用于单颗粒低温电子显微镜的生物标本的手动印迹和切入式冷冻

摘要

本手稿概述了手动冷冻生物标本以进行单颗粒低温电子显微镜的印迹和暴跌方法。

摘要

通过单颗粒低温电子显微镜（cryoEM）用电子成像生物标本以进行高分辨率结构测定，需要一层含有目标生物分子的玻璃体冰薄层。尽管近年来有许多技术进步将单颗粒冷冻电镜推向了结构生物学的前沿，但对标本进行玻璃化以进行高分辨率成像的方法通常仍然是限速步骤。尽管最近的许多努力为克服样品玻璃化过程中经常遇到的障碍提供了手段，包括开发新型样品支架和创新的玻璃化仪器，但由于购买成本低且易于操作，传统的手动操作柱塞仍然是cryoEM社区的主要产品。在这里，我们提供了使用标准的断头台式手动印迹和插孔装置对生物标本进行玻璃化的详细方法，以便通过单颗粒冷冻EM进行高分辨率成像。此外，还描述了标准制备未能产生合适样品时经常遇到的问题和故障排除建议。

引言

单粒子低温电子显微镜（cryoEM）是一种强大的结构技术，可用于将动态生物标本的结构求解为近原子分辨率^{1，2，3，4}。事实上，直接电子探测器技术的最新进展^{4，5，6，7，8，9，10}，电子源^{的改进4，11，12，13，14}和电磁透镜稳定性¹⁵，以及数据采集的持续发展^16，17 和分析软件包^18，19使研究人员能够常规地确定性能良好的标本的结构，分辨率为3 Å或更好^{4，11，13，14，20，21，22，23}.尽管这些改进了成像和数据处理能力，但冷冻电镜网格准备仍然是成功进行高分辨率结构测定的最大障碍，并且经常成为EM工作流程中相当大的瓶颈^{24，25，26，27}。

CryoEM依赖于对水溶液中的生物样品进行成像，这些溶液被冷冻以形成"玻璃状"冰的薄膜 - 这一过程称为玻璃化 - 保留了天然生化状态。用于冷冻电镜的生物样品的玻璃化可追溯到40多年前^28，29，30，为该过程开发的许多技术和设备都依赖于最初详细的印迹和暴跌法^{31，32，33，34，35}，其中将少量样品（例如，1-5μL）施加到专用的EM网格上，然后使用网格与转印纸的物理相互作用去除多余的溶液。该过程的时间通常由经验确定，因为冷冻样品的关键组成部分是玻璃体冰膜的厚度 - 如果冰太厚，则成像质量会由于电子束的散射增加而急剧下降，而太薄的冰会限制蛋白质取向和/或从网格箔孔的中心排除颗粒³⁶.这种对单颗粒冷冻机电偶术完美冰厚的依赖导致了可以冷冻样品的各种技术和设备，包括机器人^37，38，微流体⁴²和超声波或喷涂设备^{27，39，40，41，42，43，44}.近年来，一些最流行的样品制备设备依赖于使用机器人技术，使用印迹和暴跌技术自动冷冻样品⁴⁵。虽然这些设备旨在可重复地为成像创建适当的冰厚度，但它们通常对于单个实验室来说仍然过于昂贵，并且通常以每小时的使用费率在cryoEM设施中找到。近年来，最初的手动印迹和插孔技术已重新投入使用^{3，47，48，49，50，51，52}。事实上，手动操作的印迹和插孔设备可以实现高质量的冷冻EM网格，而成本只是机器人对应物的一小部分。此外，手动印迹还为用户提供了对印迹的更多控制，因为研究人员可以根据每个单独的样品和研究问题调整印迹类型（即网格的反转印，网格的前印转印等）和印迹时间。

在本文中，我们将详细介绍如何使用传统的手动转印和骤入式玻璃化装置以及定制设计的杜瓦瓶平台⁵³来有效冷冻生物样品。提供了最佳实践，包括冷冻剂的制备、网格处理、样品应用和印迹，以及常见的陷阱和如何克服这些障碍的建议。讨论了如何提高网格制备之间的冰厚度再现性以及如何根据生物样品类型修改样品印迹的建议。鉴于本手稿中描述的手动柱塞的购买和操作成本低廉，全球的实验室可以以具有成本效益和可重复的方式为冷冻电镜制备生物标本。

研究方案

1. 准备手动插孔环境

注:预计运行时间:5-30 分钟

1. 将手动柱塞放置在4°C的冷室中，加湿器可以放在同一位置，以保持房间接近100%相对湿度（RH）（图1A）。
   注意:请查阅机构的环境健康和安全指南，了解手动柱塞的安全位置和建议的操作。
2. 在准备电网之前，打开冷室中的加湿器，以确保冷室的RH≥95%。
   注:低湿度下的网格制备可能导致薄膜脱水、由于蒸发而改变缓冲器组分以及网格到网格的再现性降低⁴⁶。不建议将网格冻结在<80 % RH。
3. 确保冷室的温度在4°C。
4. 将手动柱塞放置在远离强气流的地方（即远离空调装置通风口），因为它们可能导致网格附近的湍流和/或冷表面上明显的积冰。

2. 准备插孔材料和配件

注:预计运行时间:1-5 分钟

1. 使用干净的剪刀将吸墨纸圆圈切成1-1.5厘米宽，约9厘米长的条带。避免触摸吸墨纸的中心，并丢弃较小的端部。重要的是要确保吸墨纸条干燥、干净且无污染物。将条带分开并放置在100毫米培养皿中。
2. 将一个 22x22 mm 的方形玻璃盖玻片放入单独的 60 mm 玻璃培养皿中。这种含盖玻片的玻璃培养皿将用于存储，转移和辉光放电网格。
   注意:建议在添加网格之前使用空气除尘器罐从载玻片上清除任何可见的碎屑。防静电枪也可用于去除积聚的任何静电。
3. 组装网格存储盒并为其贴上标签。
4. 获取 4 到 6 个干净干燥的夹紧镊子，并将它们定位到手动柱塞上。在切入之前，请目视检查每个镊子，以确保它们没有损坏并且没有污染物。

3.准备冷冻剂杜瓦瓶和手动柱塞

注:预计运行时间:5-15 分钟

1. 将平台底座安装在坠落杜瓦瓶的底部。将乙烷容器杜瓦瓶放在平台底座的顶部，加入黄铜乙烷容器，然后安装旋转网格存储平台。
   1. 一旦液氮（_LN2）被添加到沉入杜瓦瓶中，平台底座的高度就无法再调节。确保栅格底座安装正确且水平，以限制由于柱塞高度不当而导致的栅格和/或镊子损坏。
2. 冷冻前，检查手动柱塞和所有辅助设备，确保它们正常工作，以限制样品和/或网格损失。
3. 在每次冷冻之前，请更换用于固定镊子的手动柱塞臂上的胶带。房间的高湿度会使胶带粘合变质，降低胶带固定镊子的能力，增加镊子损坏和/或网格丢失的可能性。
4. 调整手动柱塞附近的灯，以确保有足够的光线来监测样品芯吸，并确保网格传输易于可视化，以防止网格损坏和/或丢失（见步骤3.7）。使用柱塞正后方的环形灯来观察液体运动，并使用杜瓦瓶附近的灵活臂任务灯来照亮冻结的网格。
5. 调整脚踏板张力，以确保杜瓦瓶插臂在升高位置时牢固地固定到位，并在踩下踏板时完全释放。在样品应用之前执行几次"干"运行，以确保柱塞正常工作。
   注意:脚踏板张力调整不当将导致跳闸臂过早释放（即张力设置得太低）和网格损失或栅格不完全插入乙烷容器（即张力设置得太高）。
6. 将坠落杜瓦瓶放在手动柱塞底部的正下方，并将其固定到位。使用连接的胶带将一对镊子连接到插孔臂上。在握住手动跳水臂的同时，踩下脚踏板 ，小心地 放下跳动臂，调整跳闸臂的行程，确保网格位于乙烷容器的中间。
7. 使用跳闸臂顶部的凸块，确定脚踏板完全踩下时跳闸臂的最终位置（图1B）。调整跳闸臂上的凸块停止高度，以调整乙烷容器中网格的位置（图1C）。
   注意:如果插臂高度设置不正确，则会导致网格和/或镊子损坏（例如，跳闸臂高度设置得太低）或玻璃化不足（例如，跳闸臂高度设置得太高）。
8. 在冷藏室外找到杜瓦瓶，然后继续制备液体乙烷（步骤4）。

4. 准备冷冻剂

注:预计运行时间:10-30 分钟

1. 评估乙烷罐、调节器、管道和乙烷点胶头是否有任何损坏迹象。在继续之前，立即报告并纠正任何损坏迹象。
   注意:压缩乙烷和乙烷:丙烷气体混合物易燃，如果处理不当，可能对生命构成严重威胁和/或造成伤害。如果不确定如何操作或处理压缩气罐，请咨询专家。在处理易燃压缩气体时，请参阅该机构的环境健康和安全指南。此外，液化乙烷是一种强大的冷冻剂，如果处理不当，可能会对生命和/或伤害构成严重威胁。在处理冷冻剂时，请参阅该机构的环境健康和安全指南。
2. 在适当的_LN2 处理杜瓦瓶中获取足够的_LN2 （即，3-4 L是电网准备和存储的典型值）。
   注意:_LN2 是一种冷冻剂，如果处理不当，可能会对生命和/或伤害构成严重威胁。
   1. 确保使用所有个人防护装备，以尽量减少受伤的风险。_LN2 的蒸气是一种窒息剂，应在通风良好的区域处理。如果不确定如何操作或处理低温容器和低温剂，请咨询专家。在处理冷冻剂时，请参阅该机构的环境健康和安全指南。对于不能在冷藏室中使用液氮的情况，我们建议在凉爽通风的空间中快速冷冻。
3. 在冷室外，通过将_LN2 直接倒入黄铜乙烷容器中来冷却沉入的杜瓦瓶，直到液氮水平达到乙烷容器的顶部（即，刚好在平台上方）。根据需要在乙烷容器外部加满_LN2 。当_LN2 停止剧烈冒泡时（约5分钟）继续下一步。
   1. 将_LN2 直接添加到黄铜乙烷容器中，以便在冷凝乙烷气体之前充分冷却容器。如果不能正确冷却黄铜乙烷容器，则会大大增加凝结乙烷所需的时间。
   2. 一旦杜瓦瓶达到_LN2 温度，避免过度填充杜瓦瓶，使_LN2 溢出到乙烷容器中。
4. 乙烷是一种压缩气体，需要液化才能使用。乙烷罐采用高纯度双级减压阀来控制气体流量。将管路连接到调节器出口阀，并使用末端连接的14号扁平金属点胶头来分配乙烷。
5. 在打开乙烷主罐阀之前，请确保压力调节旋钮和出口阀一直关闭。完全打开主罐阀，然后将出口阀打开至~50%。慢慢打开压力调节旋钮，直到观察到缓慢的气流。使用出口阀微调气流。
   注意:打开阀门或调整气体流量时，请始终将金属点胶头指向远离自身。
6. 缓慢启动气体流动，通过将乙烷气体管路的尖端插入去离子水的小烧杯中来评估流速。调整气体流量，直到流速 适度 干扰水。
   1. 调整气体流速以确保发生适当的乙烷冷凝 - 流速过慢将导致乙烷气体在点胶口中凝固，而流速过快将导致剧烈冒泡并防止冻结。
7. 在将乙烷气体管路的尖端插入黄铜乙烷容器之前，请用精致的工作湿巾清洁并擦拭点胶尖端，以除去任何水。
8. 在平稳快速的动作中，找到黄铜乙烷容器底部的气体分配尖端，并开始在乙烷容器底部周围缓慢地移动分配尖端。固体乙烷会立即形成，但随着更多的乙烷气体的加入/冷凝，会迅速液化。
   1. 继续移动乙烷容器底部的金属乙烷分配尖端，以液化固体乙烷。将乙烷容器装满3/4的液体乙烷（从顶部开始2-3个螺纹）。通过小心地从黄铜乙烷容器中取出金属乙烷分配尖端并关闭出口阀来阻止乙烷气体流动。
9. 在杜瓦瓶的侧面轻轻倒入_LN2，以避免_LN2 添加到黄铜乙烷容器中，直到液位刚好接触到黄铜乙烷容器。将泡沫盖放在低沉的杜瓦瓶上，以促进乙烷凝固。
   1. _LN2必须直接接触黄铜乙烷容器，以帮助乙烷的凝固。大约5分钟后，黄铜容器内的乙烷将完全冻结成固体。添加更多的_LN2，直到它刚接触乙烷容器，然后继续下一步。
10. 如果乙烷没有冻结固体，则黄铜乙烷容器不够冷，无法完成其余步骤。添加更多的_LN2 ，直到它刚接触乙烷容器，再等待5分钟。确保黄铜容器内的乙烷完全冻结成固体。
11. 打开气体出口阀，以与步骤4.6中确定的相似速率产生乙烷气体流量。将金属乙烷点胶头垂直放入固体乙烷中，并继续以圆周运动移动乙烷点胶头以熔化固体乙烷。
    1. 继续添加乙烷，直到它与黄铜乙烷容器的顶部齐平。从乙烷容器中慢慢取下尖端，并关闭乙烷罐出口阀。用盖子盖住杜瓦瓶约1-4分钟，让乙烷在黄铜乙烷容器的边缘周围固化。
       注:理想的乙烷容器在黄铜乙烷容器的周边将有一个2-3毫米对称的固体乙烷环，中心是液体乙烷（图1D 和 图2）。
    2. 确保乙烷尽可能冷而不凝固，以确保生物标本的适当玻璃化。未能正确制备液体乙烷可能导致标本玻璃化不足、冰积聚和/或标本丢失，所有这些都会导致成像标本质量的恶化。
    3. 如果2-3分钟后没有形成固体乙烷环，则在杜瓦瓶中加入更多的_LN2 ，然后再覆盖2-5分钟。
    4. 如果乙烷凝固过快，则使用一对干净的大镊子轻轻加热乙烷容器和/或固体乙烷，以防止乙烷完全凝固。一旦乙烷和_LN2 稳定，关闭所有乙烷罐阀，并将沉降杜瓦瓶定位到手动柱塞上。将沉入式杜瓦瓶固定在手动柱塞上。
       注意:转移杜瓦瓶时要格外小心，因为_LN2 会溢出到乙烷容器中并使液体乙烷固化。如果需要，可以使用一套干净的镊子来熔化容器中间的任何固体乙烷。
12. 用一对空镊子测试乙烷杜瓦瓶的位置，以确保镊子尖端位于乙烷容器的中心，并且有足够的空间容纳液体乙烷内部的网格和镊子尖端（图1D）。
    1. 如果固体乙烷环太厚，不便于网格处理，则使用一对室温，清洁镊子以熔化固体乙烷，并在乙烷容器的中心产生更多的冻结区域。

5. 准备电磁网格

注:预计运行时间:1-5 分钟

1. 将网格存储盒添加到杜瓦瓶中，拧下网格存储盒盖，并确保每个盖子可以自由旋转到新的网格插槽。
2. 小心地将网格从网格存储箱转移到方形玻璃盖玻片的边缘，其中约30-40%的网格离开滑动边缘。确保网格箔朝上。确保网格在不使用时被覆盖。将网格放置在方形玻璃盖玻片的边缘上，便于网格处理，并减少在传输过程中弯曲或损坏网格的机会。
   注意:通常一次准备 4-6 个网格。
3. 使用辉光放电器或等离子体清洁剂使网格具有亲水性。
   注:请参阅辉光放电器/等离子清洗机制造商提供的电网清洁建议指南。
   1. 在等离子体清洗后 10 分钟内使用网格，因为网格失去亲水性，并且在此时间之后网格到网格的再现性降低。

6. 通过骤降冷冻准备冷冻电镜标本

注:预计运行时间:>10 分钟（每个网格约 1-3 分钟）

1. 使用干净干燥的夹紧镊子捡起清洁的网格，向下滑动塑料夹以将网格固定到位，然后轻轻敲击镊子以确保网格正确固定。
   1. 通过外圈处理网格，以防止损坏网格箔。
2. 将1至5μL样品施加到网格的制备侧（例如，前侧或箔侧）。
   注:最佳体积和印迹时间取决于样品，需要针对每个样品进行优化。体积更大、粘度更强的样品需要更长的印迹时间。
3. 通过将胶带缠绕在镊子手柄上，将镊子网格样品组件固定到手动插臂上。
   1. 将样品朝向用户进行传统的正面印迹。如果样品需要背印，则将样品定位在远离用户的位置。
4. 在每只手的拇指和食指之间握住一张干净、干燥、切开的吸墨纸。
   1. 只能处理边缘的吸墨纸，切勿接触中心，因为手/手套的油和其他污染物会改变网格质量。
5. 将手放在坠落的杜瓦瓶的边缘，以建立稳定的位置。将印迹纸平行于网格表面定位，距离网格表面约 1 cm。
   1. 使用吸墨纸的中间部分，以实现完整的流体移动性，甚至在网格表面上进行芯吸。
6. 轻轻滑动并旋转拇指和无名指相互，将吸墨纸向网格弯曲以启动印迹。在整个印迹过程中，保持印迹纸与网格表面之间的接触。
   1. 将吸墨纸直接接触网格表面，并在网格表面上保持一致的接触。
   2. 轻轻弯曲吸墨纸可减少网格弯曲和/或对网格表面的损坏，并在整个网格上产生更一致的冰（图3A）。
7. 观察移动液体前部，一旦它停止进入吸墨纸，就开始计数4到6秒。
   注:一旦印迹纸接触到网格表面，就可以进行计数，但网格到网格的再现性可能会降低。总印迹时间取决于网格类型、箔类型、样品浓度和样品类型（例如，可溶性蛋白质、膜蛋白和丝状蛋白）。对于粘度更高的样品，需要更长的印迹时间（例如，5至7秒）。
   1. 重要提示:制定可靠且一致的计数方案，以大大提高冷冻过程中的再现性。
8. 向相反方向移动左指、右指和食指，以"捕捉动作"将吸墨纸从网格表面移开。立即踩下脚踏板以释放跳动臂，并将网格插入液体乙烷中。
   1. 同时取出吸墨纸并踩下脚踏板，尽快将网格插入乙烷中，以获得最佳冷冻效果。吸墨纸去除和熔断之间的时间越长，薄膜的蒸发就越多，并降低网格到网格的再现性。
9. 用一只手固定夹紧镊子，小心地从镊子和手动插臂周围松开胶带。
   1. 始终与镊子保持接触，以防止镊子网格移动，并限制因将网格撞向固体乙烷而造成的网格损坏。
10. 一旦夹紧镊子从手动插孔臂中解放出来，将镊子保持在一只手上，放在沉入杜瓦瓶的顶部，确保网格保持在液体乙烷中。小心地将塑料夹从网格上滑开，以便可以转移网格。保持镊子的压力以保持网格。
    1. 只需快速移动，即可将电网从乙烷容器快速转移到_LN2 储液罐中。小心地将网格放在网格存储盒中。
       注:某些乙烷可能会在网格表面上凝固。稍微打开镊子会破坏乙烷，并允许网格落入网格盒中。
11. 用精致的工作湿巾包裹镊子的尖端，以防止霜冻积聚。放在一边，直到镊子恢复到室温。
    1. 手头上有4到6个镊子，以便于使用。每个镊子将用于样品冷冻并在后续使用前加热。
12. 对每个网格重复步骤 6.1-6.11。
13. 一旦冻结达到高潮，请牢固地关闭网格盒并转移到适当的存储位置。
14. 小心处理液体乙烷和_LN2 ，并将所有材料存放在干燥的地方。

结果

成功执行此处描述的印迹和暴跌方案将导致一层薄而均匀的玻璃体冰，该玻璃体冰层没有任何六角形冰，污染物和可以在电子显微镜下观察到的大梯度不可用的冰（图3）。转印纸与网格表面的接触不一致、过早取下印迹纸或在网格接触期间移动印迹纸都会降低玻璃体冰的质量，并导致整个EM网格上的冰厚度不一致（图4）

讨论

通过单颗粒低温电子显微镜（cryoEM）对用于成像的生物标本进行玻璃化仍然是成功进行结构测定的关键步骤。该协议中描述的手动印迹和切入方法代表了一种经济高效，可靠且可靠的方法，用于在玻璃体冰薄膜中快速冷冻生物样品以进行冷冻EM成像。使用手稿中概述的方法，研究人员将能够组装和操作手动柱塞，制备适用于闪冻生物样品的冷冻剂，并手动印迹和插入含有生物标本的EM网格。虽然这...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 slot grid storage box	Ted Pella	160-40
14 gauge flat metal dispensing tip	Amazon	B07M7YWWLT
22x22 mm square glass coverslip	Sigma	C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids	Fisher	08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper	Fisher	08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper	Fisher	08-747F
250 mL beaker	Fisher	02-555-25B
Blue styrofoam dewar	Spear Lab	FD-500
Brass ethane vessel	Lasco	17-4075
Clamping tweezers	Ted Pella	38825
Delicate task wipes	Fisher	06-666
Dual-stage regulator with control valve	Airgas	Y12N245D580-AG
Dewer grid base	UCSD
Ethane platform	UCSD
Ethane propane tank	Praxair	ET PR50ZU-G	ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank	Praxair	UN1035	ethane (100%)
Flexible arm task light	Amscope	LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)	Electron Microscopy Sciences	Q325AR1.3
Humidifier	Target	719438
Hygrometer	ThermoPro	B01H1R0K68
Lab coat	UCSD
Liquid Nitrogen dewar	Worthington	LD4
Liquid Nitrogen gloves	Fisher	19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal)	UCSD
Mark 5 (plunging platform)	UCSD
Nitrile gloves	VWR	82026-424
P20 pipette	Eppendorf	13-690-029
PCR tubes	Eppendorf	E0030124286
Pipette tips	ibis scientific	63300005
Ring lamp	Amazon	B07HMR4H8G
Safety glasses	UCSD
Scissors	Amazon	Fiskars 01-004761J
Screw driver	Ironside	354711
Tape	Fisher	15-901-10R
Tweezer to transfer grid box	Amazon	LTS-3
Tygon tubing	Fisher	14-171-130
Whatman blotting paper	Fisher	1001-090