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摘要

这里提出的是植入慢性颅窗的方案，用于在清醒的头部约束小鼠中对脑细胞进行纵向成像。

摘要

为了充分了解行为动物中神经元和神经胶质细胞的细胞生理学，有必要可视化它们的形态并记录它们在行为小鼠 体内 的活动。本文描述了一种植入慢性颅窗的方法，以允许在清醒的头部抑制小鼠中对脑细胞进行纵向成像。结合遗传策略和病毒注射，可以用结构或生理标记标记特定的细胞和感兴趣的区域。该协议展示了如何结合病毒注射来标记皮层中表达GCaMP6的星形胶质细胞附近的神经元，以便通过颅窗同时对两个细胞进行成像。相同细胞的多光子成像可以在清醒的，行为正常的动物中进行数天，数周或数月。这种方法为研究人员提供了一种实时观察细胞动力学的方法，可以应用于回答神经科学中的许多问题。

引言

在小鼠皮层中进行体内多光子荧光显微镜检查的能力对于研究细胞信号传导和结构1，2，3，4，5，6，7，8，9，疾病病理学10，11和细胞发育12，13至关重要.通过植入慢性颅窗，可以进行纵向成像，允许在活体动物中对皮质区域进行数天，数周或数月13，14的重复成像。多光子显微镜是体内重复成像的理想选择，因为改进了深度探测，减少了与所用红外激光相关的光损伤。这允许研究各种皮质区域中特定细胞的分子和细胞动力学。

多光子显微镜已用于小鼠神经元和神经胶质细胞的体内成像15，16，17，18，19，20。可以实施各种策略来标记特定的细胞类型和感兴趣的区域。一种常见的方法是使用Cre-Lox重组系统以细胞特异性方式驱动遗传编码荧光蛋白的表达。这可以用转基因小鼠进行，例如，将tdTomato"floxed"小鼠（Ai14）与在感兴趣的启动子21下表达Cre-重组酶的小鼠杂交。或者，可以通过病毒注射实现细胞和位点特异性标记。在这里，在细胞特异性启动子下编码Cre重组酶的病毒和编码絮状目的基因的病毒被注射到定义的区域中。然后，接受两种病毒载体的适当细胞类型将表达所需的基因。这些基因可以是结构标记，如tdTomato，以查看细胞形态变化22或遗传编码钙指示剂（GECI），如GCaMP和/或RCaMP，以检查钙动力学23。遗传重组的方法可以单独或组合地用于标记一种或多种细胞类型。第三种方法，不需要转基因小鼠或病毒构建体（其具有有限的包装能力），是在24的DNA构建体的子宫电穿孔中。根据电穿孔的时间，可以靶向不同的细胞类型25，26，27。

当进行多光子成像时，可以在清醒或麻醉时对小鼠进行成像。清醒小鼠的成像可以通过通过连接的头板28固定小鼠来进行。这种方法通过允许动物相对自由地移动来减轻压力，例如自由漂浮，空气支撑的聚苯乙烯泡沫塑料球29，自由漂浮的跑步机1，或空气提升的家庭笼子系统，其中小鼠被连接的头板固定并允许在开放的腔室30中移动。对于这些成像条件中的每一种，首先需要使小鼠习惯于成像设置。本文描述了使用空气提升家庭笼系统的习惯化和成像过程。

该协议描述了在皮层中植入用于纵向 体内 成像的慢性颅窗。在这里，我们将使用在星形胶质细胞中有条件表达GCaMP6f的小鼠来监测钙信号传导动力学。此外，本文描述了使用tdTomato作为神经元标签的病毒注射程序。这允许确定神经元突触结构的变化和/或作为结构标志物的可用性，从而实现对同一星形胶质细胞的重复成像。在整个实验方案中，将突出显示关键步骤，以确保从多光子显微镜获得的最佳图像质量。

研究方案

所有动物实验均按照内布拉斯加大学医学中心IACUC批准的指南进行。

1. 手术前

  1. 准备用于病毒注射的移液器。使用移液器拉动硼硅酸盐玻璃毛细管，并以20°角斜移移液器。对移液器进行灭菌过夜。
  2. 将新鲜的无菌凝胶泡沫切成小方块，准备它们。将凝胶泡沫浸入含有0.5mL盐水的无菌微量离心管中。使用前将凝胶泡沫浸泡在盐水中至少30分钟。
  3. 通过将海绵条切成薄条来准备新鲜的海绵条。
  4. 手术前20分钟，腹膜注射4-6周龄的GRAST-CreER / GCaMP6f小鼠，0.2mg / kg地塞米松以防止脑肿胀，5mg / kg卡洛芬减少炎症。
    注意:为了诱导GCaMP6f在大约40%的星形胶质细胞中的重组和表达，在3周时连续5天向GLAST-CreER / GCaMP6f小鼠注射100mg / kg他莫昔芬。

2. 手术开始

  1. 20分钟后，用3%异氟醚用氧气以1 L / min的流速麻醉小鼠约1.5分钟。
  2. 麻醉后，将鼠标放在立体定位框架上，该框架位于水再循环毯上，以在整个手术过程中保持37°C的体温。使用鼻夹和耳杆将鼠标固定在框架上。确保鼻夹和耳杆足够稳定，以便头部在手术过程中不会移动，但不要太紧以至于颅骨受损。
  3. 用1-1.5%异氟醚和氧气以1-2 L / min的流速维持麻醉。请注意，一些动物可能需要或多或少的异氟醚来维持镇静。监测动物的呼吸及其对脚趾和尾巴夹子的反应，并适当调整异氟醚。
  4. 使用棉签涂抹器将眼药膏涂抹在每只眼睛上，以防止眼睛在手术过程中变干。
  5. 使用啮齿动物修剪器，将头发从颈部剃到刚好经过眼睛。小心确保动物的胡须不会被意外修剪。
  6. 用一个碘制备垫清洁剃须区域，然后用一个酒精准备垫清洁。
  7. 使用无菌组织钳和手术剪刀，从前额缝合线切除皮肤，一直到后部到λ。
  8. 切除皮肤后，在颅骨中加入约0.1毫升1%木洛卡因（利多卡因与肾上腺素1:200，000），以尽量减少颅骨出血。
  9. 使用连接到手柄上的11号无菌碳钢手术刀片，轻轻地从颅骨上刮下结缔组织。在去除颅骨边缘附近的结缔组织时要格外小心，因为任何剩余的组织都可能阻止玻璃或头板在以后的强烈粘附。
  10. 使用无菌组织钳从颅骨中去除松散的结缔组织。
  11. 使用无菌棉头涂抹器，清除颅骨上残留的木洛卡因。
  12. 完成后，使用浸有丙酮的无菌棉头涂抹器彻底脱脂颅骨。使用压缩空气立即吹干头骨。

3. 开颅手术

  1. 使用细点标记和标尺，在所需位置测量开口的适当尺寸。通过将开口与盖板玻璃的尺寸（直径3或5毫米）进行比较来确认开口的尺寸;确保开口略小于盖板玻璃的尺寸。
  2. 使用牙钻，逐渐勾勒开口的轮廓，使骨骼变薄。缓慢钻孔以防止钻穿骨头，并在同心圆中钻孔，以促进骨骼均匀变薄。
  3. 每次同心走刀后，向钻孔区域添加一滴或两滴无菌盐水。让生理盐水静置至少10秒，以防止骨骼过热并损坏下面的硬脑膜。
  4. 使用无菌棉头涂抹器吸收任何剩余的盐水。将压缩空气吹过该区域，以确保在恢复钻孔之前所有剩余的盐水都已蒸发。这样做可以吹走残留的骨屑。
  5. 重复步骤3.2-3.4，直到骨头充分变薄以进行移除。
  6. 确保骨头充分变薄以进行移除，方法是用细镊子轻轻推动骨的中心区域，以检查变薄的颅骨是否移动。在钻孔发生的地方，下面的脉管系统应该是可见的。观察骨骼可能看起来好像会在变薄的地方开裂。
    注意:这个阶段的训练对于确定骨骼何时适当变薄至关重要。
  7. 在尝试移除骨头之前，请检查鼠标以确保其完全镇静。如果没有，逐渐增加异氟醚的维持，以防止在取出骨头时脑肿胀。
  8. 将一小块浸透了盐水的凝胶泡沫加入到变薄的颅骨中。在变薄的颅骨上再加入一到两滴盐水。
    注意:在变薄的颅骨上有大量的盐水有助于减少出血，并在去除骨瓣时保护硬脑膜。
  9. 使用微型15°尖刀片，小心地将刀片插入变薄的骨头中，并沿着变薄的骨头切割。将凝胶泡沫浸泡在盐水中，以阻止可能发生的任何出血。
  10. 使用镊子，小心地抬起并取出骨头。尽可能温和，以避免对下层组织和脉管系统的损害。要格外小心，不要损坏硬脑膜。
  11. 去除骨瓣后，向皮质中加入一块浸透盐水的新鲜凝胶泡沫。添加几滴盐水以防止凝胶泡沫变干，因为这会对下层组织造成损害。

4. 病毒注射

  1. 使用立体定位设备进行病毒注射。
    1. 准备 AAV1。CaMKII.0.4.Cre（3×1013 个基因组拷贝（GC）/ mL的滴度）在1:5，000通过盐水中连续稀释。
    2. 准备AAV1的混合物。CaMKII.0.4.Cre （1:5，000） 和 AAV1.断续器。FLEX.td番茄（滴度为5×1012 GC / mL）在一小块parafilm上。
    3. 通过将移液器轻轻地放在溶液上，用病毒混合物填充吸头尺寸为20μm的无菌斜面玻璃移液器。
    4. 降低移液器，使其刚好接触大脑表面，并继续降低200-300μm进行L2/3注射。使用细胞内显微注射分配系统（见 材料表），在2分钟内加压注射12-15次（20 psi，9 ms脉冲持续时间）。每次注射时观察移液器液滴中的半月板，以确保移液器不堵塞。
    5. 注射后，将移液器留在大脑中4-5分钟以防止回流。慢慢收回移液器。
    6. 在2-3个位点（相距约500μm）重复注射。
    7. 丢弃用于将Cre病毒连续稀释到10%漂白剂中的用过的玻璃移液器，parafilm，移液器吸头和微量离心管。

5. 颅窗植入术

  1. 去除任何凝胶泡沫，并使用一小条海绵条吸收任何剩余的盐水。
  2. 在开口处加入几滴抗生素恩诺沙星（22.7μg/ mL），并使其保持1分钟。1分钟后，使用一块新鲜的海绵条吸收任何剩余的恩诺沙星。再重复此过程两次。
  3. 第三次洗涤后，在开口处加入几滴盐水，让它在那里停留1分钟。1分钟后，使用一块新鲜的海绵条吸收任何剩余的盐水。再重复此洗涤过程两次，第三次洗涤后，在开口处加入一小滴盐水。
  4. 将盖玻片放在开口处。使用镊子确保玻璃在开口处齐平，以获得高质量的图像。
  5. 在轻轻地将玻璃固定到位的同时，在玻璃的周围涂上氰基丙烯酸酯粘合剂凝胶（材料表），以将窗户的边缘密封到头骨上。确保不要让胶水渗入盖板玻璃下方，并尽可能多地将胶水从盖板玻璃表面移开。
  6. 在粘合凝胶上涂上一层超级胶水。在胶水上添加一层牙科水泥液体，使其变硬。
  7. 取一个大小合适的直升机型头板，在中央开口周围涂上一层薄薄的胶水。将头板放在盖板玻璃上，让胶水短暂干燥。
  8. 在1.5 mL微量离心管中，将牙科水泥粉添加到管上的0.1 mL标记中。加入7-8滴快速固化，瞬干胶，混合。用19 G针头吸入1 mL注射器中，该针头已被切割以形成更大的开口。
  9. 将混合物通过直升机杆的侧孔注入，直到它从两侧渗出。将牙科水泥/粘合剂混合物涂在暴露的颅骨的其余部分，将头板固定在颅骨上，这将减少成像过程中的运动伪影。
  10. 让混合物风干至少15分钟。
  11. 皮下注射0.5mL盐水以帮助小鼠恢复。

6. 后期操作

  1. 从立体定位框架中取出鼠标，然后将其放回固定架。
  2. 将笼子的一部分放在水再循环毯，空间凝胶加热垫或等温垫上，以帮助恢复。
  3. 除了常规饮食外，还为动物提供少量食物颗粒和湿食物，以进一步帮助恢复。在恢复期间，手术后每天添加新的食物颗粒和湿食物。
  4. 手术后的第二天，给小鼠注射一次5mg / kg卡洛芬和5mg / kg恩诺沙星。
  5. 在第2-6天，向小鼠注射一次5mg / kg卡洛芬，两次注射5mg / kg恩诺沙星，等待当地IACUC批准。将恩诺沙星注射液分开至少8小时。
  6. 在第7-20天，每天向小鼠注射5mg / kg卡洛芬。

7. 动物成像习惯

  1. 手术后第14天，检查颅窗的光学清晰度。不要使用窗口不清晰或其他损坏的小鼠（即，过度血管生成）。
  2. 在荧光显微镜下检查tdTomato表达。如果可以识别标记的细胞，请继续进行动物习惯化。
  3. 习惯化（处理）的第一天
    1. 握住鼠标几分钟，并在处理后将其放回笼子。重复处理三次，每次训练间隔15分钟。
    2. 在第三次试验之后，通过将动物包裹在一小块布中来习惯小鼠。
    3. 用布包裹的鼠标约1分钟。
    4. 试用后，将鼠标放回笼子。再重复此过程两次，每次试验之间间隔15分钟。
  4. 习惯化的第二天
    1. 称重并记录鼠标重量。
    2. 用布包裹鼠标，并通过其头板将其固定在空气提升的家庭笼子的头部固定臂上。
    3. 将家庭笼子暴露在光线下。
    4. 让鼠标固定在移动房屋笼中15分钟。
    5. 习惯化后，将鼠标从家庭笼中取出并关闭气流。
    6. 称量鼠标的重量并将其放回笼子里。注意只包括体重减轻不超过10%的小鼠。从成像实验中排除在习惯性的任何一天中体重减轻超过10%的小鼠。
  5. 习惯化及以后的第三天
    1. 称重并记录鼠标重量，然后将其固定到空气抬起的家庭笼子上。
    2. 将鼠标固定在空气抬起的家用笼子上。
    3. 用一些能提供黑暗内部的东西（如盒子）盖住家笼子，让鼠标保持固定30分钟。
    4. 30分钟后，揭开家笼，取下鼠标，关闭气流。
    5. 称量并记录习惯后小鼠的体重。
    6. 每天重复此过程，将鼠标固定在家庭笼子上的持续时间增加15分钟。继续此过程，直到鼠标可以固定在家笼中1.5小时，因为这是双光子成像会话的近似持续时间。
    7. 为了让鼠标习惯于噪音，请在显微镜上进行一些习惯化过程，以使鼠标适应激光扫描镜的声音。排除未能充分习惯的小鼠（即发声和压力诱导的排便）。

8. 多光子成像

  1. 手术后 3 周开始影像学检查，以便窗口清除。
  2. 在配备Ti:Sapphire激光器的定制或商用多光子显微镜上进行成像。使用高数值孔径 （NA） 水浸物镜采集图像。
    注意:双通道成像是通过使用565 nm二向色镜和两个外部光电倍增管实现的。535/50带通滤波器用于检测GCaMP6f发射，610/75带通滤波器用于检测tdTomato。使用25倍水浸物镜（1.05 NA）和谐振扫描仪来采集 图1 和 图2所示的图像。每个感兴趣区域由一堆轴向相隔1μm的图像组成。每个光学部分以512 x 512像素，0.18μm/像素收集。图像是从初级运动皮层的前肢区域获得的，由立体定位坐标确定。
  3. 将激光器的波长设置为920 nm（如果使用红移GECI，则为990 nm）。
  4. 将鼠标放在移动房屋笼子上，然后将头板夹在头部固定臂上。
  5. 在窗户中心加几滴水。
  6. 使用显微镜的宽视场模式，选择2-3个易于识别的脉管系统位置。保存这些血管的图像，并记录出现在运动控制器上的X和Y坐标，以重新定位tdTomato标记的树突，以便进行后续成像。每次调整 X 和 Y 坐标，以与保存的血管图像重新对齐。
  7. 一旦对脉管系统进行成像并记录位置，请定位具有表达tdTomato的神经元的区域（图1）。成像神经元的突触结构（树突和轴突）和星形胶质细胞中的GCaMP6f活性。
    注意:树突将作为地标，可靠地返回到相同的区域，并在重复的几天内成像相同的树突和星形胶质细胞。在稳定的头部固定和习惯性到头部固定后，在成像平面上没有观察到可检测到的变化。在 X 和 Y 方向上发生的位移经过运动校正。
  8. 成像后，将鼠标放回笼子。
    注意:小鼠通常在范围内保持最多2小时。当成像持续很长时间时，物镜下的水可能会变干。在实验过程中应加水。或者，可以使用超声凝胶代替水。

结果

颅窗的质量可以通过神经元结构的清晰程度来评估。在良好的窗口中，树突状棘清晰可见（图1）。通过存储结构和位置数据，可以对同一动物进行数天，数周或数月的重复成像以检查相同的细胞（图1）。 图1 中的图像是从初级运动皮层的前肢区域（在5 mm窗口中）获得的。可以测量各种参数，包括树突棘和轴突的密度和动力学，?...

讨论

在这里，我们提出了一种植入慢性颅窗的方案，用于在空气抬起的家庭笼子上对清醒的头部受限小鼠进行皮质星形胶质细胞和神经元的 体内 成像。已经提供了颅窗应用用于表达GECI和神经元突触结构的星形胶质细胞成像的具体示例。通过使用多光子显微镜，可以在几天内重复记录星形细胞钙信号传导动力学和结构突触动力学。

慢性颅窗提供良好的光学成像质量，并允?...

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
15o Pointed BladeSurgistar6500Surgery Tools
19 G NeedlesBD305186Surgery Supply
AAV1-CAG-FLEX-tdTomatoAddgene28306-AAV1Viral Vector
AAV1-CaMKII-0-4-CreAddgene105558-AAV1Viral Vector
ActeoneFisher ScientificA16P4Reagent
Alcohol Prep PadsFisher ScientificCovidien 5750Surgery Supply
BevelerNarishigeEquipment
Borosilicate GlassWorld Precision InstrumentsTW100F-4Surgery Supply
Carbide BursSS White Dental14717Surgery Tools
Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mLZoetis Mylan Institutional, LLC.Drug
Compressed AirFisher Scientific23-022-523Surgery Supply
Cotton Tip ApplicatorsPuritan836-WC NO BINDERSurgery Supply
Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mmWarner Instruments64-0720, 64-0700Surgery Supply
Dental DrillAsepticoEquipment
Dexamethasone, 4 mg/mLMylan Institutional, LLC.Drug
Dissecting MicroscopeNikonEquipment
Duralay Liquid  (dental cement liquid)Patterson Dental602-8518Reagent
Duralay Powder  (dental cement powder)Patterson Dental602-7932Reagent
Enrofloxacin, 2.27%BayerDrug
Eye OintmentDechra17033-211-38Surgery Supply
Fiber Lite High Intensity IlluminatorDolan-Jenner IndustriesEquipment
Forceps (Large)World Precision Instruments14099Surgery Tools
Forceps (Small)World Precision Instruments501764Surgery Tools
GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/JThe Jackson LaboratoryStock No: 024105Mouse line
GerminatorFisher ScientificEquipment
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/JThe Jackson LaboratoryStock No: 012586Mouse Line
HeadplateNeurotarModel 1, Model 3Surgery Supply
Hemostatic forcepsWorld Precision Instruments501705Surgery Tools
Holder for 15o Pointed BladeWorld Precision Instruments501247Surgery Tools
Holder for Scalpel BladesWorld Precision Instruments500236Surgery Tools
Iodine Prep PadsAvantor15648-926Surgery Supply
IsofluranePiramalSurgery Supply
Isoflurane table top system with Induction BoxHarvard ApparatusEquipment
Isoflurane VaporizerSurgiVetEquipment
Krazy GlueOffice DepotKG517Reagent
Loctite 401Henkel40140fast-curing instant adhesive
Loctite 454Fisher ScientificNC9194415cyanoacrylate adhesive gel
Micropipette PullerSutter InstrumentsEquipment
Multiphoton MicroscopeEquipment
NitrogenMathesonNI M200Gas
OxygenMathesonOX M250Gas
PicospritzerParkerintracellular microinjection dispense system
Pipette TipsRainin17014340Surgery Supply
Rodent Hair TrimmerWahlEquipment
Saline (0.9% Sodium Chloride)Med Vet InternationalRX0.9NACL-30BACSurgery Supply
Scalpel Blades, Size 11Integra4-111Surgery Tools
ScissorsWorld Precision Instruments503667Surgery Tools
Stereotaxic InstrumentStoeltingEquipment
Sugi Sponge Strips (sponge strips)Kettenbach Dental31002Surgery Supply
SURGIFOAM (gel foam)Ethicon1972Surgery Supply
Syringe with 26 G NeedleBD309625Surgery Supply
TamoxifenSigma AldrichT5648-1GReagent
Ti:Sapphire LaserCoherentEquipment
Transfer PipettesFisher Scientific13-711-9AMSurgery Supply
Water BlanketFisher ScientificEquipment
Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mLFresenius Kabi USADrug

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