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要約

広範囲のマイコバクテリアの細胞壁の総脂質含有量を抽出するプロトコルが提示される。さらに、異なる種類のマイコール酸の抽出および分析プロトコルが示されている。これらのマイコバクテリア化合物をモニタリングする薄層クロマトグラフィープロトコルも提供される。

要約

マイコバクテリア種は、成長速度、色素沈着の存在、固体培地に表示されるコロニー形態、ならびに他の表現型特性において互いに異なることができます。しかし、それらはすべてマイコバクテリアの最も関連性の高い特徴である、そのユニークで疎水性の高い細胞壁を共通しています。マイコバクテリア種には、アラビノガラクタン、ペプチドグリカン、マイコバクテリア種によって異なるタイプのマイコリン酸の長鎖を含む膜共有結合複合体が含まれています。さらに、マイコバクテリアは、フチオセロールジミコセローサイト(PDIM)、フェノール系糖脂質(PGL)、グリコペプチド脂質(GPL)、アシルトレハロース(AT)、またはホスファトリジルイノシトールマンノシド(PIM)などの細胞表面に位置する、非共有結合の脂質を産生することもできる。それらのいくつかは、病原性抗酸菌の病原性因子、または宿主-マイコバクテリア相互作用における重要な抗原脂質と考えられている。これらの理由から、マイコバクテリア感染症の病原性における役割を理解することから、感染症や癌などの他の病理の治療に免疫調節剤として可能な意味まで、いくつかの分野での適用によるマイコバクテリア脂質の研究に大きな関心があります。ここでは、有機溶媒の混合物を用いて固体培地で増殖したマイコバクテリア細胞の総脂質含量およびマイコリン酸組成を抽出して分析する簡単なアプローチが提示される。脂質抽出物が得られると、薄層クロマトグラフィー(TLC)が行われ、抽出された化合物をモニタリングします。実験例は、4つの異なる抗酸菌で行われます:環境の急速に成長している 抗酸菌ブルマエマと抗腸菌、 減衰して成長し遅い マイコバクテリウム・ボビス ・バチルス・カルメット・ゲリン(BCG)と日和見病原体の急速に成長する マイコバクテリウム膿瘍を、 本プロトコルに示す方法が広範囲のマイコバクテリアに使用できることを実証した。

概要

Mycobacterium 病原性および非病原性種を含む属であり、その特異な脂質によって形成される疎水性の高い不透過性の細胞壁を有することを特徴とする。具体的には、マイコバクテリア細胞壁には、αアルキルおよびβヒドロキシ脂肪酸であるマイコール酸が含まれており、α枝はすべてのミコール酸(長さを除く)で一定であり、メロミルコレート鎖と呼ばれるβ鎖は、文献と共に記述された異なる機能性化学基を含む可能性のある長い脂肪族鎖である(α、α、meoxyth κ-、エポキシ-、カルボキシ-およびω-1-メトキシ-マイコレート、従って7種類のマイコール酸(I-VII)を生産する1.また、他の脂質は、重要でない他の脂質も、マイコバクテリア種の細胞壁に存在する。病原種など Mycobacterium tuberculosis, 結核の原因物質2 フチオセロール・ジミコセローサイト(PDIMs)、フェノール糖脂質(PGL)、ジ、トリ、ペンタ・アシルトロース(DAT、TAT、PAT)、またはスルフォ脂質などの特異的脂質ベースの病原性因子を産生する。3.抗酸菌表面での彼らの存在は、宿主の免疫応答を修飾する能力と関連しており、したがって、宿主内の抗酸菌の進化および持続性4.例えば、トリアシルグリセロール(TAG)の存在は、2-北京のリネージュの過敏な表現型と関連している M. tuberculosis, おそらく、宿主の免疫応答を減衰する能力が原因で5,6.他の関連する脂質は、結核性および非結核性抗酸菌に存在するリプーリゴ糖(LOS)である。の場合 Mycobacterium marinumその細胞壁におけるLOSの存在は、滑走運動性とバイオフィルムを形成する能力に関連しており、マクロファージパターン認識受容体による認識を妨げ、宿主食細胞による細菌の取り込みおよび除去に影響を及ぼす7,8.さらに、いくつかの脂質の存在または存在は、同じ種のメンバーが宿主細胞と相互作用する際に、毒性または減衰プロファイルを有する異なる形態型に分類することを可能にする。例えば、大まかな形態型における糖ペプチド脂質(GPL)の欠如 Mycobacterium abscessus は、咽頭内酸性化を誘導する能力に関連しており、結果的に細胞アポトーシス9表面にGACLを持つ滑らかな形態とは異なり。さらに、マイコバクテリア細胞壁の脂質含有量は、宿主における免疫応答を改変する能力に関連している。これは、異なる病理に対する保護免疫プロファイルをトリガーするためにいくつかのマイコバクテリアを使用する文脈で関連しています10,11,12,13. 例えば、それが実証されている。 Mycolicibacterium vaccae結核の免疫療法ワクチンとして現在第III相臨床試験中の天癌性抗酸菌は、2つの植民地形態を示す。表面にポリエステルを含む滑らかな表現型はTh2応答を引き起こすが、ポリエステルを欠いた粗い表現型は宿主免疫細胞と相互作用する際にTh1プロファイルを誘導することができる14.マイコバクテリア細胞に存在する脂質のレパートリーは、マイコバクテリア種だけでなく、マイコバクテリア培養の条件にも依存する:インキュベーションの時間15,16 または培養培地の組成17,18.実際、培地組成の変化は、抗腫瘍および免疫刺激活性に影響を及ぼす M. bovis BCGと Mycolicibacterium brumae in vitro17.さらに、保護免疫プロファイルは、次の M. bovis に対する BCG M. tuberculosis マウスモデルにおける挑戦は、培養メディアによっても依存し、 M. bovis BCGが成長17.これらは、各培養条件におけるマイコバクテリアの脂質組成に関連する可能性があります。これらすべての理由から、マイコバクテリアの脂質含有量の研究は関連しています。マイコバクテリア細胞壁の脂質組成を抽出し、分析する目視的手順を提示する。

プロトコル

1. マイコバクテリアからの非共有結合脂質の全量の抽出 (図1)

  1. 固体培地から0.2gのマイコバクテリアをスクラッチし、ポリテトラフルオロエトレン(PTFE)ライナースクリューキャップを備えたガラスチューブに追加します。5 mLのクロロホルムと10 mLのメタノール(クロロホルム:メタノール、1:2)からなる溶液を加えます。
    注:有機溶剤を使用する場合は、ガラスの受け手のみを使用してください。プラスチック製の容器は使用できません。また、ボトル用のPTFEライナースクリューキャップが必要です。
    注意:クロロホルムは潜在的に有毒で非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
    注意:メタノールは潜在的に有毒で非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
  2. マイコバクテリア細胞表面から非共有結合脂質を抽出するために一晩一定の攪拌でチューブを残します。
    注:軌道揺れプラットフォームが利用できない場合、一定の攪拌は、できるだけ頻繁に定期的な手動攪拌によって交換することができます。
  3. ガラス漏斗をフィルターペーパーで覆い、有機溶剤をろ過し、ガラス管に入れて集めます。
  4. 窒素ガスフラックスを使用して、チューブ内の液相を蒸発させます。窒素ガスでチューブを充填し、蓋をして4°Cで保管してください。
    注:ガラスパスツールピペットを窒素ガスの流れに接続して、目的のチューブを具体的に蒸発します。さらに、37 °Cでチューブ用のドライブロックヒーター内のチューブを維持します。 溶剤が蒸発したら、チューブを窒素ガスで満たしてから閉じます。
  5. 細胞の破片にクロロホルム:メタノール(2:1)の溶液の15 mLを加えます。マイコバクテリア細胞表面から非共有結合脂質を抽出するために一晩一定の攪拌でチューブを残します。
    注:軌道揺れプラットフォームが利用できない場合、一定の攪拌は、できるだけ頻繁に定期的な手動攪拌によって交換することができます。
  6. 混合物を1時間休ませます。パスツールピペットで、有機溶剤を回収します。ガラス漏斗をフィルターペーパーで覆い、有機溶剤をろ過し、ステップ1.3で使用したのと同じガラスチューブに集めます。窒素ガスフラックスを使用して、チューブ内の液相を蒸発させます。窒素ガスでチューブを充填し、それを閉じて、4 °Cで再び保存します。

2. 酸メタノール類によるマイコチル酸抽出 (図2A)

  1. 2-5 mLのエステル化液をPTFEライナースクリューキャップ付きの気薬ガラスチューブに加えます。0.2gのマイコバクテリアバイオマスをガラス管に加えます。
    注:エステル化溶液は、30 mLのメタノール、15 mLのトルエン、および1 mLの硫酸を混合して形成されます。マイコバクテリア細胞は、固形培養から、あるいは、マイコバクテリア(ステップ1.6で濾過した後の残りの細胞)から全非共有結合脂質の抽出を行った後の脱脂細胞から採取することができる。
    注意:トルエンは可燃性で非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
    注意: 硫酸は腐食性および有害物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
  2. 渦を混ぜて内容を混ぜる。混合物は一晩80°Cで乾燥浴中に立たせます。
  3. チューブが室温になるまで冷却し、チューブに2 mLのn-ヘキサンを加えます。30 sの渦によって内容物を混ぜ、2つの明確な相が現れるまで管を落ち着かせる。
    注意:n-ヘキサンは、潜在的な可燃性、刺激性、環境的に有害、および非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
  4. n-ヘキサン相に対応する上相を回復します。新しいチューブに移します。
  5. ステップ 2.3 を繰り返します。上のフェーズを再度回収し、ステップ 2.4 で使用したのと同じチューブに移します。
  6. 窒素ガスフラックスを使用してチューブの内容物を蒸発させる。窒素ガスでチューブを充填し、それを閉じて、4 °Cで保存します。

3. ケン化とメチル化によるマイコグル酸抽出 (図2B)

  1. 固体培地から0.2gのマイコバクテリアをスクラッチし、PTFEスクリューキャップ付きのガラスチューブに追加します。
  2. 5%の水酸化カリウムを含むメタノールベンゼン溶液(80:20)を2mL添加する。渦を入れるだけで内容を混ぜます。混合物を100°Cで3時間加熱する。
    注意:ベンゼンは可燃性、発がん性、有害物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
  3. チューブを室温まで冷却します。20%の硫酸を加えたサンプルを酸性化し、pH=1を達成する。
  4. ジエチルエーテルを3 mL加えます。渦を入れ、内容物を軽く混ぜます。
  5. 2つのフェーズを落ち着かせることによって形成しましょう。ジエチルエーテル相を回収し、新しいチューブに移します。洗浄工程を合計3回繰り返します。
  6. 2mLの蒸留水でジエチルエーテルエキスを洗浄し、ジエチルエーテルに対応する上部を新しいチューブに移します。洗浄工程を合計3回繰り返します。
  7. ジエチルエーテルエキスの上に無水硫酸ナトリウム2gを加えて乾燥させます。
  8. サスペンションをフィルタリングします。窒素ガスフラックスを使用して内容を蒸発させます。
  9. メチル化工程を行うために、45mLのジエチルエーテルと9mLのジエチルエーテルで形成された予冷溶液にN-ニトロソ-N-メチル尿素の3gを蒸留水に溶解する。
    注意: N-ニトロソ-N-メチル尿素は、毒性、刺激性、発がん性、有害物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
  10. 上清(ジアゾメタン)を、水酸化カリウムペレット(約30g)を含む氷で冷却した新しいフラスコに移します。
    注:上清がすぐに使用されない場合は、-20°Cで最大1時間保存することができます。
    注意:水酸化カリウムペレットは刺激性および腐食性物質です。この材料は、適切な個人的な保護具(実験室のコート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用した層流フードに使用する必要があります。
    注意:ジアゾメタンは非常に有毒であり、潜在的に爆発的です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用した安全ガラスを備えたラミナーフローフードに使用する必要があります。
  11. ジアゾメタンを含むエーテル溶液の2mLを加え、ステップ3.10で得られ、ミジル酸を含む乾燥ジエチルエーテル抽出物に、ステップ3.8で得た。室温で15分間インキュベートします。
  12. 40°Cで懸濁液を蒸発させます。 チューブに窒素ガスを充填し、閉じ、メチル化した脂質を4°Cで保存します。
    注:エーテルが黄色を失うまで、ラミナーフローフードの下でエーテル溶液からジアゾメタンを蒸発させます。

4. 薄層クロマトグラフィー(TLC)解析

  1. ガラスTLCチャンバーを飽和させる。これを行うには、ろ紙の一部でTLCチャンバーの壁の一つをカバーし、それが溶媒の混合物によって構成される移動相と接触することを可能にする。溶媒の残りの容積をTLCチャンバーの底に置きます。
    注:TLCチャンバの底部は、移動相の少なくとも1 cmで覆う必要があります。本実験では、異なる移動相を用いたTLCの開発が行われました。85 mLのn-ヘキサンと15 mLのジエチルエーテルで構成されていました。ジクロロメタン 100 mL;クロロホルム90mL、メタノール10mL、水1mL;クロロホルム30mL、メタノール8mL、水1mLを加えたもの。60 mLのクロロホルム、メタノール35 mL、水8 mLを加えたもの。95 mL クロロホルムプラス 5 mL メタノール;90 mLの石油エーテル(60-80 °C)に10 mLのジエチルエーテルを加えた。
    注: 2 次元 TLC では、第 1 方向に n-ヘキサン:アセトン (95:5) を 3 回使用し、トルエン:アセトン (97:3) を 2 番目の方向に 1 回開発して、ミコン酸組成を分析します。PIMを分析するには、クロロホルム:メタノール:水(60:30:6)を1回第1方向に使用し、クロロホルム:酢酸:メタノール:水(40:25:3:6)を2番目の方向に使用します。PDIMおよびAGを分析するには、石油エーテル(60-80°C):酢酸エチル(98:2)を第1方向に3回使用し、2番目の方向に石油エーテル(60-80°C)で単一の開発を使用します。
    注意:ジエチルエーテルは、潜在的に有毒で有害な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
    注意:ジクロロメタンは潜在的に有毒で有害な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
    注意:石油エーテルは、潜在的な可燃性、環境に有害および非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
    注意:酢酸は、潜在的な可燃性および腐食性物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
    注意:酢酸エチルは可燃性および有害物質である。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
    注意:アセトンは可燃性および有害物質である。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
  2. TLCチャンバーを閉じて、少なくとも20分間飽和します。一方、ガラス管に存在する脂質を0.2~1mLのクロロホルムに溶解する。
    注:脂質の溶解に使用される体積は、サンプルの所望の濃度または予想濃度に応じて変更することができます。
  3. キャピラリーガラスチューブを使用して各懸濁液を10μL塗布し、室温で5分間乾燥させます。
    注:サンプルは、プレートの下部に1cmを残して各側面に塗布する必要があります。サンプルは、少なくとも0.5cmのために別のサンプルから分離する必要があります。サンプルをプレートに塗布すると、チューブを窒素ガスで再び蒸発させ、4°Cで保存してさらに使用することができます。
  4. 移動相を含む飽和TLCチャンバにプレートを挿入します。モバイル フェーズが TLC を通過できるようにします。
    注:TLCチャンバに適用される動きは、プレート上の実行中の溶媒に影響を与え、脂質移動度に影響を与えます。2次元TLCを行う場合、2つのTLCチャンバは、両方の溶出系を含む必要があります。
  5. 溶媒がプレートの上端から1cmの距離に達したら、TLCチャンバーからプレートを取り外します。シリカが完全に乾燥するまで、プレートを層状フラックスの下に置いておきます。
    注:n-ヘキサンとジエチルエーテル(85:15)を使用してミコン酸組成を分析する場合は、TLCプレート上で移動相を3回実行するまで、ステップ4.4と4.5をさらに2回繰り返します。
  6. 必要な汚れでプレートを明らかにする。必要に応じてプレートを加熱します。
    注:本実験では、TLCプレートを噴霧するために15〜20mLの溶液を使用しました:10%モリブダリン酸水和物は、プレートが明るい黄色になるまでエタノール中に水和し、その後120°Cでプレートを加熱します。硫酸中の20%αナフトールのエタノールで5%、その後120°Cでプレートを加熱した。リン酸バンドが出現するか、硫酸中に1%の位座になるまでのモリブデンブルー試薬(4.2M硫酸中の1.3%の酸化モリブデン)
    注意: モリブダトリン酸水和物は可燃性および腐食性物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
    注意:エタノールは、潜在的な可燃性および有害物質である。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
    注意:1-ナフトールは可燃性、腐食性、および非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
    注意:モリブデンブルースプレー試薬は、腐食性、毒性、および非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。

結果

異なるマイコバクテリア種に存在する広範な脂質を示すことを目的として 、M.ボビス BCGは、荒くて成長が遅いマイコバクテリアとして選択された。荒くて急速に成長している M.フォルチュイタム と M.ブルマエ を手順に追加し、最後に 、M.膿瘍 の滑らかな形態も含まれていた。これらの4種は、アシルトレハロース(AT)、G百属、PDIM、PGL、PIM、TDM、TMMなどのマイコバ?...

ディスカッション

マイコバクテリア細胞壁から非共有結合脂質化合物を抽出するためのゴールドスタンダード法として考えられる簡単なプロトコルが提示される。さらに、4つの異なるマイコバクテリアの抽出脂質から1次元および2次元TlCsによる可視化が示されている。

マイコバクテリア細胞の脂質含量を回収するクロロホルムとメタノールの2つの連続した混合物は、最も広く使用されて...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、スペイン科学イノベーション大学省(RTI2018-098777-B-I00)、FEDERファンド、カタルーニャのジェネラリタット(2017SGR-229)によって資金提供されました。サンドラ・グアラ=ガリドは、ジェネラリタット・デ・カタルーニャから博士号契約(FI)を受け取っています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic AcidMerck100063CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur
AcetoneCarlo Erba400971NCAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000
AnthroneMerck8014610010Anthrone for synthesis.
BenzeneCarlo Erba426113CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l
Capillary glass tubeMerckBR708709BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark
ChloroformCarlo Erba412653CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L
Dry block heaterJ.P. Selecta7471200
DicloromethaneCarlo Erba412622CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L
Diethyl etherCarlo Erba412672CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L
Ethyl AcetatePanreac1313181211CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO
Ethyl Alcohol AbsoluteCarlo Erba4146072CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Glass funnelVidraFOCDURA.2133148 1217/1
Glass tubeVidraFOCVFOC.45066A-16125Glass tube with PTFE recovered cap
MethanolCarlo Erba412722CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L
Molybdatophosphoric acid hydrateMerck51429-74-4CAUTION.
Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%SigmaM1942-100MLCAUTION.
n-hexaneCarlo Erba446903CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L
n-nitroso-n-methylureaSigmaN4766CAUTION
Orbital shaking platformDDBiolab995018NB-205L benchtop shaking incubator
Petroleum ether (60-80ºC)Carlo Erba427003CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L
SprayerVidraFOC712/1
Sodium sulphate anhydrousMerck238597
Sulfuric acid 95-97%Merck1007311000CAUTION. Sulfuric acid 95-97%
TLC chamberMerckZ204226-1EARectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
TLC plateMerck1057210001TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Plate HeaterCAMAG223306CAMAG TLC Plat Heater III
TolueneCarlo Erba488551CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
VortexFisher Scientific10132562IKA Agitador IKA vórtex 3
1-naphtholSigma-Aldrich102269427CAUTION.

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