心脏球形作为体外生物工程心脏组织研究人类心脏病理生理学

摘要

该协议旨在通过在悬挂滴中共同培养细胞来制造3D心脏球体（CS）。胶原蛋白嵌入的 CS 在生理浓度下用多索鲁比辛（DOX，一种心毒性剂）进行治疗，以模拟心力衰竭。使用 DOX 治疗的 CS 进行体外测试可用于确定心力衰竭患者的新疗法。

摘要

尽管在心脏组织工程方面取得了若干进展，但需要克服的主要挑战之一仍然是生成一个全功能血管网络，该血管网络包含多种复杂程度，可为生物工程心脏组织内提供氧气和营养物质。我们的实验室已经开发出一种人体心脏的三维体外模型，称为"心脏球状体"或"CS"。这呈现了人类心脏的典型生化、生理和药理学特征，通过共同培养其三种主要细胞类型（如心脏肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞）而产生。人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs或ICMs）以接近人体体内发现的人类心脏成纤维细胞（HCFs）和人类冠状动脉内皮细胞（HCAEC）的比例共同培养，在悬挂滴培养板中放置三到四天。对患有心肌细胞T、CD31和维他命（分别是心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的标记）的CS的共生分析表明，CS存在一个复杂的内皮细胞网络，类似于人类心脏中的原生细胞网络。这些共和图像的 3D 渲染分析证实了这一点。CS还呈现人类心脏的典型细胞外基质（ECM）蛋白质，如胶原蛋白IV型、层明和纤维素。最后，与仅包含 iCMs 的 CS 相比，CS 呈现了一种收缩活性，其测量方式为同步收缩性，更接近于人类心脏的典型收缩性。当使用心毒性抗癌剂（如多索鲁比辛（DOX，用于治疗白血病、淋巴瘤和乳腺癌）进行治疗时，DOX 治疗的 CS 的活性显著降低，在 10 μM 遗传和化学抑制下，内皮一氧化氮合成酶（HCF 和 HCAEC 中 DOX 的下游靶点）降低了其在 CS 中的毒性。鉴于这些独特的特征，CS目前被用作体外模型来研究心脏生物化学、病理生理学和药理学。

引言

尽管组织工程和干细胞技术最近有所进步，但人类心脏的再生能力有限，而心血管疾病（CVD）仍然是全世界死亡^{的主要原因}。需要新的治疗方法，包括分子和细胞的方法，要么修复受损的心脏或防止心脏衰竭是目前的主要临床需求之一，为^{患者患有心脏病2，3，4。}心脏组织工程的主要目标是制造一个三维（3D）心脏组织，它呈现人类心脏的典型分子、细胞和细胞外特征，包括血管网络和生理收缩功能^4、5、6。

为了生物工程和制造一个功能性人体心脏组织，模仿人体心脏的体外和体内应用，已经调查了几种方法，包括工程心脏组织（EHTs），细胞表和球状培养^物7，8。然而，这些组织未能重新概括人类心脏的典型最佳3D微环境，它们对CVD患者的潜在用途不能直接从长凳转换到床边^7。这是因为他们没有概括体内心脏组织9的复杂生物学、形态学和^生理学。心脏组织工程的主要挑战之一包括在生物工程心脏组织内开发一个分层血管网络，因为任何直径大于200μm的组织在^2，10的中间形成^细胞死亡。人体心脏组织中形成适当血管网络对心脏细胞的血液、氧气和营养物质的供应^{起着重要作用}。在胚胎发育过程中，冠状动脉和动脉通过血管生成（新血管形成）和血管生成（从预先存在的血管生成）从内皮祖细胞^8，12形成。心脏成纤维细胞通过提供最佳的细胞外基质（ECM）和生长组成^13，14，在适当的血管^{网络形成中也起着主要作用}。

生物工程心脏组织的3D血管网络通过创建氧气和营养物质梯度及副糖体信号控制细胞的生存和功能，如同性细胞相互作用、异质细胞相互作用、细胞通过分泌的可溶性蛋白质和细胞与ECM相互作用^{3、10、15、16、17、18等细胞相互作用}。这可以防止细胞在组织中间死亡，并促进细胞活力和生理功能在生物工程心脏组织16，18，19。

干细胞中的球体培养物最近被探索为人类心脏的体外^模型20。为了进一步改善体外的心脏微环境，他们包括使用人类心脏中发现的所有主要细胞类型，如心脏肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。球体培养物为细胞的生长和功能提供所需的3D结构支撑，可用于生物工程血管网络14、20、21、22。在此背景下，我们的实验室已经开发出人类心脏球类（CS），以^{人类心脏14}的比例为共培养心脏肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。该模型是大鼠心室心脏细胞球状模型的扩展，该模型由悬滴培养物中共同培养心脏细胞生成，用于模拟心脏纤维^化21。人类CS可以通过治疗多索鲁比辛（DOX，用于治疗白血病、淋巴瘤和乳腺癌的抗癌剂）来作为毒性测定，众所周知，它能诱发心脏纤维化和心力衰竭（HF），即使在其^{14年以下17}年。

在这份手稿中，我们描述了如何通过共同培养人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs或icMs）、人类心脏成纤维细胞（HCFs）和人类冠状动脉内皮细胞（HCAEC）在悬挂滴培养物中产生人类CS。为了使用和图像 CS 进行体外测试，它们嵌入在胶原蛋白凝胶中。对含有抗体的CS的共合分析显示，这些细胞形成与体内观察到的细胞相似的网络。为了诱导HF和潜在的测试新剂，可以治疗或预防它，CS治疗与10μM DOX（一种浓度发现在癌症患者的血液中接受药物）。当染色与钙素-AM和乙基均性（分别染色活细胞和死细胞）时，与未接受药物的CS相比，DOX处理的CS的生存能力显著降低。使用 1 到 3 Hz 之间的场电位刺激时，CS 也呈现均匀收缩活性。

研究方案

注:用于此协议的 hiPSC-VM 是市售的。如有必要，请在开始这项工作之前寻求机构性人类道德委员会的批准。

1. 人体心脏成纤维细胞和内皮细胞培养电镀与生长

1. 在37°C的水浴中解冻含有HCFs和HCEHC的冷冻器一分钟。
2. 在无菌层流生物安全柜 2 下移动低温。
3. 使用 1000 μL 移液器尖端从冷冻体中收集 1 mL 细胞悬浮液，并加入含有 7 mL 人类心脏纤维细胞介质的 15 mL 管中，用于 HCFs，为 HCAECS 添加 7 mL 的人类中索内多生长介质。
   注:为了从每个冷冻中收集大部分细胞，用同一15 mL管用1 mL培养基冲洗两次。
4. 轻轻混合电池悬架。
5. 使用 10 mL 血清移液器将细胞悬浮液转移到分离 T75 培养瓶。
6. 在37°C下孵育细胞，用_5%CO2。
7. 18小时后，从两个培养瓶中吸出培养基，然后用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗一次，以去除冷冻的培养基和死细胞。
8. 将 PBS 替换为 7 mL 的适当培养基，以每个培养瓶并在 37 °C 下孵育。
9. 定期检查细胞扩张和生存能力，每隔一天更换一次介质，直到细胞达到80-90%的汇合。

2. iCM 文化电镀与生长

1. 预涂两个T25培养瓶，其中含有2 mL的PBS，含有40μg/mL的纤维素（FN），在37°C下孵育，5%CO2至少4小时。
2. 4小时后，收集一个含有 iCMs 的低温，并在 37 °C 的水浴中放置 4 分钟。
3. 将低温在无菌层流生物安全柜 2 下移动。
4. 使用 1 mL 移液器尖端轻轻将 iCM 从低温转移到无菌 50 mL 离心管。
5. 用 1 mL 的室温电镀介质冲洗空的 iCMs 冷冻，以回收任何残留细胞。将 1 mL 的电镀介质冲洗液从 90 秒内从冷冻滴液转移到包含 iCM 细胞悬浮液的 50 mL 离心管。
   注:轻轻旋转管，同时添加介质，以完全混合溶液，并减少解冻细胞的渗透冲击。
6. 缓慢地将8 mL室温电镀介质加入50mL离心管。在 30 - 60 s 上添加前 1 mL 滴滴。然后，在接下来的 30 秒中添加剩余的卷。在添加电镀介质时轻轻旋转离心管。通过反转 2 - 3 次（避免剧烈摇晃或涡旋），轻轻混合 50 mL 离心管的内容。
7. 立即使用血细胞计进行细胞计数，并确定可行的细胞密度（在细胞/mL中）。
8. 以 FN 预涂T25烧瓶，吸气FN-PBS溶液，不让烧瓶干燥。为此添加 iCMs 的种子量（1.6 x 10⁶ 在 8 mL 室温电镀介质中可行 iCM）。
9. 培养箱中的培养基在37°C下为48小时，CO2为_5%。
10. 使用前一天在4°C下通宵解冻维护介质。
11. 在 37°C 水浴中平衡维护介质并立即使用。
12. 2 天后，将 iCMs T25 烧瓶移至生物安全柜下。
13. 轻轻清洗掉死细胞和碎屑，轻轻将电镀介质上下移液 5 次。
14. 吸电镀介质，代之以预热维护介质的 8 mL。将 T25 烧瓶放回培养箱中。每隔一天更换维护介质并定期检查汇合。

3. 细胞隔离和计数

1. 首先收集第一个 HCAEC 和 HCF，然后按照步骤 3.2-3.12 进行 iCM。
2. 通过混合10 mL的 iCMs 维持介质、5 mL 的人类心脏纤维细胞介质和 5 mL 的中内多生长介质来准备 CS 培养基。
3. 从每个含有 HCF 和 HCAEC 的组织烧瓶中去除培养培养剂，然后用 5 mL PBS 冲洗一次，用于 T75 烧瓶。删除 PBS。
4. 在每个T75烧瓶中加入5 mL的0.25%的尝试素EDTA溶液，并在37°C下孵育5分钟，5%的_CO2。
5. 一旦细胞分离，立即用5 mL培养的培养中中和尝试素EDTA溶液。
6. 将电池悬浮液转移到 15 mL 管和离心电池，300 x g，4 分钟。
7. 小心地从每个管子上取下上一液。在每个细胞颗粒中加入1 mL的CS培养，然后重新暂停。保持管在冰上，并计数细胞使用锥蓝和血细胞计。
8. 从含有 iCMs 的组织烧瓶中去除维护介质，然后用 3 mL 的 PBS 冲洗一次。
9. 将 1 mL 的 0.25% trypsin EDTA 溶液添加到每个 T75 烧瓶中，并在 37 °C 下孵育，5% CO₂.每分钟检查一次单元格，直到分离。
10. 一旦细胞分离，立即用4mL培养的培养中中和尝试素EDTA溶液。
11. 将电池悬浮液转移到 15 mL 管中，并在 300 x g 下离心 5 分钟。
12. 小心地从每个管子上取下上一液。在细胞颗粒中加入1 mL培养素，然后重新暂停。保持管在冰上，并计数细胞使用锥蓝和血细胞计。

4.CS的生成和成长

1. 通过电镀 10，000 iCM、5，000 个 HCF 和 5，000 个 HCEFC，将 ICM、HCF 和 HCEC 以 2:1:1 的比例混合，每个悬挂跌落培养体包含 20μL 的 CS 介质。调整到 CS 总数的最终音量。
2. 移液 20 μL 的细胞悬浮液到 384 井 HDC 板的每个井中，或者手动或使用机器人多通道移液器进行自动液体处理。
3. 在悬挂滴盘周围的通道两侧移液 1.5 mL 的无菌 PBS， 以防止干燥 Cs。
4. 每天检查 CS 的形成，直到大多数油井中观察到完全成形的球体。每隔一天向每一井添加 7.5 μL 的 CS 介质，直到形成 CS。

5.CS胶原蛋白凝胶中

1. 使用 1 mL 移液器尖端收集 CS。
   注:在使用无菌锋利的表面（手术刀或剪刀）之前，必须将移液器的尖端切离边缘约 0.2 厘米，以防止在收集过程中任何损坏凝胶嵌入球体。
2. 将 CS 悬浮液收集到冰上 50 mL 管中。
3. 以 300 x g 离心管 5 分钟。
   注:获得的颗粒必须放在冰上直到使用。
4. 使用鼠尾胶原蛋白和CS介质在冰上以3:7的比例制备胶原蛋白凝胶溶液（100μL/孔，30口96孔板）。
5. 从含有 CS 的管子上取下上一液。
6. 在胶原蛋白凝胶溶液中混合颗粒 CS。
7. 将 1 μL/mL 的 5 mM 氢氧化钠加入 CS-胶原凝胶悬浮液中，轻轻混合。
8. 将 100 μL 的 CS-胶原凝胶转移到透明平底 96 孔黑色聚苯乙烯微孔板，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。

6. DOX 处理 CS 的生存能力和毒性测量

1. 30分钟后从孵化器收集96井板
2. 准备 10 μM DOX（基于以前建立的 CS¹⁴中细胞死亡协议）。
   注意:要潜在测试在 CS 中可能防止高频的其他代理，请生成包含 DOX + 代理 A、B 等的解决方案。
3. 在每个井中加入 100 μL 含有 DOX 和/或其他剂的溶液。控件区域性包含没有任何 DOX 的媒体。
4. 在37°C下孵育板18小时_，CO25% 。
5. 第二天，收集活/死染色试剂库存溶液，并允许它们在黑暗中在生物安全柜的冰上解冻。
6. 准备含有霍赫斯特污渍、4μM 乙基均质和 2 μM 钙化物-AM 的溶液。
7. 在每个孔中加入100μL的霍赫斯特污渍、钙化物-AM/乙基均匀溶液。
8. 使用多模微孔板读取器，分别测量每孔的荧光，分别用于 645 nm 的乙基同质和 530 nm 的钙素-AM。
9. 将荧光测量转移到 Graphpad PRISM（或用于统计分析的等效软件）。
10. 使用 GraphPad 棱镜软件进行数据分析和统计。
11. 对于质量控制，在荧光显微镜下检查核染色，以及钙化-AM和同性剂。

7.CS合同功能评估

1. 收集步骤 5.8 中准备的微孔板。
2. 打开包含 IonOptix 软件的计算机，用于基于视频的边缘检测、荧光辅助接口和 MyoPacer 场刺激器。
3. 在组织支架上放置新的盖滑，用电极组装水浴。
4. 使用 1 mL 移液器尖端从边缘切割 0.5 mm，轻轻地从胶原蛋白凝胶中收集 CS，然后将其转移到猎鹰管中。将介质添加到 CS 上，以防止 CS 干燥。在 IonOptix 系统的舞台上，用几μL介质传输 CS（一次一个）。
5. 使用 IonOptix 软件在 CS 的左侧和右侧设置峰值，选择要分析的 CS。
6. 使用基于计算机的运动分析仪跟踪 CS 边缘的移动。
   注:通常，收缩度以 % 细胞缩短或 % 分数缩短为单位进行测量。在这种情况下，我们测量了 % 球形缩短。
7. 稳定计算机的峰值调整阈值和边缘选项。
8. 使用 Myopacer 场刺激器将 CS 暴露在不同频率（0.3、0.6、1、2 和 3 Hz）和电压（1、2、3 和 5 V）下。
9. 记录球形缩短作为 CS 长度变化的 DOX 处理和未经处理的 CS. 分析数据使用软边缘软件和平均每个 CS.

8. CS的显微镜:固定和免疫标记

1. 30分钟后收集96井板（如步骤5.8中的准备），并在室温下将26井板在4%的半甲醛（PFA）中固定1小时。
2. 取出PFA，用含有0.01%的酸钠（PBSA）的PBS冲洗三次。
3. 删除 PBSA。
4. 在摇床上向每井添加含有0.02%Triton-X-100的200μL PBSA，30分钟。
   注:此步骤渗透 CS，以更好的抗体渗透。
5. 在PBSA溶液中加入200μL的3%牛血清白蛋白，在室温下60分钟。
   注:此步骤可阻止在 CS 中结合非特异性抗体。
6. 制备含有10μg/mL原发小鼠抗人抗体的溶液，对抗在阻断溶液中稀释的CD31。
7. 将100μL原抗体溶液加入每一井，并在4°C下在摇床上孵育过夜。
8. 在摇板上的室温下，用 PBSA 冲洗板三次 20 分钟。
9. 制备含有 Hoechst DNA 染色和 10 μg/mL 的 Cy3 结合二次驴抗小鼠抗体溶液，在阻断溶液中稀释。
10. 将含有霍赫斯特污渍的二次抗体溶液加入100μL，并在4°C的摇床上孵育过夜。
    注:从此时开始，用铝箔盖住板。
11. 在摇板上的室温下，用 PBSA 冲洗板三次 20 分钟。
12. 在每个孔中加入 100 μL 的 Vectashield 安装介质。
13. 在激光扫描共声显微镜下拍摄 CS。使用 ImageJ 软件沿 Z 轴执行光学剖切，将图像折叠成单个焦平面。

结果

本手稿中描述的协议是一种替代方法，用于在生物工程心脏组织内开发复杂的心脏内皮细胞网络，与现有模型相比，该细胞的生存能力和功能得到改善（图1）。CS 中体内 3D 心脏微环境的重述促进了他们对 DOX 在癌症患者血液中的浓度（介于 5 至 10 μM 之间，图 2） 的反应。与24小时内对照（无 DOX）CS相比，DOX治疗的CS在统计学上显著降低（图2），这种毒性作用甚至在使用药物治疗17年后在人类癌症患者中观察到。

图 1.CS形成和血管化分析。（A） 议定书，显示从悬挂滴中 iCMs、HCEC 和 HCF 的共同培养中形成 CS 的步骤。右侧的亮场图像显示了悬挂滴中单个细胞的渐进球形形成。（B） 折叠的Z-堆栈的CS的共生图像染色的抗体对心脏肌素T（cTNT），PECAM和维明丁，染色心脏肌细胞，内皮细胞和成纤维细胞，分别。这个数字从^{14号修改。}请单击此处查看此图的较大版本。

图 2.CS 的生存能力和毒性。 仅在介质 （DOX 0 μM） 或多索鲁比辛 （10 μM） 的情况下处理的 CS 荧光的统计分析 （A） 和乙酰基均性 （B） 荧光。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

从发展上，适当的血管网络形成对于功能组织的生成至关重要，包括^{人类心脏10、12、23、24、25、26。}考虑3D组织的适当血管化允许氧气，生长因子，信号分子和营养的交换，防止细胞坏死在任何组织厚超过200μm 6，10，12，17，24，25，26，27，28。目前在体外3D心脏模型，呈现一个血管网络主要是呈现毛细管大小，无组织血管网络，缺乏在体内观察到的分层复杂分支血管^{化观察6，8，29。}与现有模型（图^1）14、22相比，本手稿中描述的开发复杂心脏内皮细胞网络的替代方法^{提高了细胞的生存能力和功能}。3D体外 CS 通过更好地重新计算其体内微环境，包括其分子、细胞和细胞外成分^{14、22，为}人类^心脏建模。从悬滴中干细胞衍生细胞生成CS，允许其培养在定义的条件下（例如，细胞类型和比例，适当的组织形成）。iCMs与CS中的HCF和HCEAC共同培养，定义了调节心脏病理生理学的分子和细胞串扰，包括其收缩功能和对药物在患者血液中¹⁴浓度下的反应。由于这些独特的特点，CS已被用于模型心脏纤维化，心肌梗死和心力衰竭的严重后果^21。我们先前的研究表明，内皮细胞和成纤维细胞的存在对于重新综述人类心脏的血管微环境至关重要，从而允许纤维细胞衍生的ECM蛋白的最佳沉积，如层明、纤维素和胶原蛋白IV型，在发育中的内皮细胞网络^{14、21附近}局部化。

DOX是一种众所周知的心毒性药物，即使在治疗30年后，也可能在癌症患者中^{出现心力衰竭}。然而，它仍然是治疗白血病和淋巴瘤的白血病和淋巴瘤在^{30妇女乳腺癌的首选药物}。然后，在CS中的DOC治疗被用来模拟心力衰竭（HF）的体外，研究调节心脏肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞^{14毒性的机制，并}模拟HF诱导性心脏纤维^化21。当在癌症患者血液中的浓度（5 至 10 μM）14（图 2 ） 接触药物时，DOX 治疗的 CS 的细胞生存能力在²⁴小时内在统计上降低（图 2）。我们实验室先前的研究还证明，DOX通过内皮一氧化氮合成酶（eNOS）利用该信号通路¹⁴的遗传和化学抑制剂对心脏内皮细胞和成纤维细胞的毒性作用。使用基因（NOS3 shRNA）和化学（N5-（1-乙基）-L-苯乙烯，二氢氯，或L-NIO）拮抗剂的eNOS信号通路作为NOX的下游靶点，防止其毒性作用在心脏内皮细胞和成纤维^细胞14。

由于心脏细胞在接触场电位刺激时与电耦合，也测量了 CS 内的收缩活性。我们发现，使用控制介质（DOX 0 μM）培养的CS以1和3Hz范围内的场刺激来以跳动速率自发和均匀地收缩，与健康的人类心脏相当。另一方面，DOX 处理的 CS 不遵循电刺激，因为它们无法收缩。结合使用钙化-AM和同性物质测量细胞的生存能力和毒性，这种CS收缩函数的功能测定允许评估人体心脏体外的典型复杂情景，目前无法与其他模型实现。与使用同一系统的单心脏细胞的收缩活性测量相比，我们无法可视化和测量 CS 中的沙康。因此，我们仅限于测量 % 球形随着时间的推移缩短， 一个测试， 我们必须在我们的实验室内开发.当我们控制细胞的数量时，我们在每个CS中共同培养，因此每个CS的大小，我们使用大小与确实具有同质收缩函数的相一样大小的CS。但是，即使我们生成了不同大小的 CS，它们的收缩活动也不会改变。

同样重要的是要报告，CS 的多细胞性质使其足够重，足以在 Ion-Optix 系统中的盖玻片底部进行本地化，即使它们被超融合。基于 CS 自己坐在特定位置的事实，我们不需要使它们粘附在盖玻片上，这与大多数实验室中通常使用单心脏细胞的方法相反。

对患有心肌细胞素T、CD31/PECAM和PECAM抗体的CS的微观分析表明，内皮细胞网络的形成（图1，蓝色）。为了完全排除 CS 内部部分的坏死，我们实验室通过对钙化物-AM/乙基同质染色 CS 进行共生分析，对细胞生存能力进行了空间评估（数据未显示）。然而，重要的是要承认，生物制造领域的未来发展，以便更好地概括人体体内典型的其他复杂特征，目前在现有模型中是不可用的。其中包括:（一） 成人心肌细胞的典型收缩功能;ii） 血流和压力;iii） 参数信号;iv） 免疫反应，这将是至关重要的改善这个和其他体外心脏模型^6。由于任何其他模型旨在概括健康组织或疾病状态的主要特征，本手稿中描述的CS的生成和使用协议旨在帮助研究人员解决具体问题，而使用这种方法可能并不详尽。例如，可能使用患者衍生细胞生成 CS 将为个性化药物提供工具，目前无法使用常用的高通量测定进行心血管研究。

最后，我们演示了一种使用心脏细胞更好地概括人类心脏微环境的简单方法。心脏球体呈现一个内皮细胞网络，与心脏细胞的单层培养相比，可以更好地重述存在于人类心脏中的细胞网络。鉴于其独特的特点，它们代表了心血管研究体外测试的先进工具。未来使用患者衍生细胞的研究可以为个性化医学和新型疗法提供选择，从而预防和更好地治疗心血管疾病。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A1933
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies	Jackson Immunological Research Labs, Inc.	715-165-150	Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody
Doxorubicin hydrochloride	Sigma-Aldrich	D1515
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	From Bovine Plasma
Human cardiac fibroblasts (HCFs)	Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA	306AK-05a	5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs)	Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA	300K-05a	5x10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs)	Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.	R1057	iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
HCF Growth medium	Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA	316-500
Human MesoEndo Cell Growth Medium	Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA	212-500
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	L3224
Maintenance Medium (iCells)	Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.	R1057	iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM	BD Pharmingen, San Diego, CA, USA	566177
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	R37605
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate-Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Plating Medium (iCells)	Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.	R1057	iCell Cardiomyocytes Kit, 01434
Rat Tail Collagen	Sigma-Aldrich	C3867
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
Trypsin–EDTA, 0.25%	Gibco, Thermofisher Scientific	25200072
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco, Thermofisher Scientific	15250061
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	X100
Tissue culture flasks (T25)	Thermofisher Scientific	156367
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates	Corning, New York, USA	3603
384-Well Hanging Drop Plate	3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA	HDP1385