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요약

ANS는 Ca2+-ATPase 재조합 N-도메인에 바인딩합니다. 형광 스펙트럼은 295 nm의 파장에서 여기시 면에 FRET 와 같은 패턴을 표시합니다. Trp의 NBS 중재 화학 적 변형은 Trp 잔류물과 ANS 사이의 에너지 전송 (FRET)의 부재로 이어지는 N 도메인의 형광을 담금질합니다.

초록

사르코/폐막성 레티쿨룸 Ca2+-ATPase (SERCA)는 다양한 적합성으로 결정화 된 P 형 ATPase입니다. 그럼에도 불구하고 자세한 기능 정보는 격리된 재조합 도메인으로부터 얻을 수 있습니다. 엔지니어링(Trp552Leu 및 Tyr587Trp) 재조합 뉴클레오티드 결합 도메인(N-domain)은 리간 드렌드 결합 시 형광 응고를 표시합니다. 외외형 불소, 즉 8-anilino-1-naphthalene 설포네이트(ANS)는 아르그, 그의, 알라, 루 및 페 잔류물과의 정전기 및 소수성 상호 작용을 통해 뉴클레오티드 결합 부위에 결합합니다. ANS 결합은 370 nm의 파장(λ)에서 흥분될 때 형광 강도의 증가에 의해 입증된다. 그러나, 295 nm의 λ에서 흥분할 때, 형광 강도의 증가는 N-도메인 본질적인 형광의 담금질에 결합되는 것처럼 보입니다. 형광 스펙트럼은 Föster 공명 에너지 전송 (FRET)과 같은 패턴을 표시하여 Trp-ANS FRET 쌍의 존재를 제안하며, 이는 Tyr587Trp와 ANS 사이의 짧은 거리 (~20 Å)에 의해 지원되는 것으로 보입니다. 이 연구는 N-bromosuccinimide (NBS)에 의해 매개되는 Trp 화학 적 변형 (및 형광 담금질)에 의해 Trp-ANS FRET 쌍의 분석을 설명합니다. 화학적으로 변형된 N-도메인에서 ANS 형광은 370 nm의 λ에서 흥분할 때와 유사한 295 nm의 λ에서 흥분할 때 증가했습니다. 따라서 Trp 잔류물의 NBS 매개 화학 적 변형은 Trp와 ANS 사이의 FRET부재를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. Trp 형광이 없는 경우 ANS 형광의 증가를 관찰해서는 안됩니다. NBS에 의한 단백질에서 Trp 잔류물의 화학적 변형은 결합된 ANS에 가까운 Trp 잔류물 사이 FRET를 검사하는 데 유용할 수 있다. 이 분석은 다른 형광을 사용할 때 유용할 것입니다.

서문

Föster 공명 에너지 전달(FRET)은 단백질 구조 및 기능 연구에서 결합 또는 상호 작용 후 분자 구조 간의 거리를 결정하는 표준 기술이 되었다1,2,3,4. P형 ATPases에서 FRET는 사르코-내도 망상 Ca2+-ATPase(SERCA)2,5,6,7,8,예를 들어, 촉매 주기 동안의 구조적 변동을 FRET7에의해 전체 단백질로 분석하여 분석하는 데 사용되어 왔다.

FRET 기증자는 다양하며, 작은 형광 (외발) 분자에서 형광 단백질9,10에이르기까지 다양합니다. 트립토판(Trp) 잔류물(그들의 형광로 인한)은 단백질 아미노산서열(11,12)의구조적 변화를 식별하는 데 유용하다. Trp의 형광 강도는 주변 환경의 극성에 실질적으로의존한다(13,14). 리간드 결합은 일반적으로 단백질/효소15,16에서구조적 재배열을 생성한다. Trp가 단백질 결합 부위에 존재하거나 가까이 위치한 경우, 구조적 변동은 수성물질(13,14)에대한 Trp 노출 정도에 자주 영향을 미친다. 따라서, 극성의 변화는 Trp 형광 강도13,14의담금질귀귀착한다. 따라서 Trp의 형광 특성은 효소에 대한 리간드 결합 연구를 수행하는 데 유용합니다. 다른 물리적 현상은 또한 Trp 형광 이17,18,19,20,예를 들어, FRET 및 중간 극성 의 변화로 이어질 수 있다. Trp의 흥분 상태에서 불소호레로의 에너지 전송은 또한단백질(21)의작은 리간드의 친화성 결정과 같은 잠재적인 응용 분야가 있다. 실제로, Trp는 주로 단백질22,23,24,예를 들어, 테르비움(Tb3+)FRET 연구에서 FRET 연구에서 FRET 연구에서 형광 기증자로 주로 사용되어 왔으며, Trp 잔류물은 Tb3+25,26,27로에너지 전송을 위한 안테나로 자주 사용된다. Trp는 단백질 구조에 내재된 구성 특성으로 인해 다른 FRET 기증자에 비해 다양한 이점을 표시하여 연구된단백질(24)의기능/구조에 영향을 줄 수 있는 예비 공정의 필요성을 제거한다. 따라서, 방사성 붕괴의 식별(단백질 구조 재배열에 의해 유도되는 중간 극성의 에너지 전달 및 변화)은 단백질 구조 연구에서 리간드 결합에 관한 정확한 결론을 도출하는 데 중요하다13,14,19,28.

단백질 구조 연구에서, 외외형 불소호레, 즉 8-아닐리노-1-나프탈렌 설포네이트(ANS)는 주로 단백질 접기/전개28,29와관련된 실험에 사용되어 왔다. ANS는 일반적으로 기판31,32,33의결합 부위에서 네이티브 상태에서 단백질/효소에 결합한다. ANS 형광 양자 수율(ΦF)의 증가(즉, 형광 강도의 증가)는 광수 포켓에 있는 ANS와 그의 잔류물이34,35,36,37의적절한 상호작용이 발생할 때 λ=370 nm에서 단백질을 흥미진진하게 유도한다. 다양한 연구에서, Trp 잔류물 (기증자)와 ANS (수락자) 사이의 FRET (280-295 nm 내의 λ에서 흥미 진진한 경우)의 발생은 다음과 같은 것을 기반으로보고되었습니다 : 1) Trp의 형광 스펙트럼과 ANS의 흥분 스펙트럼의 중첩 및 ANS의 흥분 스펙트럼, 2) 보다 적합한 원거리 또는 TRpS (Trps) 식별 3) 단백질 포켓에 결합될 때 높은 ANS 양자 수율, 및 4) ANS3,17,27,37,38의존재에서 단백질의 형광 스펙트럼에서 특징적인 FRET 패턴.

최근에는 SERCA 및 기타 P형 ATPases에서 뉴클레오티드 결합 도메인(N-domain)에 결합하여 설계재조합 N-도메인40,41,42,43,44, 45,46을사용하여 조사되고있다. SERCA N-domain의 분자 공학은 유추형 결합 부위에 가까운 보다 역동적인 구조(Tyr587Trp)로 단독 Trp 잔류물(Trp552Leu)을 이동시키는 데 사용되어 왔으며, 여기서 형광 변이(cnching)는 리간드 결합34에따른 구조적 변화를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 실험 결과는 ANS가 정제된 재조합 SERCAN-도메인(34)에서뉴클레오티드 결합 부위에 결합(ATP로)을 결합한다는 것을 입증하였다. 흥미롭게도, ANS 형광은 295 nm의 λ에서 ecitation시 N-도메인에 결합할 때 증가하며, N-도메인의 본질적인 형광은34를감소시켜 Trp-ANS FRET 쌍의 형성을 암시하는 FRET 패턴을 생성한다.

NBS의 사용은 변형 된 단백질의 흡수성 분석에 의해 단백질(47)에서 Trp 잔류물의 함량을 결정하기 위해 제안되었다. NBS는 덜 흡수성 옥신돌47,48에Trp의 고흡수 인돌 그룹을 수정한다. 이로 인해 Trp 형광성질(40)의손실(담금질)이 발생한다. 따라서, Trp 잔류물의 NBS 매개 화학 적 변형은 FRET가 가설될 때 Trp (기증자로서)의 역할을 정의하는 분석으로 사용될 수 있다.

이 프로토콜은 SERCA의 엔지니어링 재조합 N-도메인에서 NBS에 의한 유일한 Trp 잔류물의 화학적 변형을 단백질 모델로 설명합니다. 실험 결과는 ANS 형광 강도가 여전히 화학적으로 NBS 변형 N-도메인34에서증가한다는 것을 보여 주며, 이는 본질적인 형광이 결여되어 있습니다. 따라서, 분석체는N-도메인(34,40,49)에바인딩될 때 Trp 잔류물과 ANS 사이에 FRET의 부재를 입증하는 데유용하다. 따라서, 이 분석 (Trp의 NBS 화학 수정) 단백질에 Trp-ANS FRET 쌍의 존재를 증명에 유용.

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프로토콜

1. ANS 및 SERCA N 도메인 상호 작용의 결정(실리코)

  1. 바람직한 단백질 모델링소프트웨어(50)를이용하여 분자 모델링을 통해 단백질(SERCA N-domain)의 3차원(3D) 구조를 생성한다.
  2. 바람직한 분자 구조소프트웨어(51)를이용하여 뉴클레오티드 결합 부위를 형성하는 아미노산 잔류물을 확인하고, 아르그와 리스잔류물(35)의존재를 결정한다. 이들은 ANS 결합을 위해 요구되고 형광 강도 (양자 수율)를 증가시다.
  3. 분자 도킹(바람직한 도킹 소프트웨어 사용)52,53,54(FITC)의 상호작용을 결정하기 위해 분자 도킹(1)을 수행하여(이는 뉴클레오티드 결합 부위를 표시하는 Lys515와 공유 결합을 형성함), 및 뉴클레오티드-결합 부위에 아미노산 잔류물을 가진 ANS(도킹1)를실시한다.
  4. 선호하는 소프트웨어에서 측정 도구를 사용하여 Trp 잔류물과 바운드 ANS 사이의 분자 거리(Å)를 계산합니다.
  5. ANS-N-도메인 복합체의 분자 역학 시뮬레이션을 수행하여 상호 작용52,54의안정성을 결정한다. 이어서, 복합체의 안정성이 확인되었을 때 시험관내 실험을 수행한다.

2. 재조합 N-도메인의 표현 및 정제

  1. N도메인(40)에대한 유전자 코딩을 합성한다.
  2. N-도메인(40)에대한 코딩합성 유전자를 포함하는 플라스미드를 설계 및 시공한다.
  3. 호화색소 (Ni-NTA), 엔지니어링 재조합 N 도메인에 의해 익스프레스 및 정화. 순도를 결정하기 위해 정제된 단백질의 SDS-PAGE를 수행한다(도2)40.
  4. N-도메인 소멸 계수(ε=11,960 M-1·cm-1)40으로 280nm의λ에서 흡광도를 연구하여 단백질 농도를 결정한다.

3. ANS 및 N 도메인 형광 강도 변화에 따라 ANS-N 도메인 복합체의 형성을 모니터링합니다.

  1. N,N-디메틸포르마미드에서 ANS 재고 솔루션을 준비합니다.
    1. 소량(1-5 mg)의 ANS의 무게를 측정하고, N,N-디메틸포르마미드, 예를 들어, 3.2 mg(10.69mMM 최종 농도)의 최종 부피의 1mL에 용해한다.
    2. N,N-디메틸포르마미드, 예를 들어, 10.69mM ANS 용액의 9.4 μL을 pH 8.0의 최종 부피를 얻기 위해 100 μM ANS 수성 스톡 솔루션을 준비한다.
    3. 15s용 3-5회 를 소용돌이시켜 솔루션을 섞는다.
      참고: 다음 실험에서는 ANS 수성 재고 솔루션만 사용하십시오. 실험을 시작하기 전에 ANS 수성 재고 솔루션을 신선하게 준비합니다.
  2. N,N-디메틸포르마미드에서 NBS 재고 솔루션을 준비합니다.
    1. 소량(1-5 mg)의 NBS의 무게를 측정하고, N,N-디메틸포르마미드, 예를 들어, 5.3 mg의 1mL(29.78 mM 최종 농도)에 용해한다.
    2. N,N-디메틸포르마미드, 예를 들어, 최종 부피0.1mm의 50mM 인산염 버퍼의 96.64 μL에 29.78 mM NBS 용액의 3.36 μL을 추가하여 NBS 용액을 사용하여 1mM NBS 수성 스톡 솔루션을 준비한다.
    3. 15s용 3-5회 를 소용돌이시켜 솔루션을 섞는다.
      참고: 실험을 시작하기 전에 NBS 수성 재고 솔루션을 새로 준비합니다.
  3. ANS로 N-도메인을 적시하고, 25°C에서 λ=295 nm에서 자궁 내분에 의해 형광 스펙트럼을 기록한다.
    1. 형광 스펙트럼 기준선을 가져옵니다.
      1. 1 mL 형광 석영 큐벳에 pH 8.0과 50 mM 인산염 버퍼의 1 mL을 배치합니다.
      2. 분광성계의 열-명시된 세포 챔버(25°C)에 세포를 배치하고 295nm로 발산 λ를 설정한다.
      3. 형광 스펙트럼 (305 - 550 nm)을 기록합니다.
        참고: 빈 시료역할을 하는 pH 8.0을 가진 50mM 인산염 버퍼의 형광 스펙트럼은 모든 얻어진 형광 스펙트럼에서 빼진다.
    2. N 도메인의 본질적인 형광 스펙트럼을 가져옵니다.
      1. 형광 석영 큐벳에 pH 8.0과 50 mM 인산염 버퍼의 900 μL을 배치합니다.
      2. N 도메인(10 μM) 서스펜션의 100 μL을 추가하여 1mL 최종 부피에서 1 μM N-도메인 최종 농도를 얻습니다.
      3. 마이크로파이프를 사용하여 20번 부드럽게 균질화하여 용액의 균질성을 보장합니다.
        참고: 단백질은 고품질 내성 형광 스펙트럼을 얻기 위해 신선하게 정제되어야 하며, 예를 들어, 정제된 재조합 N-도메인은 정제 후 1주일 동안만 사용할 수 있다.
      4. 분광성계의 열-명시된 세포 챔버(25°C)에 세포를 배치하고 295nm로 발산 λ를 설정한다.
      5. N-도메인 본질형 형광 스펙트럼(305-550 nm)을 기록합니다.
    3. ANS를 추가하고 λ=295 nm에서 흥분하여 형광 스펙트럼을 얻습니다.
      1. 정지된 N도메인(1 μM)에 100 μM ANS 수성 스톡 용액의 2μL 알리쿼트(1μM aliquot)를 추가하여 0.2 μM ANS 최종 농도를 얻습니다.
      2. 마이크로파이프를 사용하여 20번 부드럽게 균질화하여 용액의 균질성을 보장합니다.
      3. 분광성계의 열안정 세포챔버(25°C)에 셀을 배치하고 295nm로 발산 λ를 설정한다.
      4. 형광 스펙트럼(305-550 nm)을 기록합니다.
      5. ANS 추가 및 형광 스펙트럼 기록을 1:1 어금니 관계 ANS:N 도메인 위에 반복합니다.
      6. 적합한 소프트웨어를 사용하여 각 스펙트럼에서 빈 스펙트럼을 뺍니다.
      7. 단일 그래프에서 모든 스펙트럼을 플롯합니다.
      8. 스펙트럼이 FRET와 같은 패턴을 형성하는지 여부를 결정합니다. ANS-N-도메인 형광 스펙트럼은 FRET 와 같은패턴(그림 3A)을형성한다.

4. N-도메인 본질형 형광 적정 NBS와 Trp 화학 수정에 의해.

  1. 3.3.1 및 3.3.2 단계를 반복합니다.
  2. 1 μM NBS 수성 스톡 용액의 1 μL 알리쿼트를 일시 중단된 N-도메인(1 μM)에 추가하여 1μM NBS의 최종 농도를 얻습니다.
  3. 마이크로파이프를 사용하여 20번 부드럽게 균질화하여 용액의 균질성을 보장합니다.
  4. 분광성계의 열안정 세포챔버(25°C)에 셀을 배치하고 295nm로 발산 λ를 설정한다.
  5. 형광 스펙트럼(305-550 nm)을 기록한다(도3B).
  6. 최소한의 N-도메인 내성 형광 담금질이 관찰될 때까지 NBS 첨가 및 형광 스펙트럼 기록을 반복한다40. N 도메인에서 일반적으로 5-6 NBS/N 도메인40의어금니 비율로 발생합니다.
    참고: NBS는 N-도메인의 본질적인 형광을 빠르게 담금질(<5s); 형광 강도의 감소가 관찰됩니다. NBS는 또한 다른 아미노산 잔기(47)와반응 할 수 있기 때문에, 다음 단계로 즉시 진행한다.
  7. 적합한 소프트웨어를 사용하여 각 스펙트럼에서 빈 스펙트럼을 뺍니다.
  8. 단일그래프(그림 3B)에서모든 스펙트럼을 플롯합니다.

5. 25°C에서 형광 스펙트럼을 기록하여 NBS 변형 N-도메인을 ANS로 격자무성.

  1. 4단계에서 생성된 NBS 수정N 도메인을 사용하여 3.3.3 단계를 수행합니다.
  2. 적합한 소프트웨어를 사용하여 각 스펙트럼에서 빈 스펙트럼을 뺍니다.
  3. 단일그래프(그림 3C)에서모든 스펙트럼을 플롯합니다.
  4. 생성된 형광스펙트럼(도 3C)은FRET의 발생을 지지하거나 반박하며, 즉 FRET가 발생하면 ANS 형광이 증가하지 않으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.

6. λ=370 nm에서 여기로 화학적으로 변형된 N-도메인에 결합하는 ANS의 증거.

  1. 4단계에서 생성되었지만 난회 λ를 370nm로 변경한 NBS 수정 N 도메인을 사용하여 3.3.3 단계를 수행합니다.
  2. 적합한 소프트웨어를 사용하여 각 스펙트럼에서 빈 스펙트럼을 뺍니다.
  3. 단일그래프(그림 3D)에서모든 스펙트럼을 플롯합니다.
  4. ANS 형광 강도의 증가를 관찰하여 N 도메인에 바인딩ANS 바인딩을 확인합니다. N-도메인에 결합하는 ANS는 λ=370 nm(도3D)에서흥분할 때 형광 증가를 나타낸다. 대조군으로서, pH 8.0을 가진 50mM 인산염 완충제에서 ANS(단독으로)의 형광 스펙트럼은 295 및 370 nm의 λ에서 흥미진진한 얻어졌다(도 4,비디오에 표시되지 않음).
    참고: 화학적 수정에 필요한 NBS:Trp의 stoichiometric 관계는 연구 하에 단백질에 Trp 잔류물의 매장 정도에 따라 달라집니다46,47,55,56. 따라서 NBS:단백질/(Trp) 어어 비율을 미리 결정하는 것이 좋습니다.

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결과

분자 도킹은 정전기뿐만 아니라 소수성 상호 작용을 통해 N-도메인의 뉴클레오티드 결합 부위에 ANS의 결합을나타낸다(도 1). Trp 잔류물과 ANS(뉴클레오티드 결합 부위에 바인딩)사이의 분자 거리(20 Å)는 FRET(도1)의발생을 지원합니다. 설계(engineered) 재조합 N-도메인은 친화성 크로마토그래피(그림2)에의해 고순도에서 얻어졌으며 형?...

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토론

ANS-N-도메인 복합체의 형광 스펙트럼은 295nm의 λ에서 흥분할 때 FRET 와 같은 패턴을 나타내며, Trp 잔류물과 ANS 사이의 분자 거리(20 Å)는 FRET(도1)의발생을 지지하는 것으로 보인다. NBS에 의한 Trp 화학 적 변형은 덜 형광 N 도메인(도 3B,스펙트럼 f);을 초래한다; 따라서 에너지 전송은 불가능합니다. ANS 형광 스펙트럼은 295 nm(도 3A

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공개

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 작품은 부분적으로 FAI-UASLP 보조금 번호 C19-FAI-05-89.89 및 CONACYT 교부금 번호 316463 (아포요스 라 시엔시아 드 프론테라: 포르탈레시미엔토 y 만테니미엔토 드 인프라에스트루쿠라스 드 Investigación de Usocomún y Capacicn. 저자는 비디오 에디션에서 줄리안 E. 마타 모랄레스의 기술 적 지원에 감사드립니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamideBio-Rad1610107SDS-PAGE
Ammonium persulfateBio-Rad1610700SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acidSigma-AldrichA1028Fluorophore
Bis-acrylamideBio-Rad1610125SDS-PAGE
N-BromosuccinimideSigma-AldrichB81255Chemical modification
N,N-dimethylformamideJ.T. Baker9213-12Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF7250Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvetteHellmaZ801291Fluorescence assay
Fluorescence SpectrofluorometerShimadzuRF 5301PCFluorescence assay
HisTrap™ FFGE Healtcare11-0004-59Protein purification
IPTG, Dioxane freeAmerican BionalyticalAB00841-00010Protein expression
ImidazoleSigma-AldrichI5513-25GProtein purification
LB mediaFisher Scientific10000713Cell culture
Pipetman L P10LGilsonFA10002MFluorescence assay
Pipetman L P100LGilsonFA10004MFluorescence assay
Pipetman L P200LGilsonFA10005MFluorescence assay
Pipetman L P1000LGilsonFA10006MFluorescence assay
Pipetman L P5000LGilsonFA10007Fluorescence assay
Precision plus stdBio-Rad1610374SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphateBio-Rad1610302SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasicJ.T. Baker3828-19Buffer preparation
Sodium phosphate monobasicJ.T. Baker3818-01Buffer preparation
Syringe filter 0.2 umMilliporeGVWP04700Solution filtration
TemedBio-Rad1610801SDS-PAGE
TrisBio-Rad1610719SDS-PAGE

참고문헌

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