Congelamento manuale blot-and-plunge di campioni biologici per microscopia elettronica criogenica a particella singola

Riepilogo

Questo manoscritto delinea il metodo blot-and-plunge per congelare manualmente i campioni biologici per la microscopia elettronica criogenica a singola particella.

Abstract

L'imaging di campioni biologici con elettroni per la determinazione della struttura ad alta risoluzione mediante microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) richiede un sottile strato di ghiaccio vitreo contenente le biomolecole di interesse. Nonostante i numerosi progressi tecnologici degli ultimi anni che hanno spinto il crioEM a singola particella in prima linea nella biologia strutturale, i metodi con cui i campioni vengono vetrificati per l'imaging ad alta risoluzione spesso rimangono il passo limitante della velocità. Sebbene numerosi sforzi recenti abbiano fornito i mezzi per superare gli ostacoli frequentemente incontrati durante la vetrificazione dei campioni, tra cui lo sviluppo di nuovi supporti per campioni e un'innovativa strumentazione di vitrificazione, il tradizionale stantuffo ad azionamento manuale rimane un punto fermo nella comunità crioEM a causa del basso costo di acquisto e della facilità d'uso. Qui, forniamo metodi dettagliati per l'utilizzo di un dispositivo blot-and-plunge standard a ghigliottina azionato manualmente per la vitrificazione di campioni biologici per l'imaging ad alta risoluzione mediante crioEM a singola particella. Inoltre, vengono descritti anche i problemi comunemente riscontrati e le raccomandazioni per la risoluzione dei problemi per quando una preparazione standard non riesce a produrre un campione adatto.

Introduzione

La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) è una potente tecnica strutturale che può essere utilizzata per risolvere strutture di campioni biologici dinamici a risoluzione quasi atomica1,2,3,4. In effetti, i recenti progressi nelle tecnologie dei rivelatori di elettroni diretti4,5,6,7,8,9,10, i miglioramenti nelle sorgenti di ^{elettroni4,11,12,13,14} e la stabilità delle lenti ^{elettromagnetiche15}, insieme al continuo sviluppo dell'acquisizione dei dati ^16,17 e pacchetti software di ^analisi18,19, hanno permesso ai ricercatori di determinare ora di routine strutture di campioni ben educati con risoluzione 3 Å o superiore4,11,13,14,20,21,22,23 . Nonostante queste migliorate capacità di imaging ed elaborazione dei dati, la preparazione della griglia crioEM rimane il principale ostacolo per una determinazione efficace della struttura ad alta risoluzione e spesso funge da collo di bottiglia considerevole nel flusso di lavoro ^{EM24,25,26,27}.

CryoEM si basa sull'imaging di campioni biologici in soluzioni acquose che vengono congelate per formare un sottile film di ghiaccio "simile al vetro" - un processo noto come vetrificazione - che preserva lo stato biochimico nativo. La vitrificazione di campioni biologici per crioEM risale a oltre 40 anni28,29,30 e molte tecniche e attrezzature che sono state sviluppate per questo processo si basano sul metodo blot-and-plunge originariamente dettagliato31,32,33,34,35 , per cui un piccolo volume di campione (ad esempio, 1-5 μL) viene applicato a una griglia EM specializzata prima che la soluzione in eccesso venga rimossa utilizzando l'interazione fisica della griglia con la carta assorbente. La tempistica di questo processo è solitamente determinata empiricamente per ciascun campione poiché un componente critico dei campioni di congelamento è lo spessore del film di ghiaccio vitreo - se il ghiaccio è troppo spesso, la qualità dell'immagine si deteriora drammaticamente a causa dell'aumento della dispersione del fascio di elettroni mentre il ghiaccio troppo sottile può limitare gli orientamenti proteici e / o escludere particelle dal centro dei fori della lamina della ^griglia36 . Questa dipendenza dallo spessore di ghiaccio perfetto per il crioEM a singola particella ha portato a una vasta gamma di tecniche e apparecchiature in grado di congelare i campioni, tra cui ^{robotica37,38}, microfluidica42 e dispositivi ad ultrasuoni o a spruzzo27,39,40,41,42,43,44 . Negli ultimi anni, alcuni dei più diffusi dispositivi di preparazione dei campioni si affidano all'uso della robotica per il congelamento automatizzato dei campioni utilizzando la tecnica blot-and-plunge45. Mentre questi dispositivi sono progettati per creare in modo riproducibile uno spessore di ghiaccio adeguato per l'imaging, spesso rimangono troppo costosi per i singoli laboratori da acquistare e gestire e si trovano generalmente all'interno di strutture crioEM a tariffe orarie per l'uso. Negli ultimi anni, l'originale tecnica manuale blot-and-plunge è tornata in uso3,47,48,49,50,51,52. In effetti, un dispositivo blot-and-plunge azionato manualmente può ottenere griglie crioEM di alta qualità a una frazione del costo delle controparti robotiche. Inoltre, il blotting manuale offre anche un maggiore controllo degli utenti sul blotting in quanto i ricercatori possono regolare il tipo di blotting (ad esempio, back-blotting della griglia, front-blotting della griglia, ecc.) e il tempo di blotting in base a ogni singolo campione e domande di ricerca.

In questo articolo, forniamo dettagli su come congelare efficacemente i campioni biologici utilizzando un tradizionale dispositivo di vetrificazione manuale blot-and-plunge abbinato a una piattaforma dewar progettata su ^misura53. Vengono fornite le migliori pratiche, tra cui la preparazione del criogeno, la gestione della griglia, l'applicazione del campione e il blotting, nonché le insidie comuni e le raccomandazioni su come superare questi ostacoli. Vengono discussi consigli su come aumentare la riproducibilità dello spessore del ghiaccio tra i preparati a griglia e su come modificare il blotting del campione in base al tipo di campione biologico. Dato il basso costo associato all'acquisto e al funzionamento dello stantuffo manuale descritto in questo manoscritto, i laboratori di tutto il mondo possono preparare campioni biologici per il crioEM in modo economico e riproducibile.

Protocollo

1. Preparare l'ambiente di immersione manuale

NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 5-30 minuti

1. Posizionare lo stantuffo manuale in una cella frigorifera a 4 °C dove un umidificatore può essere co-posizionato per mantenere la stanza vicino al 100% di umidità relativa (RH) (Figura 1A).
   ATTENZIONE: Si prega di consultare le linee guida dell'istituzione in materia di salute e sicurezza ambientale per la posizione sicura dello stantuffo manuale e le operazioni raccomandate.
2. Prima della preparazione della griglia, accendere l'umidificatore nella cella frigorifera per assicurarsi che l'umidità relativa alla cella frigorifera sia ≥ 95%.
   NOTA: la preparazione della griglia a bassa umidità può comportare disidratazione di film sottili, alterazione dei componenti tampone a causa dell'evaporazione e una diminuzione della riproducibilità da griglia a ^griglia46. Non è consigliabile congelare le griglie a <80 % di umidità relativa.
3. Assicurarsi che la temperatura della cella frigorifera sia a 4 °C.
4. Posizionare lo stantuffo manuale lontano da forti correnti d'aria (ad esempio, lontano dalle prese d'aria dell'unità di condizionamento dell'aria) in quanto possono portare a turbolenze vicino alle griglie e / o accumulo di ghiaccio prominente su superfici fredde.

2. Preparare materiali e accessori per immersione

NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 1-5 minuti

1. Utilizzare forbici pulite per tagliare i cerchi di carta assorbente in strisce larghe 1-1,5 cm e lunghe ~ 9 cm. Evitare di toccare il centro della carta assorbente e scartare i pezzi finali più piccoli. È importante assicurarsi che le strisce di carta assorbente siano asciutte, pulite e prive di contaminanti. Separare le strisce e metterle in una capsula di Petri da 100 mm.
2. Posizionare una copertura di vetro quadrata 22x22 mm in una capsula di Petri di vetro separata da 60 mm. Questa capsula di Petri in vetro contenente coverslip verrà utilizzata per conservare, trasferire e raffreddare le griglie.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare una bomboletta di spolverino d'aria per rimuovere eventuali detriti visibili dalla slitta prima di aggiungere griglie. Una pistola antistatica può anche essere utilizzata per rimuovere qualsiasi elettricità statica che si accumula.
3. Assemblare ed etichettare scatole di stoccaggio della griglia.
4. Acquisire da 4 a 6 pinzette di serraggio pulite e asciutte e posizionarle nello stantuffo manuale. Ispezionare visivamente ogni pinzetta prima di immergersi per assicurarsi che non siano danneggiati e privi di contaminanti.

3. Preparare il dewar criogeno e lo stantuffo manuale

NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 5-15 minuti

1. Installa la base della piattaforma nella parte inferiore del dewar a immersione. Posiziona il dewar della nave dell'etano sopra la base della piattaforma, aggiungi il vaso di etano di ottone e quindi installa la piattaforma di stoccaggio della griglia rotante.
   1. Una volta aggiunto azoto liquido (_LN2) al dewar di immersione, l'altezza della base della piattaforma non può più essere regolata. Assicurarsi che la base della griglia sia installata correttamente e sia in piano per limitare i danni alla griglia e/o alla pinzetta dovuti a un'altezza impropria dello stantuffo.
2. Prima del congelamento, controllare lo stantuffo manuale e tutte le apparecchiature ausiliarie per assicurarsi che funzionino correttamente per limitare la perdita di campioni e/o di griglia.
3. Prima di ogni sessione di congelamento, sostituire il nastro sul braccio a stantuffo manuale utilizzato per tenere le pinzette. L'elevata umidità della stanza può deteriorare l'adesivo del nastro e diminuire la capacità del nastro di trattenere le pinzette, aumentando la probabilità di danni alla pinzetta e / o perdita della griglia.
4. Regolare le lampade vicino allo stantuffo manuale per assicurarsi che vi sia luce sufficiente per monitorare l'assorbimento del campione e garantire che il trasferimento della griglia sia facilmente visualizzabile per evitare danni e/o perdite alla griglia (vedere il punto 3.7). Usa una lampada ad anello direttamente dietro lo stantuffo per visualizzare il movimento del liquido e una luce flessibile vicino al dewar per illuminare le griglie congelate.
5. Regolare la tensione del pedale per garantire che il braccio di immersione dewar sia mantenuto saldamente in posizione mentre si trova in posizione rialzata e venga completamente rilasciato quando il pedale è premuto. Eseguire diverse corse "a secco" prima dell'applicazione del campione per garantire che lo stantuffo funzioni correttamente.
   NOTA: la regolazione impropria della tensione del pedale comporterà il rilascio prematuro del braccio di immersione (cioè la tensione è impostata troppo bassa) e la perdita della griglia o l'immersione incompleta della griglia nel vaso di etano (cioè, la tensione è impostata troppo alta).
6. Posizionare il dewar a immersione alla base dello stantuffo manuale direttamente sotto il braccio di immersione e fissarlo in posizione. Attaccare un paio di pinzette al braccio di immersione usando il nastro adesivo. Mentre si tiene premuto il braccio di immersione manuale, premere il pedale per abbassare attentamente il braccio di immersione e regolare la corsa del braccio di immersione per assicurarsi che la griglia si trovi al centro del vaso di etano.
7. Utilizzare il bump stop nella parte superiore del braccio di immersione per determinare la posizione finale del braccio di immersione quando il pedale è completamente premuto (Figura 1B). Regolare l'altezza di arresto dell'urto sul braccio di immersione per regolare la posizione della griglia nel vaso di etano (Figura 1C).
   NOTA: l'impostazione errata dell'altezza del braccio di immersione può causare danni alla griglia e/o alla pinzetta (ad esempio, l'altezza del braccio di immersione è impostata su un livello troppo basso) o a una vetrificazione inadeguata (ad esempio, l'altezza del braccio di immersione è impostata su un'altezza troppo alta).
8. Individuare il dewar fuori dalla cella frigorifera e procedere alla preparazione dell'etano liquido (passaggio 4).

4. Preparare il criogeno

NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 10-30 minuti

1. Valutare il serbatoio di etano, il regolatore, il tubo e la punta di erogazione dell'etano per eventuali segni di danno. Segnalare e rettificare immediatamente eventuali segni di danno prima di procedere.
   ATTENZIONE: Etano compresso ed etano: le miscele di gas propano sono infiammabili e possono rappresentare una seria minaccia per la vita e / o causare lesioni se maneggiate in modo improprio. Si prega di consultare un esperto se non si sa come utilizzare o gestire i serbatoi di gas compresso. Si prega di fare riferimento alle linee guida per la salute e la sicurezza ambientale dell'istituzione quando si maneggiano gas compressi infiammabili. Inoltre, l'etano liquefatto è un potente criogeno che può rappresentare una seria minaccia per la vita e / o lesioni se non gestito correttamente. Si prega di fare riferimento alle linee guida per la salute e la sicurezza ambientale dell'istituzione quando si maneggiano i criogeni.
2. Acquisire una quantità sufficiente di _LN2 in un dewar di movimentazione _LN2 appropriato (ad esempio, 3-4 L è tipico per la preparazione e lo stoccaggio della griglia).
   ATTENZIONE: _LN2 è un criogeno che può rappresentare una seria minaccia per la vita e/o lesioni se non gestito correttamente.
   1. Assicurarsi che tutti i dispositivi di protezione individuale siano utilizzati per ridurre al minimo il rischio di lesioni. Il vapore di _LN2 è un asfissiante e deve essere maneggiato in aree ben ventilate. Si prega di consultare un esperto se non si è sicuri di come utilizzare o gestire vasi criogenici e criogeni. Si prega di fare riferimento alle linee guida per la salute e la sicurezza ambientale dell'istituzione quando si maneggiano i criogeni. Per le situazioni in cui l'azoto liquido non può essere utilizzato in una cella frigorifera, si consiglia di immergere il congelamento in uno spazio fresco e ben ventilato.
3. All'esterno della cella frigorifera, raffreddare il dewar a immersione versando _LN2 direttamente nel recipiente di etano di ottone fino a quando il livello di azoto liquido raggiunge la parte superiore del vaso di etano (cioè appena sopra la piattaforma). Completare l'LN2 all'esterno della nave di etano secondo necessità. Procedere al passaggio successivo quando _LN2 smette di gorgogliare violentemente (circa 5 minuti).
   1. Aggiungere _LN2 direttamente al recipiente di etano in ottone per raffreddare sufficientemente il recipiente prima di condensare il gas etano. Il mancato raffreddamento corretto del recipiente di etano in ottone aumenterà notevolmente il tempo necessario per condensare l'etano.
   2. Una volta che il dewar ha raggiunto la temperatura _LN2 , evitare di riempire eccessivamente il dewar in modo tale che _LN2 si riversi nel vaso di etano.
4. L'etano si presenta come un gas compresso e deve essere liquefatto per l'uso. Il serbatoio di etano utilizza un regolatore a doppio stadio ad alta purezza per controllare il flusso di gas. Collegare il tubo alla valvola di uscita del regolatore e utilizzare una punta di erogazione metallica piatta calibro 14 collegata all'estremità per l'erogazione dell'etano.
5. Prima di aprire la valvola principale del serbatoio dell'etano, assicurarsi che la manopola di regolazione della pressione e la valvola di uscita siano chiuse completamente. Aprire completamente la valvola del serbatoio principale e quindi aprire la valvola di uscita a ~ 50%. Aprire lentamente la manopola di regolazione della pressione fino a quando non si osserva un flusso di gas lento. Utilizzare la valvola di uscita per ottimizzare il flusso del gas.
   ATTENZIONE: Puntare sempre la punta di erogazione del metallo lontano da se stessi quando si aprono le valvole o si effettuano regolazioni del flusso di gas.
6. Avviare lentamente il flusso di gas e valutare la portata inserendo la punta della linea del gas di etano in un piccolo becher di acqua deionizzata. Regolare il flusso di gas fino a quando la portata disturba moderatamente l'acqua.
   1. Regolare la portata del gas per garantire che si verifichi una corretta condensazione dell'etano: una portata troppo lenta causerà la solidificazione del gas etano nella punta di erogazione e una portata troppo veloce comporterà un'intensa gorgogliatura e impedirà il congelamento.
7. Prima di inserire la punta della linea del gas di etano nel recipiente di etano in ottone, pulire e pulire la punta di erogazione con delicate salviette per rimuovere l'acqua.
8. Con un movimento fluido e rapido, posizionare la punta di erogazione del gas sul fondo del recipiente di etano in ottone e iniziare a spostare la punta di erogazione in un cerchio lento attorno al fondo del recipiente di etano. L'etano solido si formerà immediatamente, ma si liquefarà rapidamente man mano che viene aggiunto / condensato più gas di etano.
   1. Continua a spostare la punta di erogazione dell'etano metallico sul fondo del vaso di etano per liquefare l'etano solido. Riempire il vaso di etano a 3/4 pieno di etano liquido (2-3 fili dall'alto). Arrestare il flusso di gas etano rimuovendo con cura la punta di erogazione dell'etano metallico dal recipiente di etano in ottone e chiudendo la valvola di uscita.
9. Completare il dewar a immersione con _LN2 che si versa delicatamente sul lato del dewar per evitare l'aggiunta di _LN2 al vaso di etano di ottone, fino a quando il livello del liquido tocca solo il vaso di etano di ottone. Posizionare il coperchio in schiuma sul dewar a immersione per facilitare la solidificazione dell'etano.
   1. _LN2 deve contattare direttamente il recipiente di etano in ottone per aiutare nella solidificazione dell'etano. Dopo circa 5 minuti, l'etano all'interno del recipiente di ottone diventerà completamente solido congelato. Aggiungi più _LN2 fino a quando non tocca semplicemente il vaso di etano e procedi al passaggio successivo.
10. Se l'etano non ha congelato il solido, il vaso di etano di ottone non è abbastanza freddo per i passaggi rimanenti. Aggiungi più _LN2 fino a quando non tocca il vaso di etano e attendi altri 5 minuti. Assicurarsi che l'etano all'interno del recipiente di ottone sia completamente congelato solido.
11. Aprire la valvola di uscita del gas per produrre un flusso di gas etano ad una velocità simile a quella determinata nel passaggio 4.6. Posizionare verticalmente la punta di erogazione dell'etano metallico nell'etano solido e continuare a spostare la punta di erogazione dell'etano in un movimento circolare per fondere l'etano solido.
    1. Continua ad aggiungere etano fino a quando non è a livello con la parte superiore del vaso di etano di ottone. Rimuovere lentamente la punta dal vaso di etano e chiudere la valvola di uscita del serbatoio di etano. Coprire il dewar con il coperchio per ~ 1-4 minuti per lasciare che l'etano si solidifichi attorno ai bordi del vaso di etano di ottone.
       NOTA: Un vaso di etano ideale avrà un anello simmetrico di etano solido di 2-3 mm al perimetro del vaso di etano di ottone con etano liquido al centro (Figura 1D e Figura 2).
    2. Assicurarsi che l'etano sia il più freddo possibile senza solidificare per garantire una corretta vetrificazione del campione biologico. La mancata preparazione corretta dell'etano liquido può comportare una vetrificazione inadeguata del campione, l'accumulo di ghiaccio e / o la perdita del campione, ognuno dei quali contribuisce al deterioramento della qualità del campione per l'imaging.
    3. Se un anello solido di etano non si forma dopo 2-3 minuti, aggiungere più _LN2 al dewar e coprire per altri 2-5 minuti.
    4. Se l'etano si solidifica troppo rapidamente, utilizzare un grande paio di pinzette pulite per riscaldare delicatamente il vaso di etano e / o l'etano solido per evitare la completa solidificazione dell'etano. Una volta che l'etano e l'LN2 sono stabili, chiudere tutte le valvole del serbatoio di etano e posizionare il dewar di immersione nello stantuffo manuale. Fissare il dewar a immersione allo stantuffo manuale.
       ATTENZIONE: Prestare particolare attenzione quando si trasferisce il dewar poiché _LN2 può fuoriuscire nel vaso di etano e solidificare l'etano liquido. Se necessario, un set pulito di pinzette può essere utilizzato per sciogliere qualsiasi etano solido nel mezzo della nave.
12. Testare la posizione dell'etano dewar con un paio di pinzette vuote per assicurarsi che la punta della pinzetta si trovi al centro del vaso di etano e che ci sia spazio sufficiente per la griglia e la punta della pinzetta all'interno dell'etano liquido (Figura 1D).
    1. Se l'anello di etano solido è troppo spesso per una facile manipolazione della griglia, utilizzare un paio di pinzette a temperatura ambiente per fondere l'etano solido e creare più area di congelamento al centro del vaso di etano.

5. Preparare le griglie EM

NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 1-5 minuti

1. Aggiungere le scatole di stoccaggio della griglia al dewar, svitare i coperchi della scatola di stoccaggio della griglia e assicurarsi che ogni coperchio possa ruotare liberamente in un nuovo slot della griglia.
2. Trasferire con attenzione le griglie dalla scatola di stoccaggio della griglia al bordo del coperchio di vetro quadrato con ~ 30-40% della griglia fuori dal bordo della diapositiva. Assicurarsi che la pellicola della griglia sia rivolta verso l'alto. Assicurarsi che le griglie siano coperte quando non in uso. Posizionare le griglie sul bordo del coperchio di vetro quadrato offre facilità di gestione della griglia e riduce la possibilità di piegare o danneggiare la griglia durante il trasferimento.
   NOTA: in genere vengono preparate 4-6 griglie alla volta.
3. Renderizza le griglie idrofile usando uno scaricatore a bagliore o un detergente al plasma.
   NOTA: fare riferimento alle linee guida consigliate per la pulizia della griglia fornite dal produttore del diffusore di incandescenti/detergente al plasma.
   1. Utilizzare le griglie entro 10 minuti dalla pulizia del plasma poiché le griglie perdono idrofilia e la riproducibilità da griglia a griglia diminuisce dopo questo tempo.

6. Preparare il campione di crioEM congelando a immersione

NOTA: Tempo di funzionamento stimato: >10 minuti (~ 1-3 minuti per griglia)

1. Utilizzare una pinzetta di serraggio pulita e asciutta per raccogliere una griglia pulita, far scorrere il morsetto di plastica verso il basso per fissare la griglia in posizione e picchiettare delicatamente le pinzette per assicurarsi che la griglia sia adeguatamente fissata.
   1. Maneggiare le griglie vicino all'anello esterno per evitare danni alla lamina della griglia.
2. Applicare da 1 a 5 μL di campione sul lato preparato (ad esempio, lato anteriore o lato lamina) della griglia.
   NOTA: il volume e il tempo di blotting ottimali dipendono dal campione e devono essere ottimizzati per ciascun campione; volumi maggiori e campioni più viscosi richiedono tempi di blotting più lunghi.
3. Fissare l'assemblaggio pinzetta-griglia-campione al braccio di immersione manuale avvolgendo il nastro attorno alla maniglia della pinzetta.
   1. Affronta il campione verso l'utente per il tradizionale front blotting. Se l'esempio richiede il back blotting, individuare il campione lontano dall'utente.
4. Tenere un pezzo di carta assorbente pulito, asciutto e tagliato tra il pollice e l'indice di ogni mano.
   1. Maneggiare solo le carte assorbenti dai bordi e non toccare mai il centro poiché oli e altri contaminanti da mani / guanti possono alterare la qualità della griglia.
5. Appoggia le mani sul bordo del dewar in picchiata per stabilire una posizione stabile. Posizionare la carta assorbente parallelamente alla superficie della griglia a circa 1 cm di distanza dalla superficie della griglia.
   1. Utilizzare la sezione centrale della carta assorbente per consentire una completa mobilità dei fluidi e persino l'assorbimento attraverso la superficie della griglia.
6. Far scorrere delicatamente e ruotare il pollice e l'anulare l'uno verso l'altro per piegare la carta assorbente verso la griglia per avviare il blotting. Mantenere il contatto tra la carta assorbente e la superficie della griglia durante l'intero processo di blotting.
   1. Contattare direttamente la carta assorbente alla superficie della griglia e mantenere un contatto costante attraverso la superficie della griglia.
   2. Piegare delicatamente la carta assorbente riduce la flessione della griglia e/o il danneggiamento della superficie della griglia e si traduce in ghiaccio più consistente su tutta la griglia (Figura 3A).
7. Osserva il fronte liquido mobile e una volta che smette di progredire nella carta assorbente inizia a contare per 4-6 secondi.
   NOTA: il conteggio può verificarsi una volta che la carta assorbente contatta la superficie della griglia, ma può verificarsi una minore riproducibilità da griglia a griglia. Il tempo totale di blot dipenderà dal tipo di griglia, dal tipo di lamina, dalla concentrazione del campione e dal tipo di campione (ad esempio, solubile rispetto alla membrana rispetto alle proteine filamentose). Per i campioni più viscosi saranno necessari tempi di macchia più lunghi (ad esempio, da 5 a 7 secondi).
   1. Importante: sviluppare uno schema di conteggio affidabile e coerente per migliorare notevolmente la riproducibilità durante il processo di congelamento.
8. Spostare il pollice sinistro, il pollice destro e l'indice in direzioni opposte per rimuovere la carta assorbente con un "movimento di scatto" lontano dalla superficie della griglia. Premere immediatamente il pedale per rilasciare il braccio di immersione e immergere la griglia nell'etano liquido.
   1. Rimuovere contemporaneamente la carta assorbente e premere il pedale per immergere la griglia nell'etano il prima possibile per ottenere i migliori risultati di congelamento. Più lungo è il tempo che intercorre tra la rimozione della carta assorbente e l'immersione, maggiore sarà l'evaporazione dei film sottili e diminuirà la riproducibilità da griglia a griglia.
9. Utilizzare una mano per stabilizzare le pinzette di serraggio, srotolare il nastro con attenzione da intorno alle pinzette e braccio di immersione manuale.
   1. Mantenere sempre il contatto con la pinzetta per impedire il movimento della griglia della pinzetta e limitare i danni alla griglia che si verificano battendo la griglia contro l'etano solido.
10. Una volta che le pinzette di serraggio sono libere dal braccio di immersione manuale, mantenere la pinzetta in una mano appoggiata sopra il dewar di immersione, assicurarsi che la griglia rimanga nell'etano liquido. Far scorrere con attenzione il morsetto di plastica lontano dalla griglia in modo che la griglia possa essere trasferita. Mantenere la pressione sulle pinzette per mantenere la griglia.
    1. Con un movimento rapido, trasferisci rapidamente la griglia dalla nave di etano al serbatoio _LN2 . Posizionare con attenzione la griglia nella scatola di stoccaggio della rete.
       NOTA: alcuni etano possono solidificarsi sulla superficie della griglia. L'apertura della pinzetta romperà leggermente l'etano e consentirà alla griglia di essere lasciata cadere nella casella della griglia.
11. Avvolgere la punta delle pinzette in una delicata salvietta per evitare l'accumulo di gelo. Mettere da parte fino a quando le pinzette non sono tornate a temperatura ambiente.
    1. Avere da 4 a 6 pinzette a portata di mano per facilità d'uso. Ogni pinzetta verrà utilizzata per il congelamento del campione e riscaldata prima dell'uso successivo.
12. Ripetere i passaggi da 6.1 a 6.11 per ogni griglia.
13. Una volta che il congelamento è culminato, chiudere saldamente la scatola della griglia e trasferirla in un luogo di archiviazione appropriato.
14. Smaltire con cura l'etano liquido e _LN2 e conservare tutti i materiali in un luogo asciutto.

Risultati

L'esecuzione riuscita del protocollo blot-and-plunge qui descritto si tradurrà in uno strato sottile e uniforme di ghiaccio vitreo privo di ghiaccio esagonale, contaminanti e grandi gradienti di ghiaccio inutilizzabile che possono essere osservati al microscopio elettronico (Figura 3). Il contatto incoerente della carta assorbente con la superficie della griglia, la rimozione prematura della carta assorbente o lo spostamento della carta assorbente durante il contatto con la griglia possono ...

Discussione

La vitrificazione di campioni biologici per l'imaging mediante microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) rimane un passo di fondamentale importanza per il successo della determinazione della struttura. Il metodo manuale blot-and-plunge descritto in questo protocollo rappresenta un metodo economico, affidabile e robusto per congelare rapidamente campioni biologici in film sottili di ghiaccio vitreo per l'imaging crioEM. Utilizzando i metodi descritti nel manoscritto, i ricercatori saranno in grado d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 slot grid storage box	Ted Pella	160-40
14 gauge flat metal dispensing tip	Amazon	B07M7YWWLT
22x22 mm square glass coverslip	Sigma	C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids	Fisher	08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper	Fisher	08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper	Fisher	08-747F
250 mL beaker	Fisher	02-555-25B
Blue styrofoam dewar	Spear Lab	FD-500
Brass ethane vessel	Lasco	17-4075
Clamping tweezers	Ted Pella	38825
Delicate task wipes	Fisher	06-666
Dual-stage regulator with control valve	Airgas	Y12N245D580-AG
Dewer grid base	UCSD
Ethane platform	UCSD
Ethane propane tank	Praxair	ET PR50ZU-G	ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank	Praxair	UN1035	ethane (100%)
Flexible arm task light	Amscope	LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)	Electron Microscopy Sciences	Q325AR1.3
Humidifier	Target	719438
Hygrometer	ThermoPro	B01H1R0K68
Lab coat	UCSD
Liquid Nitrogen dewar	Worthington	LD4
Liquid Nitrogen gloves	Fisher	19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal)	UCSD
Mark 5 (plunging platform)	UCSD
Nitrile gloves	VWR	82026-424
P20 pipette	Eppendorf	13-690-029
PCR tubes	Eppendorf	E0030124286
Pipette tips	ibis scientific	63300005
Ring lamp	Amazon	B07HMR4H8G
Safety glasses	UCSD
Scissors	Amazon	Fiskars 01-004761J
Screw driver	Ironside	354711
Tape	Fisher	15-901-10R
Tweezer to transfer grid box	Amazon	LTS-3
Tygon tubing	Fisher	14-171-130
Whatman blotting paper	Fisher	1001-090