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摘要

提出一个协议，以提取各种分枝杆菌细胞壁的总脂质含量。此外，还显示了不同类型的肌酸的萃取和分析协议。还提供了一个薄层色谱协议来监测这些分形化合物。

摘要

分枝杆菌物种在生长速度、色素递迫存在、固体介质上显示的群落形态以及其他表型特征方面可能各不相同。然而，它们都有一个共同的分枝杆菌最相关的特征:它独特的高度疏水细胞壁。分枝杆菌物种含有一种膜-共价连结复合物，包括阿拉比诺甘丹、多肽和长链的支肠酸，其类型不同于分枝杆菌物种。此外， 肌菌还可以在其细胞表面产生位于非共价链接的脂质，如邻苯二甲酸二酯（PDIM）、酚甘油脂（PGL）、甘油脂（GPL）、乙酰三聚醇（AT）或磷脂二恶英（PIM）等。其中一些被认为是致病性分枝杆菌的毒性因素，或宿主-分枝杆菌相互作用中的关键抗原脂。由于这些原因，对支点血脂的研究有着极大的兴趣，因为这种脂质在几个领域得到应用，从了解它们在分枝杆菌感染致病性中的作用，到可能暗示它们是治疗传染病和其他疾病（如癌症）的免疫调节剂。在这里，提出了一个简单的方法来提取和分析总脂质含量和用有机溶剂混合物生长在固体介质中的分枝杆菌细胞的肌酸成分。获得脂质提取物后，将执行薄层色谱 （TLC） 来监测提取的化合物。该示例实验采用四种不同的分枝杆菌进行:环境快速增长的肌 杆菌布鲁马和支原体杆菌， 生长缓慢的 肌杆菌博维斯 杆菌Calmette-Guérin（BCG）和机会型病原体快速生长的分 枝杆菌脓肿， 表明本协议中显示的方法可用于广泛的分枝杆菌。

引言

Mycobacterium 属包括致病性物种和非致病性物种，其特点是具有由其特有的脂质形成的高度疏水性和不透水性细胞壁。具体来说，分枝杆菌细胞壁含有霉菌酸， 这是α-烷基和β-羟基脂肪酸，其中α分支是恒定的所有肌酸（长度除外）和β链，称为中分子链，是一个长的碱性链，可能包含不同的功能化学组描述与文献（α，α'-，甲氧基， [-，环氧树脂，卡盒-和+-1-甲氧-肌酸），因此产生七种类型的肌酸（I-VII）1.此外，其他具有毫无疑问重要性的脂质也存在于分枝杆菌物种的细胞壁中。致病物种，如 Mycobacterium tuberculosis, 结核病的致病剂2 产生特定的脂基毒性因子，如邻苯二甲酸二甲酸酯 （PDIM）、酚类糖脂 （PGL）、二、三和五氯乙酰丙烯酸酯 （DAT、TAT 和 PAT） 或硫化物等3.它们在分不育表面的存在与改变宿主免疫反应的能力有关，因此，宿主内部的分不分母的进化和持久性4.例如，三乙基甘油 （TAG） 的存在与血统 2- 北京子谱的超病毒表型有关 M. tuberculosis, 可能是因为它能够减弱宿主的免疫反应5,6.其他相关的脂质是结块状和非结管分枝杆菌中的脂糖（LOSs）。在 Mycobacterium marinum，LOS在其细胞壁的存在与滑动运动和形成生物膜的能力有关，并干扰巨噬细胞模式识别受体的识别，影响宿主噬细胞吸收和消灭细菌7,8.此外，一些脂质的缺失或存在允许同一物种的成员在与宿主细胞相互作用时，被分为具有毒性或衰减型的不同体型。例如，在粗糙的太平间类型中缺少糖镜（GPL） Mycobacterium abscessus 已与诱导噬细胞内酸化的能力有关，因此细胞凋亡9，不像光滑的太平型，拥有GPL在他们的表面。此外，分机细胞壁的脂质含量与改变宿主免疫反应的能力有关。这在使用一些分枝杆菌触发针对不同病理的保护性免疫特征的背景下是相关的10,11,12,13. 例如，已经证明这一点 Mycolicibacterium vaccae，一种作为结核病免疫治疗疫苗进行第三阶段临床试验的沙氏杆菌，显示两种殖民的死型。虽然光滑的表型，其中含有聚酯在其表面，触发Th2反应，粗糙的表型没有聚酯可以诱导Th1配置文件时，它与宿主免疫细胞相互作用14.分枝杆菌细胞中存在的脂质的种类不仅取决于分枝杆菌物种，还取决于分枝杆菌培养的条件:孵化时间15,16 或文化媒介的构成17,18.事实上，培养媒介成分的变化影响着抗肿瘤和免疫刺激活性的 M. bovis BCG 和 Mycolicibacterium brumae in vitro17.此外，保护性免疫剖面触发 M. bovis BCG 反对 M. tuberculosis 小鼠模型的挑战也取决于文化媒介 M. bovis BCG 增长17.然后，这些可能与每个培养条件下的分枝杆菌的脂质组成有关。由于所有这些原因，对分枝杆菌脂质含量的研究是相关的。提出了提取和分析支点细胞壁脂质成分的视觉程序。

研究方案

1. 从分枝杆菌中提取总非同价相关脂质（图1）

  1. 从固体介质中划出 0.2 克分枝杆菌，并加入带多氟乙烯 （PTFE） 衬里螺丝帽的玻璃管。添加由 5 mL 氯仿和 10 mL 甲醇（氯仿:甲醇，1:2）组成的溶液。
    注:使用有机溶剂时，只应使用玻璃接收器。不允许使用塑料容器。此外，需要为瓶子的PTFE衬里螺丝帽。
    警告:氯仿是一种潜在的有毒和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:甲醇是一种潜在的有毒和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
  2. 将管子在持续搅拌中过夜，从分不育细胞表面提取非共价相关脂质。
    注:如果没有轨道摇晃平台，可以尽可能频繁地用周期性手动搅拌取代恒定搅拌。
  3. 用滤纸盖住玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并将其收集在玻璃管中。
  4. 使用氮气通量蒸发管中的液相。在管子中填充氮气，盖上盖子，将其储存在 4 °C 下。
    注:将玻璃巴斯德移液器连接到氮气流中，以专门蒸发所需的管子。此外，在 37 °C 的干块加热器内保持管子。 当溶剂蒸发时，在关闭管子之前，先用氮气填充管子。
  5. 在细胞碎屑中加入 15 mL 的氯仿溶液:甲醇 （2:1）。将管子在持续搅拌中过夜，从分不育细胞表面提取非共价相关脂质。
    注:如果没有轨道摇晃平台，可以尽可能频繁地用周期性手动搅拌取代恒定搅拌。
  6. 让混合物休息1小时。用巴斯德移液器，回收有机溶剂。用滤纸盖住玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并将其收集到以前用于第 1.3 步的同一个玻璃管中。使用氮气通量蒸发管中的液相。用氮气填充管子，关闭它，并在4°C下再次储存。

2. 酸甲酸溶解提取的肌酸 （图2A）

  1. 将 2-5 毫升的酯化溶液加入带有 PTFE 衬里螺丝盖的密封玻璃管中。在玻璃管中加入0.2克分枝杆菌生物量。
    注:酯化溶液通过混合30mL甲醇、15mL甲苯和1mL硫酸形成。分枝杆菌细胞可以取自固体培养物，甚至从熟食细胞中提取完全非共价相关脂质（在步骤 1.6 中过滤后剩余的细胞）。
    警告:甲苯是一种易燃和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:硫酸是一种腐蚀性和危险性物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
  2. 通过漩涡混合内容。让混合物在 80 °C 的干燥浴缸中过夜。
  3. 让管冷却，直到达到室温，然后加入2mL的n-六烷管。通过涡旋将内容混合 30s，让管子沉淀，直到出现两个清晰的阶段。
    警告:n-六烷是一种潜在的易燃、刺激性、环境破坏和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
  4. 恢复与 n-六烷相对应的上相。将其转移到新管子中。
  5. 重复步骤 2.3。再次恢复上相，并将其转移到步骤 2.4 中使用的同一管中。
  6. 使用氮气通量蒸发管子中的内容。将管子装满氮气，关闭管子，将其储存在 4 °C 下。

3. 通过皂化和甲基化提取的肌酸 （图2B）

  1. 从固体介质中划出 0.2 克分枝杆菌，并添加到带 PTFE 螺丝帽的玻璃管中。
  2. 加入2mL甲醇苯溶液（80:20），含5%氢氧化钾。通过漩涡混合内容。在 100 °C 下加热混合物 3 小时。
    警告:苯是一种易燃、致癌和有害物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
  3. 让管子冷却到室温。加入 20% 硫酸，使样品酸化，达到 pH = 1。
  4. 加入3兆瓦的二乙醚。通过漩涡轻轻混合内容。
  5. 通过结算让两个阶段形成。恢复二乙醚相，并转移到一个新的管。重复洗涤步骤共三次。
  6. 用2mL蒸馏水清洗二乙醚提取物，并将与二乙醚对应的上部转移到新管中。重复洗涤步骤共三次。
  7. 在二乙醚提取物上加入2克无水硫酸钠，使其干燥。
  8. 过滤悬架。使用氮气通量蒸发含量。
  9. 要执行甲基化步骤，在蒸馏水中溶解由 45 mL 二乙醚和 9 mL 40% KOH 形成的预制溶液中的 3 克 N 硝基-N-甲基尿素。
    警告:N-硝基-N-甲基尿素是一种有毒、刺激性、致癌性和危险性物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
  10. 将超高氨酸（二甲基甲烷）转移到冰中冷却的新烧瓶中，其中含有氢氧化钾颗粒（约30克）。
    注意:如果不立即使用超高音量，则可以在 -20 °C 下存储，最高可达 1 小时。
    警告:氢氧化钾颗粒是一种刺激性和腐蚀性物质。这种材料必须使用在层压流罩上，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:二甲苯具有剧毒性和潜在的爆炸性。它必须用于带安全玻璃的层压流动罩，并佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
  11. 将含有二甲烷的乙醚溶液（在第 3.10 步获得）添加到含有肌酸的干燥二乙醚提取物中，该提取物在步骤 3.8 中获得。在室温下孵育15分钟。
  12. 在 40 °C 下蒸发悬浮。 用氮气填充管子，关闭它，并将甲基化脂质储存在4°C。
    注:从层压流罩下的乙醚溶液蒸发二甲烷，直到乙醚失去黄色。

4. 薄层色谱 （TLC） 分析

  1. 饱和玻璃 TLC 室。为此，请用一张滤纸覆盖 TLC 室的墙壁，并允许它与溶剂混合物组成的移动相接触。将溶剂的剩余体积放在 TLC 室的底部。
    注:TLC 室的底部必须覆盖至少 1 厘米的移动相。在目前的实验中，不同的移动阶段被用来开发TLC。它们由85兆L的n-六烷加15mL的二乙醚组成;100mL二氯甲烷;90 mL 氯仿、10 mL 甲醇和 1 mL 水;30 mL 氯仿，外加8mL甲醇和1mL水:60 mL 氯仿，外加35mL甲醇和8mL水:95 mL 氯仿加5mL甲醇;和 90 mL 的石油乙醚 （60-80 °C） 加上 10 mL 的二乙醚。
    注:在二维TLC中，在第一方向使用n-六烷:丙酮（95:5），并在第二个方向使用单个开发与甲苯:丙酮（97:3）来分析肌酸成分。要分析 PIM，请在第一个方向使用氯仿:甲醇:水（60:30:6），在第二个方向使用氯仿:醋酸:甲醇:水（40:25:3:6）。要分析 PDIM 和 AG，请使用石油乙醚（60-80 °C）:乙酸乙酸乙酯 （98:2） 在第一个方向上三次，并在第二个方向使用单个开发与石油乙醚 （60-80 °C）:丙酮 （98:2） 在第二个方向。
    警告:二乙醚是一种潜在的有毒和危险物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:二氯甲烷是一种潜在的有毒和危险物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:石油乙醚是一种潜在的易燃、环境破坏和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:醋酸是一种潜在的易燃和腐蚀性物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:乙酸乙酸乙酯是一种易燃和有害物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:丙酮是一种易燃和有害物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
  2. 关闭 TLC 室使其饱和至少 20 分钟。同时，将玻璃管中的脂质溶解在 0.2-1 mL 的氯仿中。
    注:用于溶解脂质的体积可根据样品的预期或预期浓度进行修改。
  3. 使用直接在 TLC 板上的毛细管将每个悬架的 10 μL 涂抹，让样品在室温下干燥 5 分钟。
    注:样品必须涂在板的底部，每侧留下1厘米。样品必须彼此分离至少 0.5 厘米。样品在板上应用后，管子可以再次用氮气蒸发，储存在4°C下供进一步使用。
  4. 将板插入包含移动相的饱和 TLC 室。允许移动阶段通过 TLC 运行。
    注:适用于 TLC 腔室的任何运动都会影响板上的运行溶剂，并影响脂质移动性。在执行二维 TLC 时，需要两个 TLC 室来包含两个放逐系统。
  5. 当溶剂距离板的上端达到 1 厘米时，从 TLC 腔室中取出板。将板放在层压通量下，直到二氧化硅完全干燥。
    注:在分析肌酸成分的情况下，使用 n-六烷和二乙醚 （85:15），重复步骤 4.4 和 4.5 两次以上，直到运行移动阶段三次在 TLC 板。
  6. 用所需的污渍露出盘子;如果需要，加热盘子。
    注:在本实验中，15-20 mL 的以下溶液用于喷洒 TLC 板:乙醇中 10% 的莫利布达托磷酸水合物，直到板状亮黄色，然后在 120 °C 加热板:5% 的乙醇 20% α -石脑油硫酸，然后加热板在 120 °C;在磷酸盐带出现或硫酸中出现1%的氮氧化物之前，蓝色试剂（420万硫酸中氧化物的1.3%）。
    警告:甲基磷酸水合物是一种易燃腐蚀性物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:乙醇是一种潜在的易燃和危险物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:1-纳普特霍尔是一种易燃、腐蚀性和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
    警告:甲基蓝喷雾试剂是一种腐蚀性、有毒和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。

结果

为了显示不同分枝杆菌物种中的各种脂质 ，M. bovis BCG 被选中，因为它是粗糙和生长缓慢的分枝杆菌。在手术中增加了粗糙和快速增长的 M.偶然 和 M.布鲁马 ，最后，也包括 了M.脓肿 的光滑的死型。这四个物种使我们能够可视化广泛的分枝杆菌衍生脂质，如乙酰链球菌（AT）、GPL、PDIM、PGL、PIM、TDM和TMM。此外，所有四个物种都有不同的肌酸模式。

在...

讨论

提出了一个简单的协议，被认为是从分不育细胞壁中提取非高血脂化合物的黄金标准方法。显示从四种不同分枝杆菌提取的脂质中，一维和二维 TLC 的进一步可视化。

氯仿和甲醇连续两次结合混合物来恢复支核细胞的脂质含量，是使用最广泛的溶剂混合物23、24、25、26、27、28、29。

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项研究由西班牙科学、创新和大学部（RTI2018-098777-B-I00）、联邦基金和加泰罗尼亚总务局（2017SGR-229）资助。桑德拉·瓜拉尔-加里多是加泰罗尼亚总务部的博士学位合同（FI）的接受者。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic AcidMerck100063CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur
AcetoneCarlo Erba400971NCAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000
AnthroneMerck8014610010Anthrone for synthesis.
BenzeneCarlo Erba426113CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l
Capillary glass tubeMerckBR708709BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark
ChloroformCarlo Erba412653CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L
Dry block heaterJ.P. Selecta7471200
DicloromethaneCarlo Erba412622CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L
Diethyl etherCarlo Erba412672CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L
Ethyl AcetatePanreac1313181211CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO
Ethyl Alcohol AbsoluteCarlo Erba4146072CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Glass funnelVidraFOCDURA.2133148 1217/1
Glass tubeVidraFOCVFOC.45066A-16125Glass tube with PTFE recovered cap
MethanolCarlo Erba412722CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L
Molybdatophosphoric acid hydrateMerck51429-74-4CAUTION.
Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%SigmaM1942-100MLCAUTION.
n-hexaneCarlo Erba446903CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L
n-nitroso-n-methylureaSigmaN4766CAUTION
Orbital shaking platformDDBiolab995018NB-205L benchtop shaking incubator
Petroleum ether (60-80ºC)Carlo Erba427003CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L
SprayerVidraFOC712/1
Sodium sulphate anhydrousMerck238597
Sulfuric acid 95-97%Merck1007311000CAUTION. Sulfuric acid 95-97%
TLC chamberMerckZ204226-1EARectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
TLC plateMerck1057210001TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Plate HeaterCAMAG223306CAMAG TLC Plat Heater III
TolueneCarlo Erba488551CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
VortexFisher Scientific10132562IKA Agitador IKA vórtex 3
1-naphtholSigma-Aldrich102269427CAUTION.

参考文献

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