתאמה ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטפו תאים עם 150 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
    2. שטפו תאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת. השעו מחדש את כל הבארות ב-30 מיקרוליטר של CyFACS. שלבו עד שש בארות של תאים מוכתמים בברקודים ייחודיים לבאר אחת ובצעו צנטריפוגה והחלקה של הצלחת.
  6. מכתים על פני השטח
    1. ממיסים את הליוספירה של פאנל NK ב-50 מיקרוליטר של CyFACS עם נוגדנים נוספים על פני השטח (anti-CD16, anti-HLA-DR, anti-LILRB1). הפשירו פאנל ליגנד המאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס וסובבו את הצינור באמצעות מיני צנטריפוגה. ספייק בסמני משטח נוספים של לוח ליגנד (anti-CD16, anti-CD19).
      הערה: יש לסנן כל קוקטייל נוגדנים שלא סונן בעבר (כלומר, לפני ליופיליזציה או הקפאה) דרך יחידת סינון צנטריפוגלית (גודל נקבוביות של 0.1 מיקרומטר) ב-10,600 x גרם למשך 3 דקות לפני הצביעה.
    2. השעו מחדש כל באר ב -50 מיקרוליטר של הפאנל המתאים. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטפו תאים עם 150 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת. שטפו שוב תאים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
  7. תקן תאים כמתואר בשלב 1.2.6.
    הערה: בצע את כל סיבובי הצנטריפוגות הבאים ב-700 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. לחדור תאים כמתואר בשלב 1.2.7.
  9. צביעה תוך-תאית
    1. ממיסים את הליוספירה התוך-תאית של פאנל NK ב-50 מיקרוליטר של מאגר פרם. הכן קוקטייל נוגדנים תוך תאי לדגימות PBMC אם תרצה.
      הערה: יש לסנן כל קוקטייל נוגדנים שלא סונן בעבר (כלומר, לפני ליופיליזציה או הקפאה) דרך יחידת סינון צנטריפוגלית (גודל נקבוביות של 0.1 מיקרומטר) ב-10,600 x גרם למשך 3 דקות לפני הצביעה.
    2. השעו בארות ב -50 מיקרוליטר מהפאנלים התוך-תאיים המתאימים. אם לא נעשה שימוש בפאנל תוך-תאי בשילוב עם לוח פני השטח של הליגנד, השהה מחדש בארות PBMC ב-50 מיקרוליטר של מאגר פרם. יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
    3. שטפו תאים עם 150 מיקרוליטר של מאגר פרם. צנטריפוגה וצלחת פליק. שטפו תאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר פרם. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
    4. שטפו תאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
  10. צביעת אינטרקלטור DNA. בצע צביעת אינטרקלטור DNA כמתואר בשלב 1.2.9.1. דגרו את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: אינטרקלטור נקשר לחומצת גרעין תאית ומשמש לזיהוי תאים גרעיניים בציטומטריית מסה. ניתן לאחסן צלחות מכוסות בניילון פרפין עד שבוע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  11. לפני הפעלת הדגימות ב-CyTOF, שטפו תאים כמתואר בשלבים 1.2.9.3 ו-1.2.9.4.
  12. הפעל דוגמאות ב-CyTOF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

נוגדנים הוצמדו לאיזוטופים מתכתיים באמצעות ערכות תיוג זמינות מסחרית, על פי הוראות היצרן. שיבוטי נוגדנים אומתו על ידי ציטומטריית זרימה וציטומטריית מסה לפני השימוש בפאנל זה. רשימה ראשונית של שיבוטים נבחרה על סמך סקירת הספרות וזמינות הנוגדנים. רמות הביטו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן אנו מתארים את התכנון והיישום של שני לוחות CyTOF משלימים שמטרתם לאפיין את רפרטואר הקולטן-ליגנד של תאי NK. פרוטוקול זה כולל מספר שלבים שהם קריטיים להשגת נתונים איכותיים. CyTOF משתמש ביוני מתכות כבדות, ולא בפלואורוכרום, כבדיקות תווית לנוגדנים19. לכן טכנולוגיה זו נ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לכל החברים הנוכחיים והקודמים במעבדת בליש שתרמו לפאנל זה. תודה לקבוצת הניסויים הקליניים של איידס ולצוות ACTG A5321 וכן לד"ר סנדרה לופז-ורג'ס ודייוויס בלטראן במכון גורגס למחקרי בריאות על אוצרות הדגימות. לבסוף, תודה למייקל לייפולד, הולדן מאקר והמרכז לניטור חיסוני אנושי בסטנפורד על השימוש במכונות הליוס שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH U19AI057229, NIH R21 AI135287, NIH R21 AI130532, NIH DP1 DA046089, וחוקרי קרן בורוז וולקאם בפתוגנזה של מחלות זיהומיות #1016687 ל-CB, NIH Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award T32 AI007502, TL1 TR001084 ו-NIH/NIAID K08 AI138640 ל-EV, מלגת מחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע DGE-1656518 למענק הכשרה של JM ו-NIH T32-AI-007290 (PI אוליביה מרטינז). מחקר ACTG קיבל תמיכה במענקים מ-AI-68634 (מרכז סטטיסטיקה וניהול נתונים), UM1-A1-26617, AI-131798 ו-AI-68636 (ACTG). CB הוא חוקר הפקולטה לרפואה תרגומית לילדים ע"ש טאשיה וג'ון מורגרידג' ממכון המחקר לבריאות האם והילד בסטנפורד וחוקר של Chan Zuckerberg Biohub.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
89YSigma-Aldrich204919
102-Palladium nitrateTrace Sciences InternationalSpecial Order
104-Palladium nitrateTrace Sciences InternationalSpecial Order
106-Palladium nitrateTrace Sciences InternationalSpecial Order
108-Palladium nitrateTrace Sciences InternationalSpecial Order
115InTrace Sciences InternationalSpecial Order
141PrFluidigm201141A
142NdFluidigm201142A
143NdFluidigm201143A
144NdFluidigm201144A
145NdFluidigm201145A
146NdFluidigm201146A
147SmFluidigm201147A
148NdFluidigm201148A
149SmFluidigm201149A
150NdFluidigm201150A
151EuFluidigm201151A
152SmFluidigm201152A
153EuFluidigm201153A
154SmFluidigm201154A
155GdFluidigm201155A
156GdFluidigm201156A
157GdTrace Sciences InternationalN/A
158GdFluidigm201158A
159TbFluidigm201159A
160GdFluidigm201160A
161DyFluidigm201161A
162DyFluidigm201162A
163DyFluidigm201163A
164DyFluidigm201164A
165HoFluidigm201165A
166ErFluidigm201166A
167ErFluidigm201167A
168ErFluidigm201168A
169TmFluidigm201169A
170ErFluidigm201170A
171YbFluidigm201171A
172YbFluidigm201172A
173YbFluidigm201173A
174YbFluidigm201174A
175LuFluidigm201175A
176YbFluidigm201176A
209Bi anti-CD16Fluidigm3209002BClone 3G8. Used at a 1:50 dilution. 
697 cellsCreative BioarrayCSC-C0217
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 0.5 with Ultracel-30 Membrane, 30 kDaMilliporeUFC503096
Anhydrous acetonitrileFisher ScientificBP1165-50
anti-2B4Biolegend329502Clone C1.7.
anti-B7-H6R&D SystemsMAB7144Clone 875001.
anti-CCR2Biolegend357202Clone K036C2.
anti-CD2Biolegend300202Clone RPA-2.10.
anti-CD3Biolegend300402Clone UCHT1.
anti-CD4Biolegend317402Clone OKT4.
anti-CD4Biolegend344602Clone SK3.
anti-CD7Biolegend343102Clone CD7-6B7.
anti-CD8Biolegend344702Clone SK1.
anti-CD11bBiolegend301302Clone ICRF44.
anti-CD14Biolegend301802Clone M5E2.
anti-CD19Biolegend302202Clone HIB19.
anti-CD33Biolegend303402Clone WM53.
anti-CD38Biolegend303502Clone HIT2.
anti-CD48Biolegend336702Clone BJ40.
anti-CD56BD Pharmingen559043Clone NCAM16.2.
anti-CD57Biolegend322302Clone HCD57.
anti-CD62LBiolegend304802Clone DREG-56.
anti-CD69Biolegend310902Clone FN50.
anti-CD94Biolegend305502Clone DX22.
anti-CD95Biolegend305602Clone DX2.
anti-CD155Biolegend337602Clone SKII.4.
anti-CXCR6Biolegend356002Clone K041E5.
anti-DNAM-1BD Biosciences559787Clone DX11.
anti-DR4Biolegend307202Clone DJR1.
anti-DR5Biolegend307302Clone DJR2-2.
anti-FAS-LBiolegend306402Clone NOK-1.
anti-FcRgMillipore06-727Polyclonal antibody.
anti-HLA-C,EMilliporeMABF233Clone DT9.
anti-HLA-Bw4Miltenyi BiotecSpecial OrderClone REA274.
anti-HLA-Bw6Miltenyi Biotec130-124-530Clone REA143.
anti-HLA-DRBiolegend307602Clone L243.
anti-HLA-EBiolegend342602Clone 3D12.
anti-ICAM-1Biolegend353102Clone HA58.
anti-Ki-67Biolegend350502Clone Ki-67.
anti-KIR2DL1/KIR2DS5R&D SystemsMAB1844Clone 143211.
anti-KIR2DL3R&D SystemsMAB2014Clone 180701.
anti-KIR2DL5Miltenyi Biotec130-096-200Clone UP-R1.
anti-KIR2DS4R&D SystemsMAB1847Clone 179315.
anti-KIR3DL1BD Biosciences555964Clone DX-9.
anti-LFA-3Biolegend330902Clone TS2/9.
anti-LILRB1R&D Systems292319Clone MAB20172.
anti-LLT-1R&D SystemsAF3480Clone 402659.
anti-MICAR&D SystemsMAB1300-100Clone 159227.
anti-MICBR&D SystemsMAB1599-100Clone 236511.
anti-Nectin-1Biolegend340402Clone R1.302.
anti-Nectin-2Biolegend337402Clone TX31.
anti-NKG2AR&D SystemsMAB1059Clone 131411.
anti-NKG2CR&D SystemsMAB1381Clone 134522.
anti-NKG2DBiolegend320802Clone 1D11.
anti-NKp30Biolegend325202Clone P30-15.
anti-NKp44Biolegend325102Clone P44-8.
anti-NKp46Biolegend331902Clone 9E2.
anti-NTB-ABiolegend317202Clone NT-7.
anti-Pan HLA class IBiolegend311402Clone W6/32.
anti-PD1Biolegend329902Clone EH12.2H7.
anti-PerforinAbcamab47225Clone B-D48.
anti-Siglec-7Biolegend347702Clone S7.7.
anti-SykBiolegend644302Clone 4D10.2.
anti-TACTILEBiolegend338402Clone NK92.39.
anti-TIGITR&D SystemsMAB7898Clone 741182.
anti-ULBP-1R&D SystemsMAB1380-100Clone 170818.
anti-ULBP-2, 5, 6R&D SystemsMAB1298-100Clone 165903.
Antibody StabilizerCandor Bioscience131 050
Benzonase NucleaseMillipore70664
Bond-Breaker TCEP SolutionThermo Fisher Scientific77720
Bovine Serum Albumin solutionSigma-AldrichA9576
Calcium chloride dihydrate (CaCl2+2H2O)Sigma-Aldrich223506-25G
Cis-Platinum(II)diamine dichloride (cisplatin)Enzo Life SciencesALX-400-040-M250A 100 mM stock solution was prepared in DMSO and divided into 25 µL aliquots. Used at a 25 µM dilution for live/dead stain. Signal appears in 194Pt and 195Pt channels.
DMSOSigma-AldrichD2650
eBioscience Permeabilization BufferThermo Fisher Scientific00-8333-56
EDTA (0.5 M)HoeferGR123-100A double-concentrated HEPES buffer with EDTA was made according to the following recipe: 1.3 g NaCl (Thermo Fisher Scientific), 27 mg CaCl2+2H2O (Sigma-Aldrich), 23 mg MgCl2 (Sigma-Aldrich), 83.6 mg KH2PO4 (Thermo Fisher Scientific), 4 mL of 1M HEPES (Thermo Fisher Scientific), 2 mL of 0.5M EDTA (Hoefer, Holliston, MA, USA), and 100mL H2O. The pH of this double-concentrated HEPES buffer was adjusted to a pH of 7.3 using 1M HCl and 1M NaOH.
EQ Four Element Calibration BeadsFluidigm201078
Fetal Bovine SerumThermo Fisher ScientificN/A
Helios mass cytometerFluidigmN/A
HEPES (1M)Thermo Fisher Scientific15630080
HyClone Antibiotic/Antimycotic Solution (Pen/Strep/Fungiezone) solutionFisher ScientificSV3007901
Iridium - 191Ir/193Ir intercalatorDVS Sciences (Fluidigm)201192BUsed at a 1:10000 dilution.
Isothiocyanobenzyl-EDTA (ITCB-EDTA)Dojindo Molecular Technologies, Inc.M030-10Diluted to 1.25 mg/mL in anhydrous acetonitrile.
K562 cellsAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC CCL-243
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher ScientificSH30034
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
Maxpar X8 Antibody Labeling KitsFluidigmN/ANo catalog number as kits come with metals. 
Millex-VV Syringe Filter Unit, 0.1 µmMilliporeSLVV033RS
Milli-Q Advantage A10 Water Purification SystemMilliporeZ00Q0V0WW
MS ColumnsMiltenyi Biotec
NALM6 cellsAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC CRL-3273
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 3KPall CorporationOD003C35
NK Cell Isolation Kit, humanMiltenyi Biotec130-092-657
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15710
PBSThermo Fisher Scientific10010023
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificMP021954531
Qdot 655 anti-CD19Thermo Fisher ScientificQ10179Clone SJ25-C1. Used at a 1:50 dilution. Signal appears in 112Cd-114Cd channels. 
Qdot 655 anti-HLA-DRThermo Fisher ScientificQ22158Clone Tü36. Used at a 1:200 dilution.
Rockland PBSRockland Immunochemicals, Inc.MB-008 Used to make CyPBS (10X Rockland PBS diluted to 1X in Milli-Q water) and CyFACS buffers (10X Rockland PBS diluted to 1X in Milli-Q water with 0.1% BSA and 0.05% sodium azide). Buffers were sterile-filtered through a 0.22 µM filter and sotred at 4°C in Stericup bottles. 
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific21870092
Sodium azide (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration SystemMillipore SigmaS2GPU10RE
Tuning solutionFluidigm201072
Washing solution Fluidigm201070

References

  1. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (3), 200-218 (2020).
  2. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
  3. Eller, M. A., Currier, J. R. OMIP-007: phenotypic analysis of human natural killer cells. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (6), 447-449 (2012).
  4. Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-029: Human NK-cell phenotypization. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 87 (11), 986-988 (2015).
  5. Hammer, Q., Romagnani, C. OMIP-039: Detection and analysis of human adaptive NKG2C + natural killer cells : Detection of Human Adaptive NKG2C + NK Cells. Cytometry. 91 (10), 997-1000 (2017).
  6. Liechti, T., Roederer, M. OMIP-058: 30-Parameter flow cytometry panel to characterize iNKT, NK, unconventional and conventional T cells. Cytometry. 95 (9), 946-951 (2019).
  7. Béziat, V., et al. NK cell responses to cytomegalovirus infection lead to stable imprints in the human KIR repertoire and involve activating KIRs. Blood. 121 (14), 2678-2688 (2013).
  8. Pfefferle, A., et al. Intra-lineage plasticity and functional reprogramming maintain natural killer cell repertoire diversity. Cell Reports. 29 (8), 2284-2294 (2019).
  9. Barcenilla, H., Åkerman, L., Pihl, M., Ludvigsson, J., Casas, R. Mass cytometry identifies distinct subsets of regulatory T cells and Natural killer cells associated with high risk for Type 1 diabetes. Frontiers in Immunology. 10, 982(2019).
  10. Kurioka, A., et al. CD161 defines a functionally distinct subset of pro-inflammatory Natural killer cells. Frontiers in Immunology. 9, 486(2018).
  11. Romee, R., et al. Cytokine-induced memory-like natural killer cells exhibit enhanced responses against myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 8 (357), (2016).
  12. Shinko, D., et al. Mass cytometry reveals a sustained reduction in CD16+ Natural killer cells following chemotherapy in colorectal cancer patients. Frontiers in Immunology. 10, 2584(2019).
  13. Pohlmeyer, C. W., et al. Identification of NK cell subpopulations that differentiate HIV-infected subject cohorts with diverse levels of virus control. Journal of Virology. 93 (7), 01790(2019).
  14. Palgen, J. -L., et al. NK cell immune responses differ after prime and boost vaccination. Journal of Leukocyte Biology. 105 (5), 1055-1073 (2019).
  15. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  16. Takahashi, C., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
  17. Baumgart, S., Peddinghaus, A., Schulte-Wrede, U., Mei, H. E., Grützkau, A. OMIP-034: Comprehensive immune phenotyping of human peripheral leukocytes by mass cytometry for monitoring immunomodulatory therapies. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 34-38 (2017).
  18. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 87 (5), 380-382 (2015).
  19. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  20. Leipold, M. D., Newell, E. W., Maecker, H. T. Multiparameter phenotyping of human PBMCs using mass cytometry. Methods in Molecular Biology. 1343, 81-95 (2015).
  21. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (6), 467-475 (2012).
  22. Zivanovic, N., Jacobs, A., Bodenmiller, B. A practical guide to multiplexed mass cytometry. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 95-109 (2014).
  23. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150 (3), 248-264 (2017).
  24. Wilk, A. J., et al. Charge-altering releasable transporters enable specific phenotypic manipulation of resting primary natural killer cells. BioRxiv. , 970491(2020).
  25. Vendrame, E., et al. TIGIT is upregulated by HIV-1 infection and marks a highly functional adaptive and mature subset of natural killer cells. AIDS. 34 (6), 801-813 (2020).
  26. Zhao, N. Q., et al. Natural killer cell phenotype is altered in HIV-exposed seronegative women. PloS One. 15 (9), 0238347(2020).
  27. McKechnie, J. L., et al. HLA upregulation during dengue virus infection suppresses the natural killer cell response. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 268(2019).
  28. McKechnie, J. L., et al. Mass cytometry analysis of the NK cell receptor-ligand repertoire reveals unique differences between dengue-infected children and adults. ImmunoHorizons. 4 (10), 634-647 (2020).
  29. Ranganath, T., et al. Characterization of the impact of daclizumab beta on circulating natural killer cells by mass cytometry. Frontiers in immunology. 11, 714(2020).
  30. Fernandez, I. Z., et al. A novel human IL2RB mutation results in T and NK cell--driven immune dysregulation. The Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1255-1267 (2019).
  31. Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (45), 9626-9634 (2017).
  32. Nikzad, R., et al. Human natural killer cells mediate adaptive immunity to viral antigens. Science Immunology. 4 (35), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

NKCyTOFHIV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved