Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para a implantação de uma janela craniana crônica para a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça.

Resumo

Para entender completamente a fisiologia celular dos neurônios e da glia no comportamento dos animais, é necessário visualizar sua morfologia e registrar sua atividade in vivo no comportamento de camundongos. Este artigo descreve um método para a implantação de uma janela craniana crônica para permitir a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça. Em combinação com estratégias genéticas e injeções virais, é possível rotular células específicas e regiões de interesse com marcadores estruturais ou fisiológicos. Este protocolo demonstra como combinar injeções virais para rotular neurônios nas proximidades de astrócitos que expressam GCaMP6 no córtex para imagens simultâneas de ambas as células através de uma janela craniana. Imagens multifoton das mesmas células podem ser realizadas por dias, semanas ou meses acordados, comportando animais. Essa abordagem fornece aos pesquisadores um método para visualizar a dinâmica celular em tempo real e pode ser aplicada para responder a uma série de perguntas em neurociência.

Introdução

A capacidade de realizar microscopia de fluorescência in vivo multifotônio no córtex dos camundongos é primordial para o estudo da sinalização celular e estrutura 1,2,3,4,5,6,7,8,9, patologia da doença ^10,11, e desenvolvimento celular^12,13 . Com a implantação de janelas cranianas crônicas, é possível imagens longitudinais, permitindo imagens repetidas de áreas corticais por dias, semanas ou meses^13,14 em animais vivos. A microscopia multifotônio é ideal para imagens in vivo, repetidas devido à melhor sondagem de profundidade e fotodamagem reduzida associada ao laser infravermelho utilizado. Isso permite o estudo da dinâmica molecular e celular de células específicas em várias regiões corticais.

A microscopia multifotal tem sido utilizada para imagens in vivo de células neuronais e gliais em camundongos 15,16,17,18,19,20. Várias estratégias podem ser implementadas para rotular determinados tipos de células e áreas de interesse. Uma abordagem comum é conduzir a expressão de proteínas fluorescentes geneticamente codificadas de forma específica das células usando o sistema de recombinação Cre-Lox. Isso pode ser realizado com camundongos geneticamente modificados, por exemplo, cruzando o tdTomato "floxed" mouse (Ai14) com um mouse expressando Cre-recombinase sob um promotor de interesse²¹. Alternativamente, a rotulagem específica de células e locais pode ser alcançada com injeções virais. Aqui, um vírus codificando Cre recombinase sob um promotor específico de células e um vírus codificando um gene de interesse floxed são injetados em uma região definida. Os tipos de células apropriados que recebem ambos os vetores virais expressarão os gene(s" desejados. Esses genes podem ser marcadores estruturais, como o tdTomato, para ver mudanças na morfologia celular²² ou indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como GCaMP e/ou RCaMP, para examinar a dinâmica do cálcio²³. Métodos de recombinação genética podem ser aplicados individualmente ou em combinação para rotular um ou mais tipos de células. Uma terceira abordagem, não exigindo camundongos transgênicos ou construtos virais (que têm capacidade limitada de embalagem), está na eletroporação uterótera de construções^{de DNA 24}. Dependendo do tempo da eletroporação, diferentes tipos de células podem ser direcionados 25,26,27.

Ao realizar imagens multifoton, os ratos podem ser visualizados enquanto estão acordados ou anestesiados. A imagem de ratos acordados pode ser realizada prendendo o mouse através de uma placa de cabeça^{anexada 28}. Essa abordagem torna-se menos estressante ao permitir a circulação relativamente livre do animal usando métodos, como bolas de isopor de flutuação livre, apoiadas pelo ar²⁹, esteiras flutuantes¹ ou um sistema de gaiola doméstica com ar levantado por ar onde os ratos são presos por uma placa de cabeça anexada e autorizados a se mover em uma câmara aberta³⁰. Para cada uma dessas condições de imagem, primeiro será necessário habituar os ratos à configuração de imagem. Este artigo descreve o procedimento de habitação e imagem usando um sistema de gaiola doméstica com ar.

Este protocolo descreve a implantação de uma janela craniana crônica para imagens longitudinais in vivo no córtex. Aqui, usaremos camundongos que expressam condicionalmente GCaMP6f em astrócitos para monitorar a dinâmica de sinalização de cálcio. Além disso, este artigo descreve o procedimento para injeções virais usando tdTomato como um rótulo para neurônios. Isso permite a determinação de mudanças na estrutura sináptica neuronal e/ou a disponibilidade como marcador estrutural que permite imagens repetidas do mesmo astrócito. Ao longo do protocolo, serão destacadas etapas cruciais para garantir a melhor qualidade possível das imagens obtidas a partir da microscopia multifoton.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo IACUC no Centro Médico da Universidade de Nebraska.

1. Antes da cirurgia

1. Prepare pipetas para injeções virais. Puxe capilares de vidro borossilicato usando um puxador de pipeta e coloque a pipeta em um ângulo de 20°. Esterilize as pipetas durante a noite.
2. Prepare peças frescas de espuma de gel estéril cortando-as em pequenos quadrados. Submergir a espuma de gel em um tubo microfuge estéril contendo 0,5 mL de soro fisiológico. Mergulhe a espuma de gel em soro fisiológico por pelo menos 30 minutos antes de usar.
3. Prepare pedaços frescos de tiras de esponja cortando-as em tiras finas.
4. Vinte minutos antes da cirurgia, injete camundongos GLAST-CreER/GCaMP6f de 4-6 semanas de idade intraperitoneal com 0,2 mg/kg dexametasona para evitar inchaço cerebral e 5 mg/kg de carprofeno para reduzir a inflamação.
   NOTA: Para induzir a recombinação e expressão do GCaMP6f em aproximadamente 40% dos astrócitos, os camundongos GLAST-CreER/GCaMP6f foram injetados com 100 mg/kg de tamoxifeno a 3 semanas por 5 dias consecutivos.

2. Início da cirurgia

1. Após 20 min, anestesia os camundongos com 3% de isoflurano com oxigênio a uma vazão de 1 L/min por aproximadamente 1,5 min.
2. Uma vez anestesiado, coloque o mouse em uma estrutura estereotaxa que se senta em uma manta de recirculação de água para manter uma temperatura corporal de 37 °C durante toda a cirurgia. Fixar o mouse na armação usando o grampo de focinho e as barras de ouvido. Certifique-se de que o grampo de focinho e as barras de ouvido estão estáveis o suficiente para que a cabeça não se mova durante o procedimento, mas não tão apertado que o crânio esteja danificado.
3. Mantenha a anestesia com isoflurane de 1-1,5% com oxigênio a uma vazão de 1-2 L/min. Note que alguns animais podem precisar de mais ou menos isoflurane para manter a sedação. Monitore a respiração do animal, bem como seus reflexos para as pinças dos dedo do dedo do poço e da cauda, e ajuste o isoflurane adequadamente.
4. Aplique pomada ocular em cada olho usando um aplicador de ponta de algodão para evitar que os olhos sequem durante o procedimento.
5. Usando aparadores de roedores, raspe o cabelo do pescoço para passar pelos olhos. Tenha cuidado para garantir que os bigodes do animal não sejam acidentalmente aparados.
6. Limpe a área raspada com uma almofada de preparação de iodo, seguida por uma almofada de preparação para álcool.
7. Usando fórceps de tecido estéril e tesoura cirúrgica, corte e remova a pele das suturas frontais anteriores à bregma até posteriormente a lambda.
8. Uma vez que a pele é removida, adicione aproximadamente 0,1 mL de 1% de xilocaine (lidocaína com epinefrina 1:200.000) ao crânio para minimizar o sangramento do crânio.
9. Usando uma lâmina cirúrgica de aço carbono de tamanho 11 estéril presa a uma alça, raspe suavemente o tecido conjuntivo do crânio. Tome cuidado extra ao remover o tecido conjuntivo perto da borda do crânio, pois qualquer tecido restante poderia evitar uma forte aderência do vidro ou placa da cabeça mais tarde.
10. Use fórceps de tecido estéril para remover tecido conjuntivo solto do crânio.
11. Usando aplicadores de ponta de algodão estéreis, limpe qualquer xilocaine restante do crânio.
12. Uma vez concluído, desengreça completamente o crânio usando um aplicador de ponta de algodão estéril mergulhado em acetona. Use ar comprimido para secar imediatamente o crânio.

3. Craniotomia

1. Usando um marcador de ponto fino e uma régua, meça o tamanho apropriado para a abertura no local desejado. Confirme o tamanho da abertura comparando-a com o tamanho do vidro de cobertura (3 ou 5 mm de diâmetro); certifique-se de que a abertura é ligeiramente menor do que o tamanho do vidro de cobertura.
2. Usando uma broca dentária, rastreie gradualmente o contorno da abertura, afinando o osso. Perfurar lentamente para evitar perfurar o osso, e perfurar em círculos concêntricos para facilitar o afinamento do osso.
3. Após cada passe concêntrico, adicione uma gota ou duas de soro fisiológico estéril à área perfurada. Deixe que o soro fisiológico se sente por pelo menos 10 s para evitar que o osso superaqueça e danifique a duração subjacente.
4. Use um aplicador de ponta de algodão estéril para absorver qualquer solução salina restante. Soprar ar comprimido sobre a área para garantir que todos os salinos restantes evaporaram antes de retomar a perfuração. Faça isso para explodir detritos ósseos que permanecem.
5. Repita as etapas 3.2-3.4 até que o osso esteja adequadamente afinado para remoção.
6. Certifique-se de que o osso está adequadamente diluído para remoção, empurrando suavemente a área central do osso com fórceps finos para verificar se o crânio diluído se move. A vasculatura subjacente deve ser visível onde a perfuração ocorreu. Observe que o osso pode aparecer como se rachasse onde ocorreu o afinamento.
   NOTA: O treinamento nesta fase é crucial para identificar quando o osso foi diluído adequadamente.
7. Antes de tentar remover o osso, verifique o mouse para ter certeza de que ele está completamente sedado. Caso não, aumente gradualmente a manutenção isoflurane para evitar o inchaço cerebral ao remover o osso.
8. Adicione um pequeno pedaço de espuma de gel saturado em soro fisiológico ao crânio diluído. Adicione uma ou duas gotas adicionais de soro fisiológico ao crânio diluído.
   NOTA: Ter bastante soro fisiológico sobre o crânio diluído ajuda a reduzir o sangramento e proteger a dura dura ao remover a aba óssea.
9. Usando uma lâmina pontiaguda de 15° em miniatura, insira cuidadosamente a lâmina no osso diluído e corte ao longo do osso fino. Mantenha a espuma de gel encharcada em soro fisiológico, pronta para parar qualquer sangramento que possa ocorrer.
10. Usando fórceps, levante cuidadosamente e remova o osso. Seja o mais gentil possível para evitar danos ao tecido subjacente e vasculatura. Tome muito cuidado para não danificar a dura-mãe.
11. Uma vez que a aba óssea é removida, adicione um pedaço fresco de espuma de gel saturado em soro fisiológico ao córtex. Adicione algumas gotas de soro fisiológico para evitar que a espuma de gel seque, pois isso causará danos ao tecido subjacente.

4. Injeções virais

1. Realize injeções virais usando um aparelho estereotaxico.
   1. Prepare AAV1. CaMKII.0.4.Cre (título de 3 × 10¹³ cópias de genoma (GC)/mL) em 1:5.000 por diluições seriais em soro fisiológico.
   2. Prepare a mistura de AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5.000) e AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (título de 5 × 10¹² GC/mL) em um pequeno pedaço de parafilm.
   3. Encha uma pipeta de vidro estéril com um tamanho de ponta de 20 μm com a mistura do vírus, colocando suavemente a pipeta na solução.
   4. Abaixe a pipeta de modo que ela apenas toque a superfície do cérebro e continue a baixar por mais 200-300 μm para injeções L2/3. Utilizando um sistema de dispensa de microinjeção intracelular (ver a Tabela de Materiais), injeção de pressão 12-15 vezes ao longo de 2 min (20 psi, 9 ms de duração do pulso). Observe o menisco na queda da pipeta com cada injeção para garantir que a pipeta não esteja bloqueada.
   5. Uma vez injetado, deixe a pipeta no cérebro por 4-5 minutos para evitar o fluxo de volta. Retraia lentamente a pipeta.
   6. Repita as injeções em 2-3 locais (aproximadamente 500 μm de distância).
   7. Descarte as pipetas de vidro usadas, parafilm, pontas de pipeta e tubos de microfuge usados para diluições seriais do vírus Cre em 10% de alvejante.

5. Implantação de janela craniana

1. Remova qualquer espuma de gel e use uma pequena tira de esponja para absorver qualquer solução salina restante.
2. Adicione algumas gotas do antibiótico enrofloxacina (22,7 μg/mL) à abertura e deixe que ele permaneça lá por 1 min. Depois de 1 min, use um pedaço fresco de tira de esponja para absorver qualquer enrofloxacina restante. Repita este processo mais duas vezes.
3. Após a terceira lavagem, adicione algumas gotas de soro fisiológico à abertura e deixe que ela permaneça lá por 1 min. Depois de 1 min, use um pedaço fresco de tira de esponja para absorver qualquer solução salina restante. Repita este processo de lavagem mais duas vezes e após a terceira lavagem, adicione uma pequena gota de soro fisiológico à abertura.
4. Coloque o vidro da tampa sobre a abertura. Use fórceps para garantir que o vidro esteja alinhado sobre a abertura para obter imagens de boa qualidade.
5. Enquanto segura suavemente o vidro no lugar, aplique gel adesivo de cianoacrilato (Tabela de Materiais) ao redor do perímetro do vidro para selar as bordas da janela ao crânio. Certifique-se de não deixar a cola escoar sob o vidro de cobertura, e manter o máximo de cola fora da superfície do vidro de cobertura possível.
6. Aplique uma camada de super cola sobre o gel adesivo. Adicione uma camada de líquido de cimento dental sobre a cola para permitir que ela endureça.
7. Pegue uma placa de cabeça do tipo helicóptero de tamanho apropriado e aplique uma fina camada de cola ao redor da abertura central. Coloque a placa da cabeça sobre o vidro de cobertura e deixe a cola secar brevemente.
8. Em um tubo de microfuça de 1,5 mL, adicione o pó de cimento dental à marca de 0,1 mL no tubo. Adicione 7-8 gotas de cura rápida, adesivo instantâneo e misture. Desenhe em uma seringa de 1 mL com uma agulha de 19 G que foi cortada para criar uma abertura maior.
9. Injete a mistura através dos orifícios laterais da barra de helicóptero até que ela escoe de ambos os lados. Aplique a mistura de cimento/adesivo dentário ao resto do crânio exposto para fixar a placa de cabeça no crânio, o que reduzirá os artefatos de movimento durante a imagem.
10. Deixe a mistura secar ao ar por pelo menos 15 minutos.
11. Injete 0,5 mL de soro fisiológico subcutâneamente para ajudar na recuperação.

6. Pós-operação

1. Remova o mouse do quadro estereotaxic e devolva-o à gaiola.
2. Coloque uma parte da gaiola em uma manta de re-circulação de água, almofadas de aquecimento de gel espacial ou almofadas isotermais para ajudar na recuperação.
3. Fornecer ao animal uma pequena dose de pelotas de alimentos e alimentos molhados, além de sua dieta regular, para ajudar ainda mais na recuperação. Adicione novas pelotas de alimentos e alimentos molhados todos os dias após a cirurgia durante a recuperação.
4. No dia seguinte à cirurgia, injete camundongos uma vez com 5 mg/kg de carprofeno e 5 mg/kg enrofloxacina.
5. Nos dias 2-6, injete os camundongos uma vez com 5 mg/kg de carprofeno e duas vezes com 5 mg/kg enrofloxacina, aguardando aprovação do IACUC local. Separe as injeções de enrofloxacina por pelo menos 8 h.
6. Nos dias 7 a 20, injete os ratos diariamente com 5 mg/kg de carprofeno.

7. Habituação animal para imagem

1. No dia 14, após a cirurgia, examine a janela craniana para obter clareza óptica. Não use camundongos com janelas não claras ou danificadas (ou seja, angiogênese excessiva).
2. Verifique se há expressão tdTomato sob um microscópio de fluorescência. Se as células rotuladas puderem ser identificadas, proceda com a habituação animal.
3. Primeiro dia de habituação (manuseio)
   1. Segure o mouse por alguns minutos e devolva-o à sua gaiola após o manuseio. Repita o manuseio três vezes com um intervalo de 15 minutos entre as sessões.
   2. Após o terceiro ensaio, habite o rato embrulhando o animal em um pequeno pedaço de pano.
   3. Segure o mouse enrolado em pano por aproximadamente 1 min.
   4. Após o julgamento, devolva o rato para sua gaiola. Repita este processo mais duas vezes, permitindo um intervalo de 15 minutos entre cada ensaio.
4. Segundo dia de habituação
   1. Pese e grave o peso do rato.
   2. Enrole o rato em pano e fixe-o através de sua placa de cabeça para o braço de fixação da cabeça da gaiola doméstica levantada a ar.
   3. Deixe a gaiola em casa exposta à luz.
   4. Deixe o mouse permanecer preso na gaiola doméstica móvel por 15 minutos.
   5. Após a habituação, remova o mouse da gaiola doméstica e desligue o fluxo de ar.
   6. Pese o rato e devolva-o para sua gaiola. Tome cuidado para incluir apenas camundongos que não perdem mais de 10% de seu peso corporal. Exclua camundongos que perdem mais de 10% de seu peso durante qualquer dia de habituação de experimentos de imagem.
5. Terceiro dia de habituação e além
   1. Pese e grave o peso do rato antes de segurá-lo à gaiola de ar.
   2. Segure o mouse na gaiola de casa levantada pelo ar.
   3. Cubra a gaiola doméstica com algo que forneça um interior escuro, como uma caixa, e deixe que o mouse permaneça seguro por 30 minutos.
   4. Depois de 30 minutos, descubra a gaiola, remova o mouse e desligue o fluxo de ar.
   5. Pese e grave o peso do mouse após a habitação.
   6. Repita este processo todos os dias, aumentando a duração do mouse é fixado na gaiola doméstica em 15 minutos. Continue este processo até que o mouse possa ser fixado na gaiola doméstica por 1,5 h, pois esta é a duração aproximada de uma sessão de imagem de dois fótons.
   7. Para habituar o mouse ao ruído, realize algumas sessões de habitação no microscópio para aclimatar o mouse ao som dos espelhos de varredura a laser. Exclua camundongos que não habituam o suficiente (ou seja, vocalizações e defecação induzida pelo estresse).

8. Imagem multifoton

1. Comece a imagem 3 semanas após a cirurgia para permitir que a janela se limpe.
2. Realize imagens em um microscópio multifoton personalizado ou comercialmente disponível equipado com um laser Ti:Sapphire. Adquira imagens usando um objetivo de imersão de água de alta abertura numérica (NA).
   NOTA: A imagem de dois canais é obtida usando um espelhodicróico de 565 nm e dois tubos fotomultiplier externos. Um filtro de bandpass 535/50 é usado para detectar emissão de GCaMP6f, e um filtro de bandpass 610/75 é usado para detectar tdTomato. Um objetivo de imersão em água de 25x (1,05 NA) e scanners ressonantes foram utilizados para adquirir imagens mostradas na Figura 1 e Figura 2. Cada região de interesse consistia em uma pilha de imagens separadas axially por 1 μm. Cada seção óptica foi coletada em 512 x 512 pixels, 0,18 μm/pixel. As imagens foram adquiridas da região do primeiro membro do córtex motor primário, conforme determinado pelas coordenadas estereotributicas.
3. Defina o comprimento de onda do laser para 920 nm (990 nm se um GECI de mudança vermelha for usado).
4. Coloque o mouse na gaiola doméstica móvel e aperte a placa da cabeça no braço de fixação da cabeça.
5. Adicione algumas gotas de água ao centro da janela.
6. Usando o modo de campo largo do microscópio, selecione 2-3 posições de vasculatura facilmente identificável. Salve as imagens desses vasos sanguíneos e registe as coordenadas X e Y que aparecem no controlador do motor para realocar os dendritos rotulados por TdTomato para sessões de imagem subsequentes. Ajuste as coordenadas X e Y cada vez para realinhar com as imagens salvas dos vasos sanguíneos.
7. Uma vez que a vasculatura tenha sido imageda e as posições registradas, localize as regiões com neurônios expressando tdTomato (Figura 1). Imagem as estruturas sinápticas (dendritos e axônios) de neurônios e atividade GCaMP6f em astrócitos.
   NOTA: Os dendritos servirão como marcos para retornar de forma confiável às mesmas regiões e imagem dos mesmos dendritos e astrócitos ao longo de dias repetidos. Não foi observada mudança detectável no plano de imagem com fixação estável da cabeça e após a fixação da cabeça. O deslocamento que ocorre nas direções X e Y é corrigido por movimento.
8. Após a imagem, devolva o rato para sua gaiola.
   NOTA: Os ratos são normalmente mantidos no escopo por um máximo de 2 h. Quando a imagem dura muito tempo, a água sob o objetivo pode secar. A água deve ser adicionada durante os experimentos. Alternativamente, um gel ultrassônico pode ser usado em vez de água.

Resultados

A qualidade da janela craniana pode ser avaliada pelo quão nítidas as estruturas neuronais aparecem. Em uma boa janela, espinhos dendráticos são claramente visíveis (Figura 1). Com os dados estruturais e posicionais armazenados, o mesmo animal pode ser imageado repetidamente por dias, semanas ou meses para examinar as mesmas células (Figura 1). As imagens na Figura 1 foram obtidas da região do primeiro quarto do córtex motor...

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação de janelas cranianas crônicas para imagens in vivo de astrócitos cortical e neurônios em ratos acordados e com cabeça em uma gaiola doméstica levantada pelo ar. Exemplos específicos foram fornecidos da aplicação da janela craniana para astrócitos de imagem que expressam GECIs e estruturas sinápticas neuronais. Com o uso de microscopia multifotítica, a dinâmica de sinalização de cálcio astrócito e a dinâmica sináptica estrutural podem ser regi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15o Pointed Blade	Surgistar	6500	Surgery Tools
19 G Needles	BD	305186	Surgery Supply
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato	Addgene	28306-AAV1	Viral Vector
AAV1-CaMKII-0-4-Cre	Addgene	105558-AAV1	Viral Vector
Acteone	Fisher Scientific	A16P4	Reagent
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	Covidien 5750	Surgery Supply
Beveler	Narishige		Equipment
Borosilicate Glass	World Precision Instruments	TW100F-4	Surgery Supply
Carbide Burs	SS White Dental	14717	Surgery Tools
Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL	Zoetis Mylan Institutional, LLC.		Drug
Compressed Air	Fisher Scientific	23-022-523	Surgery Supply
Cotton Tip Applicators	Puritan	836-WC NO BINDER	Surgery Supply
Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm	Warner Instruments	64-0720, 64-0700	Surgery Supply
Dental Drill	Aseptico		Equipment
Dexamethasone, 4 mg/mL	Mylan Institutional, LLC.		Drug
Dissecting Microscope	Nikon		Equipment
Duralay Liquid  (dental cement liquid)	Patterson Dental	602-8518	Reagent
Duralay Powder  (dental cement powder)	Patterson Dental	602-7932	Reagent
Enrofloxacin, 2.27%	Bayer		Drug
Eye Ointment	Dechra	17033-211-38	Surgery Supply
Fiber Lite High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries		Equipment
Forceps (Large)	World Precision Instruments	14099	Surgery Tools
Forceps (Small)	World Precision Instruments	501764	Surgery Tools
GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J	The Jackson Laboratory	Stock No: 024105	Mouse line
Germinator	Fisher Scientific		Equipment
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J	The Jackson Laboratory	Stock No: 012586	Mouse Line
Headplate	Neurotar	Model 1, Model 3	Surgery Supply
Hemostatic forceps	World Precision Instruments	501705	Surgery Tools
Holder for 15o Pointed Blade	World Precision Instruments	501247	Surgery Tools
Holder for Scalpel Blades	World Precision Instruments	500236	Surgery Tools
Iodine Prep Pads	Avantor	15648-926	Surgery Supply
Isoflurane	Piramal		Surgery Supply
Isoflurane table top system with Induction Box	Harvard Apparatus		Equipment
Isoflurane Vaporizer	SurgiVet		Equipment
Krazy Glue	Office Depot	KG517	Reagent
Loctite 401	Henkel	40140	fast-curing instant adhesive
Loctite 454	Fisher Scientific	NC9194415	cyanoacrylate adhesive gel
Micropipette Puller	Sutter Instruments		Equipment
Multiphoton Microscope			Equipment
Nitrogen	Matheson	NI M200	Gas
Oxygen	Matheson	OX M250	Gas
Picospritzer	Parker		intracellular microinjection dispense system
Pipette Tips	Rainin	17014340	Surgery Supply
Rodent Hair Trimmer	Wahl		Equipment
Saline (0.9% Sodium Chloride)	Med Vet International	RX0.9NACL-30BAC	Surgery Supply
Scalpel Blades, Size 11	Integra	4-111	Surgery Tools
Scissors	World Precision Instruments	503667	Surgery Tools
Stereotaxic Instrument	Stoelting		Equipment
Sugi Sponge Strips (sponge strips)	Kettenbach Dental	31002	Surgery Supply
SURGIFOAM (gel foam)	Ethicon	1972	Surgery Supply
Syringe with 26 G Needle	BD	309625	Surgery Supply
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648-1G	Reagent
Ti:Sapphire Laser	Coherent		Equipment
Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	Surgery Supply
Water Blanket	Fisher Scientific		Equipment
Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL	Fresenius Kabi USA		Drug