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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen den Prozess der Isolierung, Vermehrung und Charakterisierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Das Protokoll beschreibt die Isolierung von Bakterien, die Identifizierung mit der 16S-rRNA-Methode und die Prüfung ihres Kohlenwasserstoffabbaupotenzials. Dieser Artikel würde Forschern helfen, die mikrobielle Biodiversität in Umweltproben zu charakterisieren und insbesondere nach Mikroben mit Bioremediationspotenzial zu suchen.

Zusammenfassung

Kohlenwasserstoff-Schadstoffe sind widerspenstig gegenüber dem Abbau und ihre Anreicherung in der Umwelt ist giftig für alle Lebensformen. Bakterien kodieren zahlreiche katalytische Enzyme und sind von Natur aus in der Lage, Kohlenwasserstoffe zu verstoffwechseln. Wissenschaftler nutzen die Artenvielfalt in aquatischen Ökosystemen, um Bakterien mit biologischem Abbau- und Bioremediationspotenzial zu isolieren. Solche Isolate aus der Umwelt bieten eine Vielzahl von Stoffwechselwegen und Enzymen, die weiter genutzt werden können, um den Abbauprozess im industriellen Maßstab zu skalieren. In diesem Artikel skizzieren wir den allgemeinen Prozess der Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten aus aquatischen Lebensräumen und untersuchen ihre Fähigkeit, Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle in vitro mit einfachen Techniken zu nutzen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung verschiedener Bakterienarten und deren anschließende Identifizierung mittels der 16S rRNA-Analyse. Das Protokoll enthält auch Schritte zur Charakterisierung des Kohlenwasserstoffabbaupotenzials von Bakterienisolaten. Dieses Protokoll wird für Forscher nützlich sein, die versuchen, Bakterienarten aus Umwelthabitaten für ihre biotechnologischen Anwendungen zu isolieren.

Einleitung

Kohlenwasserstoffe (HC) werden sowohl als Kraftstoffe als auch in chemischen Anwendungen in großem Umfang eingesetzt. Aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol und Xylol werden häufig als Lösungsmittel verwendet1. Alkene wie Ethylen und Propylen dienen als Vorläufer bei der Synthese von Polyethylen- bzw. Polypropylenpolymeren. Durch die Polymerisation eines anderen Kohlenwasserstoffs, Styrol, entsteht Polystyrol. Anthropogene Aktivitäten bringen Kohlenwasserstoffe während ihrer Produktion und ihres Transports in die Umwelt ein. Die Kontamination von Boden und Wasser durch Kohlenwasserstoffe ist für die Umwelt und die menschliche Gesundheit sehr besorgniserregend. Mikroben spielen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des Ökosystems, indem sie die biogeochemischen Kreisläufe regulieren und eine breite Palette von Substraten, zu denen auch Schadstoffe und Xenobiotika gehören, nutzen und sie in Kohlenstoff und Energiequelle umwandeln. Dieser Prozess der Entgiftung von Umweltschadstoffen durch Mikroorganismen wird als Bioremediation 3,4,5,6,7 bezeichnet.

Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Kohlenwasserstoffe abzubauen, kommen in aquatischen und bodenständigen Lebensräumen vor 8,9,10. Es wurden viele Bakterien identifiziert, die das Potenzial haben, Alkane und aromatische HCs abzubauen, wie z. B. Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter und Oleibacter11. Die Entwicklung technologisch fortschrittlicher kulturunabhängiger Ansätze hat dazu beigetragen, neuartige HC-abbauende mikrobielle Gemeinschaften zu entdecken12. Genomisches Material, das direkt aus Quellproben isoliert wurde, wird durch Hochdurchsatzmethoden wie Next Generation Sequencing (NGS) amplifiziert und sequenziert, gefolgt von einer Analyse, so dass keine Mikroorganismen kultiviert werden müssen. NGS-Methoden, wie z. B. die Metagenomanalyse, sind teuer und leiden unter Nachteilen im Zusammenhang mit dem Amplifikationsprozess13. Kultivierungstechniken wie die selektive Anreicherungskultur14, die auf die Isolierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Mikroben abzielen, sind nach wie vor nützlich, da sie es Forschern ermöglichen, Stoffwechselwege in Bakterienisolaten zu untersuchen und zu manipulieren.

Die genomische DNA-Isolierung und die anschließende Sequenzierung des genomischen Materials liefert wertvolle Informationen über jeden Organismus. Die Sequenzierung des gesamten Genoms hilft bei der Identifizierung von Genen, die für Antibiotikaresistenzen, potenzielle Wirkstoffziele, Virulenzfaktoren, Transporter, xenobiotische metabolisierende Enzyme usw. kodieren15,16,17. Die Sequenzierung des 16SrRNA-kodierenden Gens hat sich als robuste Technik zur Identifizierung der bakteriellen Phylogenie erwiesen. Die Konservierung der Gensequenz und -funktion über die Jahre macht es zu einem zuverlässigen Werkzeug, um unbekannte Bakterien zu identifizieren und ein Isolat mit der nächstgelegenen Art zu vergleichen. Darüber hinaus ist die Länge dieses Gens optimal für die bioinformatische Analyse18. All diese Eigenschaften, zusammen mit der einfachen Genamplifikation mit universellen Primern und der Verbesserung der Gensequenzierungstechnologie, machen es zu einem Goldstandard für die Identifizierung von Mikroben.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Rückgewinnung kultivierbarer Mikroorganismen mit HC-abbauendem Potenzial aus Umweltproben. Die im Folgenden beschriebene Methode beschreibt die Sammlung und Identifizierung von HC-abbauenden Bakterien und ist in fünf Abschnitte unterteilt: (1) Sammlung von Bakterien aus Wasserproben, (2) Isolierung von Reinkulturen, (3) Untersuchung der HC-abbauenden Fähigkeit von Bakterienisolaten, (4) genomische DNA-Isolierung und (5) Identifizierung auf der Grundlage von 16S rRNA-Gensequenzierung und BLAST-Analyse. Dieses Verfahren kann zur Isolierung von Bakterien für viele verschiedene biotechnologische Anwendungen angepasst werden.

Protokoll

1. Probenentnahme, -verarbeitung und -analyse

HINWEIS: Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Einige der Isolate können pathogen sein, tragen Sie daher Handschuhe und desinfizieren Sie den Arbeitsbereich vor und nach dem Gebrauch.

  1. Entnehmen Sie 500 ml Wasserprobe in fünf sterilen Glasflaschen an verschiedenen Stellen des Gewässers. Messen Sie den pH-Wert und die Temperatur jeder Probe mit einem pH-Messgerät bzw. einem Thermometer.
    HINWEIS: Das Protokoll ist nicht standortspezifisch und kann leicht angepasst werden, um Organismen auch aus kohlenwasserstoffkontaminierten Gewässern zu isolieren.
  2. Filtern Sie die Probe in einer Charge von 100 ml durch Filterschichten mit einer Porengröße von 0,22 μm unter aseptischen Bedingungen.
    HINWEIS: Der Durchmesser des Filterpapiers sollte den Durchmesser der Petrischale nicht überschreiten. Zum Beispiel ist Filterpapier mit einem Durchmesser von nicht mehr als 85 mm optimal für eine Petrischale von 100-120 mm.
  3. Bewahren Sie die Filterpapiere über verschiedenen Nährmedienplatten auf (PYE19, R2A20, M9, LB, NB, TSB, M6321 und M2G22). Die verschiedenen Arten von Wachstumsmedien ermöglichen die Selektion und Anreicherung verschiedener Mikroorganismen. Die Zusammensetzungen verschiedener Nährmedien sind in Tabelle 1 aufgeführt. Verwenden Sie ein Papier für jede Medienplatte und ziehen Sie es nach 2 Stunden mit einer sterilen Pinzette ab.
  4. Die ungefilterten Wasserproben (10bis 6 Verdünnungen) werden nacheinander in sterilem, doppelt destilliertem Wasser verdünnt, indem 100 μl der gesammelten Wasserprobe in 900 μl steriles Wasser gegeben werden. Daraus ergibt sich eine Verdünnung von 1:10. Aus dieser Probe werden 100 μl entnommen und 900 μl steriles Wasser hinzugefügt, um eine Verdünnung von 1:100 zu erhalten. Wiederholen Sie die Verdünnung, bis die Verdünnungsfaltung 1:1.000.000 beträgt. Durch Pipettieren mischen. Das Endvolumen jeder Verdünnung beträgt 1 ml.
  5. Verteilen Sie 100 μl der verdünnten Wasserprobe einzeln auf alle in Schritt 3 genannten Nährmittelplatten in dreifacher Ausfertigung.
  6. Inkubieren Sie die Platten bei 30 °C für 24 bis 48 Stunden, je nach Wachstum der Kolonien.
    HINWEIS: Die meisten Umweltisolate wachsen bei einer optimalen Temperatur von 30 °C. Wenn Sie die Proben aus einer Umgebung mit extremen Temperaturen isolieren, inkubieren Sie die Platten bei der gleichen Temperatur wie die der Entnahmestelle.
  7. Als nächstes pflücken Sie die Kolonien mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Pipettenspitze und führen Quadrantenstreifen durch, um isolierte Kolonien zu erhalten.
  8. Die Platten über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag screenen Sie die Kolonien anhand ihrer morphologischen Merkmale wie Farbe, Textur, Form, Größe, Rand, Höhe usw. Bestreifen Sie die Kolonien erneut, um Reinkulturen zu erhalten.
  9. Führen Sie eine Gram-Färbung jeder Reinkultur23 durch und fahren Sie mit der Glycerin-Stammvorbereitung fort.
  10. Zur Vorbereitung der Glycerinvorräte wird eine einzelne Kolonie in 3 ml geeigneter Wachstumsmedien geimpft und bei 30 °C inkubiert. Aus der Nachtkultur werden 700 μl entnommen und 300 μl 100%iges Glycerin (durch Autoklavieren sterilisiert) in Kryoröhrchen24 gegeben. Frieren Sie die Durchstechflaschen bei -80 °C ein, um sie langfristig zu lagern.

2. Abbau von Kohlenwasserstoffen

HINWEIS: Das folgende Beispiel dient dem Screening der Isolate, die Styrol abbauen können. Es handelt sich um eine geringfügige Modifikation der Methode, die in einem früheren Bericht25 angepasst wurde. Befolgen Sie die Schritte unter aseptischen Bedingungen.

  1. Wählen Sie aus einem frisch gestreiften Teller eine Kolonie aus und inokulieren Sie sie mit 5 ml tryptischer Sojabrühe (TSB)/Nährstoffbrühe (NB). Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 °C unter Schütteln bei 200 U/min, bis die Absorption ~2 erreicht.
    HINWEIS: Neben TSB/NB kann jedes Wachstumsmedium gewählt werden, in dem die Bakterien eine hohe Zelldichte erreichen.
  2. Am nächsten Tag werden die Zellen bei 2862 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert und der Überstand entsorgt.
  3. Das Pellet wird zweimal mit 2 ml autoklavierter Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) gewaschen und 5 Minuten lang bei 2862 x g bei 4 °C geschleudert.
    HINWEIS: Kochsalzlösung ist isotonisch und hält daher den osmotischen Druck in den Bakterienzellen aufrecht.
  4. Resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml flüssigem, kohlenstofffreiem Basalmedium (LCFBM). Messen Sie die Extinktion (OD600).
  5. Nehmen Sie zwei sterile Erlenmeyerkolben mit 150 ml Fassungsvermögen zur Kontrolle und die Versuchsgruppe. Beschriften Sie sie als A und B.
  6. In der nicht inokulierten Kontrollgruppe (Kolben A) werden 40 ml LCFBM und Styrol (5 mM) zugegeben.
  7. In Kolben B werden 35 ml LCFBM und Styrol zugegeben (die Endkonzentration des Styrols wird auf 5 mM eingestellt). Die Zellsuspension mit einem endgültigen ODvon 600 Zellen ≈ 0,1 zugeben und das verbleibende Volumen mit LCFBM bis zu 40 ml auffüllen. Die Kolben werden 30 Tage lang bei 30 °C unter Schütteln bei 200 U/min inkubiert.
    HINWEIS: Kohlenwasserstoffe im Übermaß können für die Mikroben giftig sein, daher beginnen Sie mit einer niedrigen Konzentration und erhöhen Sie sie allmählich.
  8. Wiederholen Sie den obigen Vorgang für jeden weiteren Stamm, der auf Kohlenwasserstoffabbau untersucht werden muss.
  9. Messen Sie den OD600 jedes Kolbens alle 5 Tage und zeichnen Sie eine Wachstumskurve auf. Erhöhen Sie die Inkubationszeit auf bis zu 45 Tage, wenn die Bakterien Styrol verwerten können. Ein Anstieg von OD600 deutet darauf hin, dass das Bakterium Styrol verstoffwechseln kann.

3. Screening des Catechol-Abbaus durch Bakterienisolate

ANMERKUNG: Beim Abbau von aromatischen Kohlenwasserstoffen wie Styrol, Benzol, Xylol, Naphthalin, Phenolen usw. entstehen Catechole als Reaktionszwischenprodukte. Die Catechole werden von Bakterien mit Hilfe von Catechol-1,2-Dioxygenase- und Catechol-2,3-Dioxygenase-Enzymen über die ortho- bzw. Meta-Spaltungswege weiter metabolisiert26. Diese Enzyme sind auch am Abbau anderer Kohlenwasserstoffe wie Chlorbenzol27 beteiligt. Das unten erwähnte Protokoll verwendet Ganzzelllysat für den Catechol-2-3-Dioxygenase-Enzym-Assay28. Die gleiche Lysemethode kann verwendet werden, um die Aktivität der Catechol-1,2-Dioxygenase zu screenen. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches variiert jedoch. Beide Enzyme sind von Natur aus induzierbar und können durch die Zugabe von Phenol zu den Wachstumsmedien induziert werden.

  1. Mit Hilfe einer sterilen Schleife wird die Bakterienkolonie von einer frisch gestreiften Platte in Mineralsalzmedium (MSM) geimpft, das mit 1-4 mM Phenol angereichert ist. Die Kultur wird bei 30 °C und 200 U/min inkubiert. Ernten Sie die Kultur bei 4 °C, wenn OD 600 zwischen 1,4 und 1,6 erreicht (d. h. in der späten exponentiellen Phase), indem Sie 20 Minuten lang bei4500 x g schleudern.
  2. Waschen Sie das Zellpellet mit Phosphatpuffer (0,5 M, pH 7,5).
  3. Resuspendieren Sie die Zellen im oben genannten Phosphatpuffer und stellen Sie den endgültigen OD600 ≈ 1,0 ein.
  4. Die Zellen werden durch gepulste Beschallung für 1,5 Minuten lysiert, wobei die Dauer jedes Impulses 15 s beträgt. Nach diesem Schritt muss die Suspension klar oder weniger trüb sein. Ist dies nicht der Fall, erhöhen Sie die Anzahl der Impulse und prüfen Sie, ob die Aufhängung frei ist. Bewahren Sie die Probe nach jedem Impuls auf Eis auf, um einen Proteinabbau zu vermeiden.
  5. Die Zelltrümmer und ungebrochenen Zellen werden durch Zentrifugation bei 9.000 x g für 30 Minuten unter Beibehaltung der kalten Temperatur (4 °C) entfernt.
  6. Pipettieren Sie den klaren Überstand vorsichtig. Diese Fraktion enthält den Rohextrakt für den Enzym-Assay.
  7. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Rohextrakts entweder nach der Bradford- oder nach der Lowry-Methode29,30.
  8. Um die Aktivität der Catechol-2,3-Dioxygenase zu bestimmen, wird die Bildung des Reaktionsendprodukts (2-Hydroxymucon-Semialdehyd) mit einem Spektralphotometer gemessen.
  9. Die Reaktionsmischung wird durch Zugabe von 20 μl Catechol (50 mM), 960 μl Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) und 20 μl des Rohextrakts hergestellt.
  10. Für die Negativkontrolle wird der Rohextrakt durch Phosphatpuffer ersetzt und das Endvolumen auf 1 ml eingestellt.
  11. Die Reaktionsmischung wird 30 min lang inkubiert. In festgelegten Zeitintervallen wird die Absorption bei 375 nm gemessen. Eine Erhöhung der Absorption deutet auf die Bildung des Reaktionsendprodukts 2-Hydroxymuconsäure-Semialdehyd (2-HMS) hin. Führen Sie das Experiment in dreifacher Ausführung durch.
    HINWEIS: Catechol ist lichtempfindlich und sauerstoffempfindlich. Lagern Sie das Reaktionsgemisch im Dunkeln und verschließen Sie die Röhrchen fest, um den natürlichen Abbau von Catechol zu verhindern.

4. Genomische DNA-Isolierung der Reinkultur

HINWEIS: Dies ist das allgemeine Protokoll für die Isolierung genomischer DNA. Die Gram-Färbung wurde während der Probenentnahme, -verarbeitung und -analyse durchgeführt. Aufgrund der Variation der Zellwanddicke von grampositiven und gramnegativen Bakterien wird die Zelllysemethode entsprechend modifiziert. Tragen Sie während der Isolierung Handschuhe und desinfizieren Sie die Werkbank mit 70%igem Ethanol, um zu vermeiden, dass die Nukleasen die DNA abbauen. Einige der unten genannten Chemikalien können schwere Verbrennungen auf der Haut verursachen und müssen beim Umgang mit ihnen mit der gebotenen Vorsicht behandelt werden.

  1. Isolierung genomischer DNA aus gramnegativen Bakterien31.
    1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und inokulieren Sie sie in einem frischen Nährmedium in sterilen Reagenzgläsern.
    2. Stellen Sie die Röhrchen bei 200 U/min in einen Inkubatorschüttler und lassen Sie die Bakterien über Nacht bei 30 °C wachsen.
    3. Am nächsten Tag 1,5 ml über Nacht gewachsene Kultur bei 12.400 x g für 3 Minuten pelletieren.
    4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl Lysepuffer (40 mM Trisacetat, pH 7,8, 20 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, 1 % SDS).
    5. 66 μl NaCl-Lösung (5 m) zugeben und gut mischen.
    6. Die resultierende Mischung wird bei 12.400 x g für 10 min (4 °C) pelletiert.
    7. Pipettieren Sie den klaren Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen Chloroform hinzu.
    8. Mischen Sie die Lösung mehrmals, bis eine milchige Lösung beobachtet wird.
    9. Bei 12.400 x g 3 min schleudern und den Überstand in ein sauberes Fläschchen überführen.
    10. Fügen Sie 1 ml eiskaltes 100%iges Ethanol hinzu; durch Inversion mischen, bis weiße DNA-Stränge ausfallen.
    11. Die gefällte DNA wird bei 2.200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
    12. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol und lassen Sie das DNA-Pellet 5 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen.
    13. Nach dem Trocknen wird das Pellet in 100 μl 1x Tris-EDTA(TE)-Puffer resuspendiert und die DNA bei -20 °C gelagert.
    14. Messen Sie die Konzentration (A260/280) mit einem Spektralphotometer und lassen Sie die DNA auf Agarose-Gel (1%) laufen, um die Qualität von DNA24 zu beurteilen.
  2. Isolierung genomischer DNA aus grampositivem Stamm32
    1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und impfen Sie sie in frischem Nährmedium in sterilen Reagenzgläsern.
    2. Legen Sie die Röhrchen mit 200 U/min in einen Inkubatorschüttler und lassen Sie die Bakterien über Nacht bei einer geeigneten Wachstumstemperatur wachsen.
    3. Am nächsten Tag werden 1,5 ml der gewachsenen Kultur entnommen und 5 Minuten lang bei 8.600 x g zentrifugiert.
    4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen im TE-Puffer.
    5. Stellen Sie den OD600 = 1,0 mit TE-Puffer ein und überführen Sie 740 μl der Zellsuspension in ein sauberes Mikrofugenröhrchen.
    6. Fügen Sie 20 μl Lysozym (100 mg/ml Brühe) hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren gut. Bei 37 °C für 30 min (im Trockenbad) inkubieren.
    7. Fügen Sie 40 μl 10% SDS hinzu und mischen Sie es gut.
    8. Fügen Sie 8 μl Proteinase K (10 mg/ml) hinzu. Gut mischen und bei 56 °C 1-3 h (im Trockenbad) inkubieren. Die Suspension sollte nun mit erhöhter Viskosität deutlich werden, was eine effiziente Zelllyse kennzeichnet.
      HINWEIS: Die Suspension kann über Nacht belassen werden, wenn die Zellen nicht richtig lysiert werden.
    9. Das CTAB/NaCl-Gemisch wird auf 65 °C (in einem trockenen Bad) vorgewärmt und 100 μl dieser Mischung zur Zellsuspension gegeben. Gut mischen.
    10. Bei 65 °C für 10 min (im Trockenbad) inkubieren.
    11. 500 μl Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) zugeben und gut vermischen. Bei 16.900 x g 10 min bei 25 °C schleudern.
    12. Die wässrige Phase in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführen und dabei die organische Phase (viskose Phase am Boden) vermeiden.
    13. 500 μl Phenol:Chloroform:isoamylalkohol (25:24:1) vorsichtig zugeben und gut mischen. Bei 16.900 x g 10 min bei 25 °C schleudern.
    14. Nehmen Sie die wässrige Phase in einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen. 500 μl Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) zugeben und gut vermischen.
    15. Die wässrige Phase wird überführt und 0,6 Vol.-Isopropanol (vorgekühlt auf -20 °C) zugegeben.
    16. Die präzipitierten DNA-Stränge müssen in fadenförmiger Form sichtbar sein. Bei -20 °C für 2 h bis über Nacht inkubieren.
    17. Bei 16.900 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren, um die DNA zu pelletieren.
    18. Dekantieren Sie das Isopropanol vorsichtig und waschen Sie das Pellet mit 1 ml kaltem 70%igem Ethanol (vorgekühlt auf -20 °C), um alle Verunreinigungen zu entfernen.
    19. Bei 16.900 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
    20. Lassen Sie das Pellet 20 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen oder bewahren Sie das Röhrchen bei 37 °C auf. Achten Sie darauf, dass das Pellet nicht übertrocknet ist.
    21. Resuspendieren Sie die DNA in 100 μl 1x TE-Puffer und lagern Sie die DNA bei -20 °C.
      HINWEIS: Wenn das Pellet übertrocknet und schwer resuspendiert werden kann, inkubieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit DNA-Pellet und nukleasefreiem Wasser bei 37 °C für 15-20 Minuten und resuspendieren Sie es erneut durch Pipettieren.
    22. Messen Sie die Konzentration (A260/280) mit einem Spektralphotometer nach einer Verdünnung von 1:100 in 1x TE-Puffer und lassen Sie die DNA auf Agarose-Gel (1%) laufen, um die Qualität von DNA24 zu beurteilen.

5. 16S rRNA-Sequenzierung

HINWEIS: Das unten beschriebene Protokoll gilt für die Amplifikation und Sequenzierung von 16S rRNA zur Identifizierung von Bakterien. Informationen, die aus der 16S-rRNA-Sequenz abgeleitet werden, werden verwendet, um einen unbekannten Organismus zu identifizieren und die Verwandtschaft zwischen verschiedenen Organismen zu finden.

  1. Um die Stämme zu identifizieren, wird die aus den reinen Bakterienkulturen isolierte DNA mittels PCR mit universellen Primern amplifiziert, die auf die 16S-rRNA-Sequenz für Bakterien abzielen: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') und 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
  2. Bereiten Sie die PCR-Mischung (25-μl-Reaktionen) auf Eis mit 18 μl autoklaviertem/nukleasefreiem Wasser, 2,5 μl 10-fachem Puffer, 0,5 μl Vorwärts- und Rückwärtsprimern (100 μM-Stamm), 2 μl dNTPs-Mischung (100 μM-Stamm), 1 μl DNA-Template (2-15 ng/μl) und 1 U Taq-Polymerase vor.
  3. Verwenden Sie die folgenden Zyklusbedingungen für die 16S rRNA-Genamplifikation: Anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 10 min, (abschließende Denaturierung bei 94 °C für 40 s, Primer-Annealing bei 56 °C für 1 min, Verlängerung bei 74 °C für 2 min) x 30 Zyklen, endgültige Denaturierung bei 74 °C für 10 min.
  4. Mischen Sie nach Beendigung des Zyklus 5 μl Probe und 1 μl 5x DNA-Beladungsfarbstoff. Tragen Sie 1%iges Agarose-Gel auf, um die Amplifikation zu überprüfen. Lagern Sie die PCR-Produkte kurzzeitig bei 4 °C oder frieren Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei -20°C ein.
  5. Richten Sie für die 16S-rRNA-Gensequenzierung die gleiche Reaktion wie oben beschrieben für ein höheres Volumen (100 μl) ein.
  6. Reinigen Sie die Amplikons für die Sanger-Sequenzierung24,34 mit einem PCR-Produktreinigungskit oder mischen Sie die gesamte Probe mit DNA-Ladefarbstoff und laden Sie ein Agarose-Gel, um die Gelextraktionsmethode durchzuführen.
  7. Sobald die Sequenzierung abgeschlossen ist, konvertieren Sie die Ergebnisdatei in das FASTA-Format und überprüfen Sie die Sequenzähnlichkeit mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) auf NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt schematisch das gesamte Verfahren zur Isolierung und zum Screening von Bakterien aus aquatischen Lebensräumen und deren anschließende Identifizierung durch 16S rRNA-Analyse. Wasserproben aus einem Feuchtgebiet in Dadri, Indien, wurden in sterilen Glasflaschen gesammelt und sofort zur Verarbeitung ins Labor gebracht. Die Proben wurden durch Filterschichten mit einer Porengröße von 0,22 μm geleitet, und die Filterpapiere wurden in Kontakt mit verschiede...

Diskussion

Es ist allgemein bekannt, dass nur etwa 1 % der Bakterien auf der Erde ohne weiteres im Labor kultiviert werdenkönnen 6. Selbst unter den kultivierbaren Bakterien bleiben viele uncharakterisiert. Verbesserungen in molekularen Methoden haben der Analyse und Bewertung von Bakteriengemeinschaften eine neue Dimension verliehen. Solche Techniken haben jedoch ihre Grenzen, aber sie machen die Kulturanalysen nicht überflüssig. Reinkulturtechniken zur Isolierung einzelner Bakterienarten sind nach wie v...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Karthik Krishnan und den Mitgliedern des RP-Labors für ihre hilfreichen Kommentare und Anregungen. DS wird durch das SNU-Doctoral Fellowship und das Earthwatch Institute India Fellowship unterstützt. Das RP-Labor wird durch ein CSIR-EMR-Stipendium und Start-up-Mittel der Shiv Nadar University unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA4718Gel electrophoresis
Ammonium chloride (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434Growth medium component
Ammonium sulphateSigma-AldrichA4418Growth medium component
Bacto-AgarMillipore1016141000Solid media preparation
Calcium chloride (CaCl2)MERCKC4901-500GGrowth medium component
CatecholSigma-Aldrich135011Hydrocarbon degradation assay
Cetyltrimethylammonium bromide, CTABSigma-AldrichH6269Genomic DNA Isolation
ChloroformHIMEDIAMB109Genomic DNA isolation
Disodium phosphate (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136Growth medium component
EDTASigma-AldrichE9884gDNA buffer component
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422Growth medium component
GlucoseSigma-AldrichG7021Growth medium component
GlycerolSigma-AldrichG5516Growth medium component; Glycerol stocks
IsopropanolHIMEDIAMB063Genomic DNA isolation
LB AgarDifco244520Growth medium
Luria-Bertani (LB)Difco244620Growth medium
Magnesium sulphate (MgSO4)MERCKM2643Growth medium component
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20)Sigma-Aldrich221287Growth medium component
Nutrient Broth (NB)Merck (Millipore)03856-500GGrowth medium
PeptoneMerck91249-500GGrowth medium component
PhenolSigma-AldrichP1037Genomic DNA isolation
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786Growth medium component
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Growth medium component
Proteinase KThermoFisher ScientificAM2546Genomic DNA isolation
QIAquick Gel Extraction kitQIAGEN160016235DNA purification
QIAquick PCR Purification kitQIAGEN163038783DNA purification
R2A AgarMillipore1004160500Growth medium
SmartSpec Plus SpectrophotometerBIO-RAD4006221Absorbance measurement
Sodium acetateSigma-AldrichS2889Genomic DNA isolation
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888Growth medium component
Sodium dodecyl sulphate (SDS)Sigma-AldrichL3771Genomic DNA isolation
StyreneSigma-AldrichS4972Styrene biodegradation
Taq DNA PolymeraseNEBM0273X16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283Resuspension of genomic DNA
Tryptic Soy Broth (TSB)Merck22092-500GGrowth medium
Yeast extractSigma-AldrichY1625-1KGGrowth medium component
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich221376Growth medium component

Referenzen

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