Aachener Minipigs的无菌性心包炎作为心房肌病和心房颤动的模型

摘要

我们描述了一种在迷你猪中无菌性心包炎模型来研究心房肌病和心房颤动（AF）。我们介绍了手术和麻醉技术，血管通路策略以及研究心房颤动诱导性的方案。

摘要

心房颤动（AF）是由心房结构重塑引起的最常见的心律失常，也称为心房肌病。目前的治疗仅针对电异常，而不是潜在的心房肌病。对于新疗法的开发，需要可重复的心房肌病大型动物模型。本文介绍了Aachener minipigs中无菌性心包炎诱导的心房肌病模型。无菌性心包炎是通过喷洒无菌滑石并在心房心外膜表面留下一层无菌纱布引起的。这导致了炎症和纤维化，这是心房肌病病病理生理学的两个关键组成部分，使心房容易受到心房颤动的诱导。两个起搏器电极被心外膜放置在每个心房上，并连接到来自不同制造商的两个起搏器。该策略允许重复的非侵入性心房程序性刺激，以确定术后特定时间点心房颤动的诱导性。使用不同的方案来测试心房颤动诱导性。该模型的优点是其临床相关性，具有心房颤动诱导性和炎症和纤维化的快速诱导 - 均存在于心房肌病中 - 及其可重复性。该模型将有助于开发针对心房肌病和心房颤动的新疗法。

引言

心房颤动 （AF） 是最常见的心律失常，可导致显著的发病率、死亡率和医疗费用¹。在许多情况下，心房颤动仅仅是潜在心房肌病的电症状，其定义为心房的结构、电、自主神经和收缩性重塑。这种心房肌病可导致心房颤动和中风^2，3。大多数疗法仅针对电重塑，但不针对心房的潜在结构变化（炎症和纤维化）^{4，5，6，7}。这可能是为什么目前的疗法只有轻微的效果的原因之一，特别是在更晚期的心房肌病⁸中。

可重复的动物模型对于靶向心房肌病中存在的炎症和纤维化至关重要。在几种大型动物物种中已经开发了心房快速模型^{9，10，11，12}。在这些模型中，心房组织长时间连续调整以诱导电和最终的结构变化。快速分析模型的主要缺点是心房肌病结构性体征出现之前的持续时间较长，并且它们仅与心房肌病前发生电异常的临床综合征相关。理论上的风险是长时间随访期间纤维化导致的起搏-先导衰竭⁹.

在无菌性心包炎模型中，无菌滑石粉喷洒在心房的心外膜表面以诱导急性炎症和纤维化反应，导致心房肌病^13，14。猪的心脏解剖结构和生理学与人类相似，因此猪模型具有很高的转化相关性。使用迷你猪的优点是，由于它们的尺寸比传统的猪品系小，它们更容易处理，并且可以长时间保持而不会显着增加体重¹⁰。所有这些原因使迷你猪的无菌性心包炎成为研究心房肌病和颤动的极好模型。该协议和视频旨在促进该模型在不同研究设施中的设置，并标准化协议以研究心房颤动的诱导性。

研究方案

该协议已获得安特卫普大学动物试验伦理委员会（病例号2019-29）的批准，并遵循安特卫普大学的动物护理指南。本研究选择了17只6个月大的Aachener迷你猪（雄性，阉割），体重约为20公斤。

1. 药物和麻醉

1. 用药前
   1. 确保猪禁食12小时，但无限制地获得水。
   2. 对于镇静剂，在一次肌内注射中施用以下药物:阿托品0.05mg / kg，氯胺酮10mg / kg，咪达唑仑0.5mg / kg。
   3. 确定猪失去意识后的确切体重（剂量后约10分钟）。将猪运送到手术室。
   4. 将猪放在加热垫上。
   5. 应用ECG监测，脉搏血氧仪，并进行初始测温。
   6. 将针头导管（22 G）插入边缘耳静脉或外隐静脉。
2. 麻醉
   1. 对于麻醉的诱导，在开始插管之前给予丙泊酚推注（1-4mg / kg IV）。如果发现浅表麻醉，静脉注射咪达唑仑0.2mg / kg的额外推注，并在〜5分钟后进行插管。
   2. 插管
      1. 将猪置于俯卧位。
      2. 要求助手用两条纱布吊带和/或一个张嘴器打开动物的嘴。用2mL无针注射器在喉部喷洒1mL（10mg）利多卡因，等待30-60s以使喉部脱敏，然后继续。
      3. 使用喉镜放置内径为6.5 mm的气管插管（ETT）。使用喉镜进行可视化，将会厌从软腭中移开，并将样式放入ETT中以进行更好的操作。
         注意:猪的嘴巴不能张开，从鼻尖到喉部的距离很长。因此， rima glottis的 可视化是有限的。因此，ETT 和 stylet 有助于可视化。
   3. 连接呼吸机时，如果需要，给予补充药物:咪达唑仑0.5mg / kg静脉注射和/或阿芬太尼30μg/ kg静脉注射。
   4. 使用以下呼吸机设置:容量控制通气（VCV），预设潮气量为10 mL / kg，导致吸气峰值压（PIP）为11-15 cmH₂0，呼气末正压PEEP为2-5 cmH₂0;呼吸频率:12-16 Brpm，将潮气末 CO2 （ETCO2） 维持在 35-45 mmHg 之间;FiO₂:50%（当饱和度为100%时降低）;七氟醚2.5%。
   5. 对于镇痛，使用阿芬太尼0.5-1μg·（公斤·分钟）^-1 网易娱乐.
   6. 推注10 mL/kg血浆解质3-5 mL·（公斤·小时）^-1 超过10-20分钟，以纠正由于低血容量引起的低血压。
   7. 给予1g头孢唑啉IV。对于每2小时的手术，额外施用500mg头孢唑啉IV。
      注:有关手术室中手头急救药物的概述，请参见 表1。膀胱导管插入术在公猪中是困难的，并且通常不需要用于此程序。
   8. 剃除动物的胸部和颈部区域。
   9. 将兽医软膏涂抹在眼睛上，以防止麻醉过程中的干燥和眼睛刺激。
   10. 持续监测重要参数。通过评估下颌张力是否松弛，睑反射是否不存在，眼睛是否旋转，并且没有兴奋的行为迹象，至少每10分钟检查一次麻醉深度。检查粘膜的颜色和毛细血管再充盈时间，以评估组织灌注。将所有数据以及所有给药药物记录在单个麻醉图中。
   11. 动脉导管放置
       1. 准备传压系统。将5000 IU肝素加入500mL 0.9%NaCl的IV袋中。
       2. 将动物放回仰卧位。在颈动脉设置中使用超声和血管探针延长腿部并定位股动脉。用氯己定消毒腹股沟区。使用铵对超声探头进行灭菌（或使用无菌换能器盖），并使用无菌手套以确保防腐技术。
       3. 使用超声引导穿刺股动脉。使用Seldinger技术插入3 Fr鞘。
          注意:由于股动脉直径小，让助手通过针头插入导丝可能会有所帮助。仅抬起超声探头的动作就可能使针尖脱臼。
       4. 用缝合线固定鞘。将护套连接到传感器并冲洗。实时监测动脉血压。

2. 手术

1. 制备
   1. 确保动物仰卧在稳定位置。为了获得额外的稳定性，将预热的静脉输液袋放在脊柱旁的位置以支撑动物。
   2. 将电烙的接地板放在动物下方。使用少量超声波凝胶，以确保与皮肤的适当接触。
   3. 皮肤准备:在以下区域剃除动物:颈部，上肢，胸部前部，腹部上部，腹股沟和ECG电极位点。用70%的酒精和2%的碘交替进行三次磨砂，以对皮肤进行适当的消毒。
   4. 放置无菌窗帘。将动物的爪子也包裹在无菌床单或手套中。使用无菌纱布将其缩回。
   5. 为确保无菌条件，请用无菌手术罩覆盖手术区域，使用无菌器械，并在无菌条件下工作，直到皮肤闭合。
      注意:在整个手术过程中，外科医生必须戴上发帽，口罩，手术服和无菌手套。
2. 手术放置永久性中心静脉导管 （CVC）
   1. 在胸锁乳突肌内侧缘的凹槽中做一个5厘米的切口。钝性解剖，直到到达颈内静脉。
   2. 去除静脉周围的纤维组织，并在所需的导管插入部位周围放置一条方形缝合线（= 3至4针形成一个圆圈），Prolene 6-0以获得血管控制。
   3. 使用Seldinger技术，用3个法国三腔CVC卡压颈内静脉。收紧导管周围的Prolene 6-0缝合线。
   4. 将导管的手柄固定在胸锁乳突肌上。
   5. 将三根导管腔分别隧道:用一把大对钝的解剖剪刀形成隧道，并用一个无创钳将导管腔拉过隧道。 将导管的末端牢固地连接到皮肤上，并插入无针注射口。导管腔的出口部位位于耳后，尽可能远离切口部位，以确保导管在皮肤下的最大轨迹长度。
   6. 将切口部位分两层关闭。
3. 胸骨切开术
   1. 从胸骨的手管到剑突下方3厘米处做一个正中切口，直到胸骨变得明显。
   2. 从 xiphoid 过程中钝地从尾部剖析。将手指放在胸骨的内脏侧，并尽可能沿着内脏胸骨表面去除结缔组织。
      注意:切除结缔组织以防止在进行胸骨切开术时心肌损伤。
   3. 使用胸骨锯切开胸骨。控制所有出血部位。使用胸骨扩张器扩大胸腔的通道。避免损伤胸膜。
   4. 小心打开心包，并使用悬浮缝合线将其挡在手术场之外。
4. 起搏器导联放置（见 图1）
   1. 将起搏器导线放在左心房。
      1. 测试引线固定螺钉的伸缩和缩回机制。然后，将尖端放在（弯曲的）镊子上，并在必要时将样式弯曲60°。
      2. 在左心室敷上，轻轻将其拉到一边，可以看到左心房。
         注意:心室压力会迅速引起低血压。确保麻醉师通过CVC用低剂量去甲肾上腺素来预测这一点。 当平均血压降至 40 mmHg 以下持续 >20 s 时，释放心室。仅当动物的血压正常化时才进行。
      3. 在左心房的可视化后，将铅尖牢固地放在左心房游离壁上，尽可能靠近肺静脉并尽可能远离心室。通过将螺旋延伸到心房组织将其拧入，最好是稍微倾斜。尽快完成此操作，并立即释放左心室的压力。
      4. 使用可编程电刺激器或起搏器编程器测量引线的感应和起搏阈值及阻抗。确保在高电压（10 V）下起搏时没有心室过度捕获（心电图上的QRS宽）。如果不满足，请收回引线的螺旋线，然后从步骤 2.4.1.1 重新开始。
         注意:正常起搏阈值应为<1 V，脉冲宽度为0.5 ms（典型值为~0.5 V @0.5 ms）。
   2. 在右心房放置起搏器导线，完全类似于左心房导线的位置。
   3. 确保两条导线都离开胸部在中线;左心房导联必须通过腹部皮下脂肪从剑突到左翼，右心房导线到右翼。
   4. 在猪的左右侧皮下脂肪中做一个起搏器口袋。将起搏器连接到导线，并将其放在口袋中。将能够执行（50 Hz）突发起搏的起搏器与左心房导线（允许起搏）和来自不同制造商的起搏器（以避免串扰，同时读出两个起搏器）连接到右心房导线（以允许感应）。用经典的单缝线关闭2层，内层用Vicryl 1-0，外层用Mersilene 0。
5. 无菌性心包炎的诱导
   1. 通过轻轻拉开心室再次暴露心房。用纱布盖住心室（然后把纱布拿走）。
   2. 使用包装中包含的分配器将无菌滑石粉喷洒在两个心房的心外膜表面上。由于这种操作后会出现心动过缓和低血压，因此请给心脏足够的时间在大约一分钟后自发恢复;如有必要，开始或增加（输注速率）去甲肾上腺素滴注。
   3. 在两个心房的心外膜表面上留下一层无菌纱布（5 cm x 5 cm）:一片左一右。
   4. 在开始闭合之前，最后一次检查起搏器引线的位置。
6. 闭合胸部
   1. 在纵隔中留下引流管并将其隧道输送到皮肤表面。将排水管连接到无菌真空罐;当表皮的第一层关闭时打开连接（以避免漏气）。将动物带回马厩时，取下排水管。
   2. 用Prolene 6-0关闭心包。
   3. 使用经典的环扎技术用不锈钢丝闭合胸骨。
   4. 用可吸收的螺纹将皮下部分两层关闭。
   5. 通过将5mL的0.5%布比卡因浸润到皮肤中来进行胸骨阻滞;确保骨骼与胸骨接触以浸润骨膜。
      注意:或者，通过在胸骨切口前进行胸骨阻滞来使用先发制人的镇痛可能更好。
   6. 使用可吸收线用连续的皮内缝合线闭合皮肤。

3. 术后护理

1. 逐渐关闭所有镇静剂，同时闭合动物的皮肤。
2. 将动物留在手术室中，密切监测体温、通气和气道通畅性、氧合和血流动力学参数。
3. 由于手术过程中经常发生体温的大幅下降，请使用毯子，加热垫和热敷包保持动物温暖。在恢复过程中提供氧气，特别是当注意到颤抖时。
4. 应用50μg/ h的芬太尼贴剂进行术后镇痛。由于芬太尼贴剂生效前有6-8小时的延迟，因此皮下注射0.05-0.1mg / kg吗啡以桥接这一时期。
5. 当动物稳定时，显示体温升高;可以抬起头;正在吞咽;显示正常的眼反射;并且自发、自由、深呼吸，没有 ETT 就位，没有上气道阻塞的迹象;它可以被运回笔。在恢复阶段提供加热装置（例如，红外灯、加热垫、毯子）。
   注意: 避免过早地将动物放回围栏， 因为呼吸停止是可能的，即使在戒毒后数小时也是如此。
6. 对动物进行检查:术后第一个小时每15分钟检查一次，然后在前4-6小时内每小时检查一次，如果动物不舒服，则更频繁地检查一次。当动物出现疼痛迹象时，每2小时皮下给予补充吗啡0.025-0.05mg / kg，直到感觉舒适。手术后8小时和16小时给予1g头孢唑啉。
   注意:疼痛评估由主观因素组成，如态度、行为（站立、进食、饮水）和鬼脸。疼痛的客观体征包括心率升高、呼吸频率加快和浅呼吸。动物将在24小时内恢复到正常状态和行为。在手术后第3天取下芬太尼贴剂。

4. 心房快速诱导心房颤动

1. 肌内注射氯胺酮10mg / kg和咪达唑仑0.5mg / kg（无阿托品），并等待，直到达到足够的镇静水平。
2. 再次称量猪的重量以进行随访。将动物放在约束吊带中，并将其带到手术室。
3. 附加ECG和血氧饱和度监测，并将编程器头放在相应的起搏器上。询问心脏起搏器。
4. 检查起搏器设置以了解自发性心房颤动的发生。使用双室起搏器时，请寻找心室导联警告。
5. 确定阻抗以及检测和起搏阈值。在进行电生理学（EP）研究时，始终以两倍于阈值电压的速度加速，并在实验过程中观察电压阈值的增加。
6. 确定心房有效不应期 （AERP），近似于在爆破起搏期间保持 1:1 捕获的最短周期长度。
   注意:该方法与临床AERP测定不同，但与该方案更相关。
7. 通过测量起搏尖峰开始与右心房导联心房去极化之间的时间，确定左心房导联和右心房导联之间的传导时间。
8. 对于第一个实验方案，应用脉冲速度20秒，循环长度为AERP + 30毫秒。停止起搏后，检查是否存在心房颤动并测量发作持续多长时间。在每次起搏之间暂停至少 5 秒，等到窦性心率恢复到基线。重复这个≥10次;注意心房颤动诱导性显示为百分比 - "成功"尝试与诱导心房颤动的尝试总数的比例。
   注意:只有> 5 秒的情节才被视为相关。
9. 对于第二种方案，应用脉冲速度20秒，从AERP + 20 ms的周期长度开始。在随后的突发期间，减小循环长度，直到以 1:1 捕获的最小周期长度。重复此步骤至少10次。注意心房颤动持续时间和心房颤动诱导。
10. 对于第三种实验方案，以 50 Hz 的频率应用 5 秒的突发配速，重复此步骤至少 10 次。注意心房颤动持续时间和心房颤动诱导。
11. 让动物醒来或继续进行其他程序（例如，超声心动图、治疗、抽血）

5. 安乐死

1. 在持续一个月的实验之后，动物被安乐死，过量的静脉注射戊巴比妥（50mg / kg，IV）。安乐死的人道终点是持续存在严重疼痛或不适的迹象，尽管进行了充分的治疗。这是每天在临床上进行评估的:令人担忧的体征包括高血压，心动过速，呼吸频率增加，行为改变（烦躁不安，固定，发声）和下颌紧握。

6. 假手术

1. 执行相同的方案，不要将滑石粉喷洒在心房上睑上或留下一层无菌纱布。

结果

发病率和死亡率:
当我们开始在Aachener minipigs中开发这种无菌性心包炎模型时，我们注意到17头猪中有4头（23.5%）的围手术期死亡率为4只（23.5%）:由于"学习曲线效应"，4例死亡中有3例发生在前6次手术中。病因如下:2头猪因术后呼吸骤停而死亡;这个问题通过减少阿芬太尼的剂量得到解决。一头猪在第一次起搏过程中因心室颤动而死亡，一头在起搏导联测试期间死亡:这是由于心室过度?...

讨论

可靠的大型动物模型是研究心房肌病和心房颤动以及开发心房颤动新疗法的主要资产。在心房心髁上植入起搏器导联允许纵向随访和重复的电生理学检查，这在小动物中是困难的。迷你猪很容易处理，它们的心脏在结构和生理上与人类的心脏^相似10。

与连续心房快速检查相比，无菌性心包炎模型相对简单，因为不需要定制的程序化起搏器。该模型中诱导的病...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aachener minipig, 6-months old, male, castrated, weight 15-25 kg	Carfil
Anesthesia and preparation
ECG electrodes
Endotracheal tube 6.5 mm ID	Covidien	115-65OR
External cardioverter-defibrillator	Innomed	Cardio-aid 200B
Heating pad	OK.	OUB 60321
Intravenous catheter 22 GA, 1 Inch	BD	381323
Laryngoscope blade size 4	Miller	SUS426601
Monitor	GE Medical systems	2600040-003
Respirator	Datex-Ohmeda	1009-9000-000
Shaver	Aesculap	GT 104 / REF 985203
Syringe driver pump	Fresenius Kabi	082470
Arterial and central venous line placement
3-lumen central venous catheterization set, 7 French, 16 cm, 0.032 Inch guide	Arrow medical	EU-22703-EN
Arteral catheter 3 French, 8 cm	Vygon	1,15,090
Caresite Luer access device	B. Braun	415122-01
Fluids: IV bags of Plasmalyte, Glucose 5%, NaCl 0.9% (500 mL or 1000 mL)
heparinized saline
Needles: 18 Ga / 40 mm and 22 Ga / 40 mm
Pressure monitoring set, 195 cm	Edwards Lifesciences	T005021M
Pressure tubing 180 cm	Edwards Lifesciences	50P172
suture with needle
Syringes Luerlok: 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL, 50 mL
Ultrasound gel	Zealand coating	446-1
Ultrasound with vascular probe	Philips healthcare	EPIQ 7C / REF BZE1723
Surgical set
Blunt-tip surgical scissors	Martin	11-934-25
60 degrees curved Debakey forceps	Aesculap	FB403
Anatomical forceps	AS	13-102-16
Debakey forceps	Geister	10-0634
Electrocautery module	Alsa	Alsatom SU 140/D MPC
Holders for stainless steel wire	COBE	013-123
Mosquito	Leibinger	32-01008
Needledriver, fine	Delacroix-Chevalier	50302-21
Needledriver, normal	Aesculap	BM 77
Rib spreader	Martin	24-178-01
Scalpel	Swann-Morton	0511	no. 24
Scissors for stainless steel wire	Jakobi	411830
Spreaders	AS	16-058-00
Sternum saw	Eure-Power	5000020
Sternum saw blade	MicroAire	ZR-032M
Surgical consumables
Disinfectant: iodine, chlorhexidine
Electrocautery pencil with push button, cable 5 m	Dongguan QueenMed Equipment	ESPB4001LQ
Gastric tube	Vygon	390.12
Mersilene-0, 75 cm	Ethicon	F2505H
Monocryl 3-0, 70 cm	Ethicon	Y423H
Mouth masks, hair nets
Oriflex-4 vacuum flask for surgical draining	Oriplast Krayer	VK00352
Prolene 6-0, 75 cm	Ethicon	8711H
Stainless steel monofilament non-absorbable suture	Ethicon	W995
Sterile drapes	3M	9010
Sterile gauze 20 x 10 cm	Stella	35921
Sterile gloves
Sterile surgical gown
Steritalc PF3	Novatech	16863
Vicryl-0, 75 cm	Ethicon	V324H
Cardiac pacing
Bipolar pacing lead Fineline II Sterox EZ 58 cm	Boston Scientific	4474
Bipolar pacing lead Tendril STS 58 cm	Abbott	2088TC
Ellegaard Göttingen Minipig Frame 3	Lomir	DF H1PU
Ellegaard Göttingen Minipig Sling Cover	Lomir	SS CEG1
Micropace cardiac stimulator	Boston Scientific	EPS 320
Pacemaker for pacing	Medtronic	Azure XT DR MRI SureScan
Pacemaker for sensing	Biotronik	Eluna 8 DR-T
Pacemaker programmer for pacing	Medtronic	CareLink Encore 29901A
Pacemaker programmer for sensing	Biotronik	ICS 3000 DS CD-W US
Medication
Adrenaline 1 mg/mL, 1 mL	Sterop
Atropine 0.5 mg/mL, 1 mL	Sterop
Catapressan 150 µg/mL, 1 ml clonidine	Boehringer Ingelheim	BE021402
Cefazoline 2 g powder	Mylan	BE319794
Cordarone 50 mg/mL, 3 mL amiodarone	Sanofi
Durogesic 50 µg/h fentanyl patches	Janssen-Cilag
Glucose 5%, 500 mL	Baxter	AE0063
Ketalar 50 mg/mL, 10 mL	Pfizer	804101
Lanoxin 0.25 mg/mL, 2 mL digoxine	Aspen
Marcaine 0.5% + adrenaline 1:200,000	Aspen
Midazolam 5 mg/ml, 3 mL	B. Braun	3521740
Morfine 10 mg/mL, 1 mL	Sterop
NaCl 0.9%, 500 mL	Baxter	AKE1323
Nitro Pohl 1 mg/mL, 5 mL nitroglycerine	Pohl Boskamp
Noradrenaline 1 mg/mL, 4 mL	Aguettant
Plasmalyte 1000 mL	Baxter	AKE0324
Propofol 10 mg/mL, 20 mL	B. Braun	3521810
Protamine 1400 IU/mL, 5 mL	Leo pharma
Rapifen 0.5 mg/mL, 2 mL	Janssen-Cilag	95103
Seloken 1 mg/mL, 5 mL metoprolol	AstraZeneca
Sevorane Quick Fill 100% sevoflurane, 250 mL	Abbvie	1283-415
Tracrium 10 mg/mL, 5 mL atracurium	Aspen