重组卡2 +- 研究色氨酸 - ANS FRET 的色氨酸残留物的化学修饰 - ATPase N 域

摘要

ANS 与 Ca²⁺- ATPase 重组 N 域绑定。荧光光谱在激发时以 295 nm 的波长显示类似 FRET 的图案。NBS 调解的 Trp 化学修饰抑制了 N 域的荧光，这导致 Trp 残留物和 ANS 之间没有能量转移 （FRET）。

摘要

沙科/内质 Ca²⁺-ATPase （SERCA） 是一种 P 型 ATPase，在各种构象中结晶。尽管如此，仍可从孤立的重组域获取详细的功能信息。工程 （Trp552Leu 和 Tyr587Trp） 重组核苷酸绑定域 （N 域） 显示配体绑定后荧光淬火。一种外在的氟磷，即8-阿尼利诺-1-纳布他烯硫酸盐（ANS），通过静电和疏水性与阿格、赫斯、阿拉、卢和菲残留物的相互作用，与核苷酸结合。当兴奋的波长（+）为370纳米时，荧光强度的增加就证明了ANS的结合。然而，当兴奋在 \295 nm 时，荧光强度的增加似乎与 N 域内在荧光的淬火相伴而生。荧光光谱显示一个类似Föster共振能量转移（FRET）的模式，从而暗示了Trp-ANS FRET对的存在，这似乎由Tyr587Trp和ANS之间的短距离（+20+）支撑。本研究描述了由 N-溴素酰胺 （NBS）调解的 Trp-ANS FRET 对的 Trp 化学修饰（和荧光淬火）分析。在化学改性 N 域中，ANS 荧光在 295 nm 的兴奋时增加，类似于在 370 nm 时兴奋时增加。因此，NBS 调解的 Trp 残留物的化学修饰可用于探索 Trp 和 ANS 之间缺乏 FRET。在没有TRP荧光的情况下，不应观察ANS荧光的增加。NBS 对蛋白质中的 Trp 残留物进行化学修饰可能有助于检查接近绑定 ANS 的 Trp 残留物之间的 FRET。这种检测在使用其他氟化物时可能也很有用。

引言

Füster共振能量转移（FRET）已成为确定分子结构之间的距离后，结合或相互作用的蛋白质结构和功能研究^{1，2，3，4}的标准技术。在P型ATPases中，FRET被用来研究SARCO内质视网膜Ca 2+-ATPase（SERCA）2、5、6、7、8的结构波动，例如，FRET⁷对整个蛋白质的结构波动进行了分析。

FRET捐赠者是多种多样的，从小荧光（外在）分子到荧光蛋白^9，10。色氨酸（Trp）残留物（由于其荧光）有助于识别蛋白质氨基酸序列^11，12的结构变化。Trp的荧光强度在很大程度上取决于其周围环境^的极^性。利甘结合通常产生蛋白质/酶^15，16的结构重新排列。如果Trp位于或位于蛋白质结合部位附近，结构波动通常会影响Trp暴露在^13、14等水平:因此，极性的变化导致Trp荧光强度^13，14的淬火。因此，Trp 的荧光特性对于对酶进行配体结合研究很有用。其他物理现象也可能导致Trp荧光淬火17，18，19，20，例如，FRET和中等极性的变化。能量从兴奋状态的Trp转移到氟也具有潜在的应用，例如，在蛋白质²¹中小配体的亲和力测定。事实上，Trp在FRET研究中主要用作^22、23、24等蛋白质的荧光捐献者，例如，在terbium（Tb^3+）FRET研究中，Trp残留物经常被用作能量转移到Tb 3+25、26、27的天线。Trp由于其在蛋白质结构中固有的构成特性，与其他FRET捐赠者相比具有各种优势，从而消除了可能影响所研究蛋白质²⁴的功能/结构的预制过程的需要。因此，在蛋白质结构研究^{13、14、19、28}中，对辐射衰变（由蛋白质结构重组引起的能量转移和中等极性变化）的识别对于得出关于配体结合的准确结论非常重要。

在蛋白质结构研究中，一种外在的氟磷，即8-阿尼利诺-1-纳布他烯硫酸盐（ANS），主要用于与蛋白质折叠/展开^{有关的实验。}ANS与原生状态的蛋白质/酶结合，通常在^{基板31、32、33}的结合部位:ANS荧光量子产量（+F）的增加（即荧光强度的增加）是由刺激蛋白质在\370纳米时，ANS与Arg的适当相互作用和他的残留物在疏水口袋发生^{34，35，36，37。}在各种研究中， 已报告TRP残留物（捐赠者）和ANS（接受者）之间的FRAT（当在280-295纳米内激动人心时）的发生，其依据如下:1） Trp 的荧光发射光谱和 ANS 的激发光谱重叠，2） 确定一个或多个 Trp 残留物与 ANS 之间的适当距离用于能量转移， 3） 高ANS量子产量时，结合在蛋白质口袋，和4）特征FRET模式在蛋白质的荧光光谱中存在ANS 3，17，27，37，38。

最近，使用工程重组N域^{40、41、42、43、44、45、46}等对SERCA和其他P型ATPass的核苷酸结合域（N域）进行了配体结合。SERCA N域的分子工程已用于将唯一的Trp残留物（Trp552Leu）移动到一个更动态的结构（Tyr587Trp），该结构靠近核苷酸结合部位，其中荧光变异（淬火）可用于监测配体结合³⁴时的结构变化。实验结果表明，ANS与纯重组剂SERCA N-domain³⁴中的核苷酸结合部位（作为ATP）结合。有趣的是，ANS 荧光在激发时以 295 nm 的激发度与 N 域结合时增加，而 N 域的内在荧光减少^34，从而产生一个 FRET 模式，表明 Trp-ANS FRET 对的形成。

已建议使用 NBS 通过对改性蛋白质的吸收分析来确定^{蛋白质 47}中的 Trp 残留物含量。NBS将Trp高度吸收的内陆组修改为吸收性较小的奥辛多莱^47，48。这导致Trp荧光财产损失（淬火^）40。因此，NBS 调解的Trp残留物的化学修饰可以用作在FRET假设时定义Trp（作为供体）的作用的测定。

本协议将国家统计局在 SERCA 工程重组 N 域中唯一 Trp 残留物的化学修改描述为蛋白质模型。实验结果表明，在化学NBS改性N-domain³⁴中，ANS荧光强度仍在增加，缺乏内在荧光。因此，当与 N 域^34、40、49绑定时^，该检测有助于证明 Trp 残留物和 ANS 之间没有 FRET。因此，这种检测（Trp的NBS化学修饰）有助于证明Trp-ANS FRET对在蛋白质中的存在。

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研究方案

1. 确定（在西里科）的ANS和SERCAN域互动

1. 使用首选的蛋白质建模软件⁵⁰进行分子建模，生成蛋白质（SERCA N-Domain）的三维（3D）结构。
2. 使用首选分子结构软件⁵¹识别形成核苷酸结合位点的氨基酸残留物，确定Arg和Lys残留物^的存在:这些是ANS结合和增加荧光强度（量子产量）所必需的。
3. 执行分子对接（使用首选对接软件）52，53，54，以确定ATP，荧光素异氰酸酯（FITC）（与Lys515标记核苷酸结合站点）和ANS与氨基酸残留物在核苷酸结合场（图1）的相互作用。
4. 使用首选软件中的测量工具计算 Trp 残留物和绑定 ANS 之间的分子距离 （+） 。
5. 对ANS-N域复合物进行分子动力学模拟，以确定相互作用的稳定性52，54。然后，在确认复合物的稳定性时进行体外实验。

2. 重组N域的表达和纯化

1. 合成N域⁴⁰的基因编码。
2. 设计和构建含有N域⁴⁰编码的合成基因的质粒。
3. 通过亲和色谱 （Ni-NTA） 快速和净化，这是工程重组的 N 域。执行纯化蛋白的SDS-PAGE，以确定纯度（图2）40。
4. 通过研究 N 域灭绝系数 （ε= 11，960 M^-1+cm^-1）40的 280 nm 的吸收量确定蛋白质浓度。

3. 根据 ANS 和 N 域荧光强度变化监测 ANS-N 域复合体的形成。

1. 在N，N二甲基甲酰胺中准备 ANS 库存解决方案。
   1. 称量小（1-5毫克）的ANS，并溶解在N，N-二甲基甲酰胺的最后体积的1mL，例如，3.2毫克（10.69 mM最终浓度）。
   2. 使用N、二甲基甲酰胺 N 的 ANS 溶液准备 100 μM ANS As 库存解决方案，例如，将 10.69 mM ANS 溶液的 9.4 μL 添加到 990.6 μL 的 50 mM 磷酸盐缓冲器，pH 8.0 获得 1 mL 的最终体积。
   3. 通过漩涡 3 - 5 次 15s 混合解决方案。
      注:在以下实验中，仅使用 ANS Aqueous 股票解决方案。在开始实验之前，应重新准备 ANS 水性库存解决方案。
2. 准备 N， N二甲基甲酰胺的NBS股票解决方案。
   1. 称量小（1-5毫克）的NBS，并溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺，例如，5.3毫克在1 mL（29.78 mM最终浓度）。
   2. 使用 N（N-二甲基甲酰胺）中的 NBS 溶液准备 1 mMNBS排量库存解决方案，例如，将 29.78 mM NBS 溶液的 3.36 μL 添加到 96.64 μL 的 50 mm 磷酸盐缓冲器，pH 8.0 获得最终体积 0.1 mL。
   3. 通过漩涡 3 - 5 次 15s 混合解决方案。
      注:在开始实验之前，请重新准备 NBS 水性股票解决方案。
3. 用 ANS 对 N 域进行定点，并在 25 °C 下以 +295 nm 的激发度记录荧光光谱。
   1. 获取荧光谱基线。
      1. 将 1 mL 的 50 mM 磷酸盐缓冲器与 pH 8.0 放在 1 mL 荧光石英中。
      2. 将电池放置在光谱仪的热介质细胞室 （25 °C）中，并将激发 =设置为 295 nm。
      3. 记录荧光谱 （305 - 550 nm）。
         注:pH 8.0的50mM磷酸盐缓冲器的荧光谱作为空白样品，从所有获得的荧光光谱中减去。
   2. 获取 N 域的内在荧光谱。
      1. 将 900 μL 的 50 mM 磷酸盐缓冲器与 pH 8.0 放在荧光石英库维特中。
      2. 添加 100 μL 的 N 域 （10 μM） 悬架，以在 1 mL 最终卷中获得 1 μM N 域最终浓度。
      3. 使用微管轻轻地同质化 20 次，以确保溶液的均匀性。
         注:蛋白质应新鲜纯化，以获得高品质的内在荧光光谱，例如，纯化重组N-Domain在纯化后只能使用一周。
      4. 将电池放置在光谱仪的热介质细胞室 （25 °C）中，并将激发 =设置为 295 nm。
      5. 记录 N 域内在荧光谱 （305-550 nm）。
   3. 添加 ANS，以 +295 nm 的激发获得荧光谱。
      1. 在悬浮的 N 域 （1 μM） 中添加 2 μL 100 μM ANS Aques 股票解决方案，以获得 0.2 μM ANS 最终浓度。
      2. 使用微管轻轻地同质化 20 次，以确保溶液的均匀性。
      3. 将电池放置在光谱流光计的热稳定细胞室 （25 °C）中，并将激发 =设置为 295 nm。
      4. 记录荧光谱（305-550 nm）。
      5. 重复 ANS 添加和荧光光谱记录高于 1:1 摩尔关系 ANS:N 域。
      6. 使用合适的软件从每个频谱中减去空白频谱。
      7. 在单个图形中绘制所有光谱。
      8. 确定光谱是否形成类似 FRET 的模式。ANS-N域荧光光谱形成类似FRET的图案（图3A）。

4. N 域内荧光点子由 Trp 化学修饰与 Nbs 。

1. 重复步骤 3.3.1 和 3.3.2。
2. 在悬浮的 N 域 （1 μM） 中添加 1 μL 1 mM NBS 的排泄性库存解决方案，以获得 1 μM NBS 的最终浓度。
3. 使用微管 20 次，确保溶液的均质，从而轻轻地实现均质。
4. 将电池放置在光谱流光计的热稳定细胞室 （25 °C）中，并将激发 =设置为 295 nm。
5. 记录荧光谱（305-550纳米）（图3B）。
6. 重复 NBS 添加和荧光光谱记录，直到观察到最小的 N 域内荧光淬火^40。在 N 域中，这通常发生在 5-6 NBS/N 域⁴⁰的摩尔比。
   注:国家统计局快速淬火（<5s）N域的内在荧光:荧光强度下降。立即进入下一步，因为国家统计局也可能与其他氨基酸残留物⁴⁷反应。
7. 使用合适的软件从每个频谱中减去空白频谱。
8. 在单个图形（图 3B）中绘制所有光谱。

5. 通过在 25 °C 下记录荧光光谱，用 ANS 对 NBS 修改的 N 域进行点缀。

1. 使用第 4 步生成的 NBS 修改的 N 域执行步骤 3.3.3。
2. 使用合适的软件从每个频谱中减去空白频谱。
3. 在单个图形（图 3C）中绘制所有光谱。
4. 生成的荧光光谱 （图 3C）支持或反驳 FRET 的发生，即当 FRET 发生时，ANS 荧光不会增加，反之亦然。

6. ANS 以 +370 nm 的激发与化学改性 N 域结合的证据。

1. 使用 NBS 修改后的 N 域执行步骤 3.3.3，该域在第 4 步生成，但将激励 = 更改为 370 nm。
2. 使用合适的软件从每个频谱中减去空白频谱。
3. 在单个图形（图 3D）中绘制所有光谱。
4. 通过观察 ANS 荧光强度的增加，确认 ANS 与 N 域结合。与 N 域结合的 ANS 显示在 +370 nm （图 3D）时兴奋时荧光增加。作为对照，ANS（单独）在50mM磷酸盐缓冲器中（pH 8.0）的荧光光谱在295和370纳米（图4，不显示在视频中）获得令人兴奋。
   注:NBS:化学改性所需的口腔测量关系取决于所研究^{的蛋白质46、47、55、56}中Trp残留物的埋藏程度。因此，建议事先确定国家统计局:蛋白质/（Trp）摩尔比。

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结果

分子对接显示ANS通过静电和疏水相互作用与N域核苷酸结合部位的结合（图1）。Trp 残留物和 ANS（与核苷酸结合部位）之间的分子距离 （20+） 支持 FRET 的发生（图1）。设计（工程）重组N域通过亲和色谱仪（图2）获得高纯度，适合荧光实验。ANS-N 域复合物的荧光光谱在激发时显示类似 FRET 的图案，频率为 ±295 nm（?...

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讨论

ANS-N 域复合物的荧光光谱在 295 nm 的兴奋时显示类似 FRET 的模式，而 Trp 残留物和 ANS 之间的分子距离 （20 +） 似乎支持 FRET 的发生（图1）。NBS 的 Trp 化学修饰导致荧光 N 域变小（图 3B，频谱 f）:因此，能量转移是不可能的。ANS 荧光光谱与未修改的 N 域相似，当兴奋在 295 nm （图 3A 和 C）时。

因?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Bio-Rad	1610107	SDS-PAGE
Ammonium persulfate	Bio-Rad	1610700	SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid	Sigma-Aldrich	A1028	Fluorophore
Bis-acrylamide	Bio-Rad	1610125	SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide	Sigma-Aldrich	B81255	Chemical modification
N,N-dimethylformamide	J.T. Baker	9213-12	Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate	Sigma-Aldrich	F7250	Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette	Hellma	Z801291	Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer	Shimadzu	RF 5301PC	Fluorescence assay
HisTrap™ FF	GE Healtcare	11-0004-59	Protein purification
IPTG, Dioxane free	American Bionalytical	AB00841-00010	Protein expression
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513-25G	Protein purification
LB media	Fisher Scientific	10000713	Cell culture
Pipetman L P10L	Gilson	FA10002M	Fluorescence assay
Pipetman L P100L	Gilson	FA10004M	Fluorescence assay
Pipetman L P200L	Gilson	FA10005M	Fluorescence assay
Pipetman L P1000L	Gilson	FA10006M	Fluorescence assay
Pipetman L P5000L	Gilson	FA10007	Fluorescence assay
Precision plus std	Bio-Rad	1610374	SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate	Bio-Rad	1610302	SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic	J.T. Baker	3828-19	Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic	J.T. Baker	3818-01	Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um	Millipore	GVWP04700	Solution filtration
Temed	Bio-Rad	1610801	SDS-PAGE
Tris	Bio-Rad	1610719	SDS-PAGE