从水生栖息地分离、繁殖和鉴定具有碳氢化合物代谢特性的细菌种类

摘要

我们介绍了从水生栖息地分离，繁殖和表征碳氢化合物降解细菌的过程。该协议概述了细菌分离，通过16S rRNA方法鉴定以及测试其碳氢化合物降解潜力。本文将帮助研究人员表征环境样本中的微生物生物多样性，特别是筛选具有生物修复潜力的微生物。

摘要

碳氢化合物污染物不易降解，它们在环境中的积累对所有生命形式都是有毒的。细菌编码许多催化酶，并且自然能够代谢碳氢化合物。科学家利用水生生态系统中的生物多样性来分离具有生物降解和生物修复潜力的细菌。这种来自环境的分离物提供了一套丰富的代谢途径和酶，可以进一步用于在工业规模上扩大降解过程。在本文中，我们概述了从水生栖息地分离，繁殖和鉴定细菌物种的一般过程，并使用简单的技术筛选它们利用碳氢化合物作为 体外 唯一碳源的能力。本协议描述了各种细菌物种的分离以及随后使用16S rRNA分析进行鉴定。该协议还提供了表征细菌分离物的碳氢化合物降解潜力的步骤。该协议对于试图从环境栖息地中分离细菌物种以进行生物技术应用的研究人员很有用。

引言

碳氢化合物（HC）被广泛用作燃料和化学应用。苯、甲苯、二甲苯等芳烃被广泛用作溶剂¹。乙烯和丙烯等烯烃分别作为聚乙烯和聚丙烯聚合物合成的前体。另一种烃类苯乙烯聚合形成聚苯乙烯。人为活动在生产和运输过程中将碳氢化合物引入环境。土壤和水的碳氢化合物污染对环境和人类健康造成严重关切。微生物通过调节生物地球化学循环和利用包括污染物和异生素在内的各种基质，将其转化为碳和能源，在维持生态系统方面发挥着重要作用。微生物对环境污染物进行解毒的过程称为生物修复3,4,5,6,7。

在水生和土壤栖息地中发现了具有降解碳氢化合物能力的微生物^8,9,10。已经鉴定出许多具有降解烷烃和芳香族HC潜力的细菌，例如假单胞菌，不动杆菌，红球菌，马里诺杆菌和Oleibacter¹¹。技术先进的培养独立方法的开发有助于发现新的HC降解微生物群落¹²。直接从源样品中分离的基因组材料通过下一代测序（NGS）等高通量方法进行扩增和测序，然后进行分析，无需培养微生物。NGS方法，如宏基因组分析，价格昂贵，并且存在与扩增过程相关的缺点¹³。靶向分离碳氢化合物降解微生物的选择性富集培养^物14等培养技术仍然有用，因为它们允许研究人员探测和操纵细菌分离物中的代谢途径。

基因组DNA分离和随后的基因组材料测序揭示了有关任何生物体的宝贵信息。全基因组测序有助于鉴定编码抗生素耐药性的基因、潜在药物靶点、毒力因子、转运蛋白、异生代谢酶等15,16,17。16SrRNA编码基因的测序已被证明是鉴定细菌系统发育的可靠技术。多年来基因序列和功能的保存使其成为识别未知细菌并将分离株与最接近的物种进行比较的可靠工具。此外，该基因的长度最适合生物信息学分析¹⁸。所有这些特点，以及使用通用引物进行基因扩增的便利性和基因测序技术的改进，使其成为微生物鉴定的黄金标准。

在这里，我们描述了一种从环境样品中回收具有HC降解潜力的可培养微生物的程序。下面描述的方法概述了HC降解细菌的收集和鉴定，分为五个部分:（1）从水样中收集细菌，（2）分离纯培养物，（3）探索细菌分离株的HC降解能力（4）基因组DNA分离，以及（5）基于16S rRNA基因测序和BLAST分析的鉴定。该程序可以适用于分离细菌以进行许多不同的生物技术应用。

研究方案

1. 样品采集、处理和分析

注意:在这里，我们提出了一种从水生栖息地分离细菌的方案。一些分离物可能具有致病性，因此，在使用前后戴上手套并对工作区域进行消毒。

1. 从水体的不同位置收集 500 mL 水样在五个无菌玻璃瓶中。分别使用pH计和温度计测量每个样品的pH和温度。
   注意:该方案不是针对特定地点的，也可以很容易地适应从碳氢化合物污染的水体中分离生物。
2. 在无菌条件下，在一批 100 mL 至 0.22 μm 孔径的滤片中过滤样品。
   注意:滤纸的直径不应超过培养皿直径。例如，直径不超过85毫米的滤纸最适合100-120毫米的培养皿。
3. 将滤纸放在不同的营养培养基板上（PYE^19，R2A 20，M9，LB，NB，TSB，M63²¹和M2G²²）。不同类型的生长培养基允许选择和富集不同的微生物。表1列出了各种生长培养基的组成。每个培养基板使用一张纸，并在2小时后使用无菌镊子剥离。
4. 通过在 900 μL 无菌水中加入 100 μL 收集的水样品，在无菌双蒸水中连续稀释未过滤的水样品（10⁶ 稀释）。这导致 1:10 的稀释度。从该样品中，取 100 μL 并加入 900 μL 无菌水以获得 1:100 稀释度。重复稀释，直到稀释倍数为1:1,000,000。通过移液混合。每次稀释的最终体积为 1 mL。
5. 将 100 μL 稀释的水样品分别铺在步骤 3 中提到的所有生长培养基板上，一式三份。
6. 根据菌落的生长，将板在30°C孵育24至48小时。
   注意:大多数环境分离物在30°C的最佳温度下生长。 如果将样品从极端温度的环境中分离出来，请将板以与收集地点相同的温度孵育。
7. 接下来，使用无菌牙签或移液器吸头挑选菌落并进行象限条纹以获得分离的菌落。
8. 将培养皿孵育过夜。第二天，根据其形态特征（如颜色、质地、形状、大小、边缘、海拔等）筛选菌落。重新建立殖民地以获得纯正的培养物。
9. 对每个纯培养物²³ 进行革兰氏染色，并进行甘油原液制备。
10. 为了制备甘油储备液，将单个菌落接种在3mL适当的生长培养基中，并在30°C下孵育。 从过夜培养物中，取 700 μL 并在冷冻管²⁴ 中加入 300 μL 100% 甘油（通过高压灭菌）。将小瓶冷冻在-80°C以长期储存。

2. 碳氢化合物的降解

注意:下面的示例用于筛选可以降解苯乙烯的分离物。这是对上一份报告中采用的方法略有修改²⁵.在无菌条件下遵循步骤。

1. 从新鲜条纹的平板中，选择一个菌落并接种在 5 mL 胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB）/营养肉汤 （NB） 中。将培养物在30°C下生长过夜，以200rpm振荡直至吸光度达到~2。
   注意:除TSB / NB外，可以选择细菌达到高细胞密度的任何生长培养基。
2. 第二天，在4°C下以2862× g 沉淀细胞5分钟，弃去上清液。
3. 用2mL高压灭菌的盐水（0.9%NaCl）洗涤沉淀两次，并在4°C下以2862× g 旋转5分钟。
   注意:盐水是等渗的，因此，它维持细菌细胞内的渗透压。
4. 将沉淀重悬于 2 mL 液态无碳基础培养基 （LCFBM） 中。测量吸光度（OD₆₀₀）。
5. 取两个容量为150mL的无菌锥形瓶进行对照和实验组。将它们标记为 A 和 B。
6. 在未接种/对照组（烧瓶A）中，加入40mLLCFBM和苯乙烯（5mM）。
7. 在烧瓶B中，加入35mLLCFBM和苯乙烯（将苯乙烯的终浓度调节至5mM）。加入细胞悬液，最终OD₆₀₀ 细胞≈0.1，并用LCFBM补足剩余体积，最大可达40 mL。将烧瓶在30°C下以200rpm振荡孵育30天。
   注意:过量的碳氢化合物可能对微生物有毒，因此，从低浓度开始，逐渐增加。
8. 对必须评估碳氢化合物降解的每个额外菌株重复上述操作。
9. 每5天测量每个烧瓶的OD₆₀₀ 并绘制生长曲线。如果细菌可以利用苯乙烯，则将孵育时间延长至45天。OD₆₀₀ 的增加表明细菌可以代谢苯乙烯。

3. 细菌分离株对儿茶酚降解的筛选

注意:芳烃如苯乙烯，苯，二甲苯，萘，酚类等的降解产生邻苯二酚作为反应中间体。儿茶酚在邻苯二酚1,2-双加氧酶和儿茶酚2,3-双加氧酶的帮助下分别通过邻位和间裂解途径被细菌进一步代谢²⁶。这些酶还参与其他碳氢化合物的降解，例如氯苯²⁷。下面提到的方案使用全细胞裂解物进行儿茶酚2,3-双加氧酶测定²⁸。相同的裂解方法可用于筛选邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性。然而，反应混合物的组成会有所不同。这两种酶本质上都是可诱导的，可以通过向生长培养基中添加苯酚来诱导。

1. 在无菌环的帮助下，将新鲜条纹板中的细菌菌落接种到补充有1-4mM苯酚的矿物盐培养基（MSM）中。在30°C和200rpm下孵育培养物。当OD 600达到1.4-1.6之间（即，在指数后期）时，通过在₄₅₀₀ × g 旋转20分钟，在4°C收获培养物。
2. 用磷酸盐缓冲液（0.5M，pH 7.5）洗涤细胞沉淀。
3. 将细胞重悬于上述磷酸盐缓冲液中，并将最终OD₆₀₀≈1.0调节。
4. 通过脉冲超声处理裂解细胞1.5分钟，每个脉冲的持续时间为15秒。在此步骤之后，悬浮液必须透明或不太浑浊。如果没有，请增加脉冲数并检查悬架是否清除。每次脉冲后，将样品放在冰上以避免蛋白质降解。
5. 通过以9,000× g 离心30分钟来除去细胞碎片和未破碎的细胞，保持低温（4°C）。
6. 小心地移取澄清的上清液。该馏分具有用于酶测定的粗提取物。
7. 通过布拉德福德或洛瑞方法^29,30确定粗提取物的蛋白质浓度。
8. 为了确定儿茶酚2,3-双加氧酶的活性，通过分光光度计测量反应终产物（2-羟基粘康酸半醛）的形成。
9. 通过加入 20 μL 邻苯二酚 （50 mM）、960 μL 磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.5）和 20 μL 粗提取物来制备反应混合物。
10. 对于阴性对照，用磷酸盐缓冲液替换粗提取物，并将最终体积调节至1 mL。
11. 将反应混合物孵育30分钟。在设定的时间间隔内，测量375nm处的吸光度。吸光度的增加表明反应最终产物2-羟基粘康酸半醛（2-HMS）的形成。一式三份进行实验。
    注意:邻苯二酚对光敏感和对氧敏感。将反应混合物储存在黑暗中并紧紧关闭管，以防止儿茶酚的自然降解。

4. 纯培养物的基因组DNA分离

注意:这是分离基因组DNA的一般方案。在样品收集、处理和分析步骤中进行革兰氏染色。由于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞壁厚度变化，因此对细胞裂解方法进行了相应的修改。隔离时戴上手套，用70%乙醇消毒工作台，以避免核酸酶降解DNA。下面提到的一些化学物质会导致皮肤严重灼伤，在处理它们时必须格外小心。

1. 从革兰氏阴性细菌中分离基因组DNA³¹.
   1. 挑选单个菌落并在无菌试管中的新鲜生长培养基中接种。
   2. 将试管置于200rpm的培养箱振荡器中，并使细菌在30°C下生长过夜。
   3. 第二天，以12,400 x g 沉淀1.5 mL过夜生长的培养物3分钟。
   4. 除去上清液并将沉淀重悬于200μL裂解缓冲液（40mM乙酸三酯，pH 7.8,20mM乙酸钠，1mM EDTA，1%SDS）中。
   5. 加入 66 μL NaCl 溶液 （5 M） 并充分混合。
   6. 将所得混合物以12,400× g 沉淀10分钟（4°C）。
   7. 将透明上清液移液到新鲜的微量离心管中，并加入等体积的氯仿。
   8. 多次倒置混合溶液，直到观察到乳白色溶液。
   9. 以12,400× g 旋转3分钟，并将上清液转移到干净的小瓶中。
   10. 加入 1 mL 冰冷的 100% 乙醇;通过倒置混合，直到白色的DNA链沉淀出来。
   11. 在4°C下以2,200× g 离心沉淀的DNA10分钟，并弃去上清液。
   12. 用 1 mL 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，让 DNA 沉淀在室温下干燥 5 分钟。
   13. 干燥后，将沉淀重悬于100μL 1x Tris-EDTA（TE）缓冲液中，并将DNA储存在-20°C。
   14. 使用分光光度计测量浓度（A_260/280），并在琼脂糖凝胶（1%）上运行DNA，以评估DNA²⁴的质量。
2. 从革兰氏阳性菌株中分离基因组DNA³²
   1. 挑选单个菌落并在无菌试管中的新鲜生长培养基中接种。
   2. 将试管以200rpm的速度放入培养箱振荡器中，让细菌在合适的生长温度下生长过夜。
   3. 第二天，取 1.5 mL 生长的培养物并以 8,600 x g 离心 5 分钟。
   4. 取出上清液并将细胞重悬于TE缓冲液中。
   5. 用TE缓冲液调节OD₆₀₀ = 1.0，并将740μL细胞悬液转移到干净的微量离心管中。
   6. 加入 20 μL 溶菌酶（100 mg/mL 原液），并通过移液充分混合。在37°C孵育30分钟（在干浴中）。
   7. 加入 40 μL 10% SDS 并充分混合。
   8. 加入 8 μL 蛋白酶 K （10 毫克/毫升）。充分混合并在56°C下孵育1-3小时（在干浴中）。随着粘度的增加，悬浮液现在应该变得清晰，标志着有效的细胞裂解。
      注意:如果细胞未正确裂解，悬浮液可以放置过夜。
   9. 在65°C（在干浴中）预热CTAB / NaCl混合物，并将100μL该混合物加入细胞悬液中。混合均匀。
   10. 在65°C孵育10分钟（在干浴中）。
   11. 加入 500 μL 氯仿:异戊醇 （24:1） 并充分混合。在25°C下以16,900× g 旋转10分钟。
   12. 将水相转移到新鲜的微量离心管中，避免有机相（底部的粘性相）。
   13. 小心地加入 500 μL 苯酚:氯仿:异戊醇 （25:24:1） 并充分混合。在25°C下以16,900× g 旋转10分钟。
   14. 将水相放入新鲜的微量离心管中。加入 500 μL 氯仿:异戊醇 （24:1） 并充分混合。
   15. 转移水相并加入0.6体积的异丙醇（在-20°C下预冷）。
   16. 沉淀的DNA链必须以线状形式可见。在-20°C孵育2小时至过夜。
   17. 在4°C下以16,900× g 离心15分钟以沉淀DNA。
   18. 小心地倒出异丙醇，并用1mL冷的70%乙醇（在-20°C下预冷）洗涤沉淀以除去任何杂质。
   19. 在4°C下以16,900× g 离心5分钟。 弃去上清液。
   20. 让沉淀在室温下干燥20分钟或将管保持在37°C。 确保颗粒没有过度干燥。
   21. 重悬于100μL的1x TE缓冲液中，并将DNA储存在-20°C。
       注意:如果沉淀变得过度干燥并且难以重悬，请将微量离心管与DNA沉淀和无核酸酶的水在37°C孵育15-20分钟，然后通过移液再次重悬。
   22. 在1x TE缓冲液中进行1:100稀释后，使用分光光度计测量浓度（A_260/280），并在琼脂糖凝胶（1%）上运行DNA，以评估DNA²⁴的质量。

5. 16S rRNA测序

注意:下面概述的方案用于扩增和测序16S rRNA以进行细菌鉴定。从16S rRNA序列获得的信息用于鉴定未知生物并找到不同生物之间的相关性。

1. 为了鉴定菌株，使用针对细菌的16S rRNA序列的通用引物通过PCR扩增从纯细菌培养物中分离的DNA: 27F （5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R （5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）³³。
2. 在冰上用 18 μL 高压灭菌/无核酸酶水、2.5 μL 10x 缓冲液、0.5 μL 正向和反向引物（100 μM 储备液）、2 μL dNTP 混合物（100 μM 储备液）、1 μL DNA 模板 （2-15 ng/μL） 和 1 U U Taq 聚合酶制备 PCR 混合物（25 μL 反应）。
3. 使用以下循环条件进行16S rRNA基因扩增:在94°C下初始变性10分钟，（在94°C下最终变性40秒，引物在56°C下退火1分钟，在74°C下延伸2分钟）x 30个循环，最终在74°C下延伸10分钟。
4. 循环结束后，混合 5 μL 样品和 1 μL 5x DNA 上样染料。在 1% 琼脂糖凝胶上运行以验证扩增。将PCR产物短期储存在4°C或将其冷冻在-20°C直至进一步使用。
5. 对于 16S rRNA 基因测序，对于更高体积 （100 μL），设置与上述相同的反应。
6. 使用PCR产物纯化试剂盒纯化用于Sanger测序^24,34的扩增子^，或将整个样品与DNA上样染料混合并上样琼脂糖凝胶上以执行凝胶提取方法。
7. 测序完成后，将结果文件转换为 FASTA 格式，并使用 NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）³⁵ 上的基本局部比对搜索工具 （BLAST） 检查序列相似性。

结果

图1概述了从水生栖息地分离和筛选细菌以及随后通过16S rRNA分析鉴定细菌的整个过程的示意图。来自印度达德里湿地的水样被收集在无菌玻璃瓶中，并立即带到实验室进行处理。样品通过孔径为0.22 μm的滤片，滤纸与不同的培养基板保持接触。2小时后，除去滤纸，并将板在30°C下孵育过夜以形成菌落（图2）。第二天，选择单个细菌菌落并?...

讨论

众所周知，地球上只有大约1%的细菌可以在实验室中轻松培养⁶。即使在可培养的细菌中，许多细菌仍未被描述。分子方法的改进为细菌群落的分析和评估提供了新的维度。然而，这些技术确实有局限性，但它们不会使培养分析变得多余。分离单个细菌种类的纯培养技术仍然是表征生理特性的主要机制。土壤和水生栖息地蕴藏着许多具有新型酶和途径的细菌，这些细菌可用于生物?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718	Gel electrophoresis
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich	A9434	Growth medium component
Ammonium sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	Growth medium component
Bacto-Agar	Millipore	1016141000	Solid media preparation
Calcium chloride (CaCl2)	MERCK	C4901-500G	Growth medium component
Catechol	Sigma-Aldrich	135011	Hydrocarbon degradation assay
Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB	Sigma-Aldrich	H6269	Genomic DNA Isolation
Chloroform	HIMEDIA	MB109	Genomic DNA isolation
Disodium phosphate (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S5136	Growth medium component
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	gDNA buffer component
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20)	Sigma-Aldrich	215422	Growth medium component
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	Growth medium component
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Growth medium component; Glycerol stocks
Isopropanol	HIMEDIA	MB063	Genomic DNA isolation
LB Agar	Difco	244520	Growth medium
Luria-Bertani (LB)	Difco	244620	Growth medium
Magnesium sulphate (MgSO4)	MERCK	M2643	Growth medium component
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20)	Sigma-Aldrich	221287	Growth medium component
Nutrient Broth (NB)	Merck (Millipore)	03856-500G	Growth medium
Peptone	Merck	91249-500G	Growth medium component
Phenol	Sigma-Aldrich	P1037	Genomic DNA isolation
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786	Growth medium component
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Growth medium component
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	AM2546	Genomic DNA isolation
QIAquick Gel Extraction kit	QIAGEN	160016235	DNA purification
QIAquick PCR Purification kit	QIAGEN	163038783	DNA purification
R2A Agar	Millipore	1004160500	Growth medium
SmartSpec Plus Spectrophotometer	BIO-RAD	4006221	Absorbance measurement
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Genomic DNA isolation
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Growth medium component
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Genomic DNA isolation
Styrene	Sigma-Aldrich	S4972	Styrene biodegradation
Taq DNA Polymerase	NEB	M0273X	16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)	Sigma-Aldrich	93283	Resuspension of genomic DNA
Tryptic Soy Broth (TSB)	Merck	22092-500G	Growth medium
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG	Growth medium component
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20)	Sigma-Aldrich	221376	Growth medium component