维持 双斑蝽螈的实验室培养物，这是一种用于昆虫农业和无脊椎动物生理学的多功能正翅目动物模型

摘要

本文概述了标准化重要因素的基本方法，例如密度，饲料可用性，水合作用来源和环境控制，用于长期饲养可食用蟋蟀 Grylus bimaculatus的实验室培养物。

摘要

Gryllus bimaculatus （De Geer）是一种大型蟋蟀，分布在非洲和欧亚大陆南部，在那里它经常被野生收获作为人类食物。在其原生范围之外，由于其膳食可塑性，快速繁殖周期，缺乏隔膜要求，对高密度饲养的耐受性以及对病原体的鲁棒性，培养 G. bimaculatus 是可行的。因此， G. bimaculatus 可以成为昆虫生理学，行为学，胚胎学或遗传学研究的多功能模型。

养殖参数，如放养密度、笼内避风、光周期、温度、相对湿度和饮食，都会影响蟋蟀的生长、行为和基因表达，应予以标准化。在关于供人类消费的农业昆虫的新兴文献中，这些蟋蟀经常被用来评估来自作物残茬，食品加工副产品和其他低成本废物流的候选饲料混合物。

为了支持正在进行的评估 双斑蝽 生长性能和营养质量以响应可变饲料基质的实验，开发了一套全面的标准方案，用于实验室中的育种，保养，处理，测量和安乐死，并在此处介绍。行业标准的蟋蟀饲料已被证明营养充足，功能上适合长期维持蟋蟀种畜，以及用作实验性对照饲料。在12光（L）/ 12暗（D）光^周期下， 在屏顶29.3升聚乙烯笼中，以0.005只蟋蟀/厘米3的密度饲养这些蟋蟀，平均温度为27°C，湿润的椰子椰壳既可作为水合源，又能作为产卵培养基，在2年的时间里成功地维持了健康的蟋蟀。按照这些方法，蟋蟀在对照实验中收获时的平均质量为0.724克，收获时的平均质量为0.190克，在放养（22天）和收获（65天）之间有89%的存活率和68.2%的性成熟度。

引言

以标志性昆虫果蝇 黑腹果蝇 为代表，使用昆虫作为实验室模式生物为遗传学，毒理学和生理学研究提供了明显的优势¹。昆虫的小尺寸减少了培养所需的空间以及所需的饲料和消耗材料的数量。许多昆虫繁殖迅速，使它们特别适合创建专门的遗传系和需要评估多个连续世代的研究。

许多研究集中在果 蝇等全代谢昆虫上，它们表现出完全的和化蛹。但是，还有其他型号可用，包括 Grillus bimaculatus （De Geer），双斑田蟋蟀。 G. bimaculatus 是一种保尿代谢性昆虫，在达到性成熟²之前经历7至11个若虫龄。这种蟋蟀表现出与性选择相关的各种行为，包括步跖，领土展示和配偶守卫³。未成熟的蟋蟀与全代谢昆虫物种的幼虫不同，因为它们与许多保隆代谢幼虫相似，能够在蜕皮期间再生失去和受损的肢体⁴。此外， G. bimaculatus 的完全测序基因组于2021^{年发表 5}.这些特征使这些蟋蟀作为基础研究的目标具有吸引力。

双斑田蟋蟀被广泛饲养，用于人类食物和动物饲料。这些手术的规模通常比实验室研究的规模大得多^6，7。尽管规模不同，但研究人员面临的挑战与商业板球养殖者面临的挑战有很大重叠。这些考虑因素集中在基于实验室的研究的背景下，旨在改善食用昆虫的生产。随着食用昆虫产业的不断发展壮大，优化饲料投入和生产的其他方面是一个主要目标⁸。实验室研究表明，这些蟋蟀的饲养效率，存活率或生成时间都有所提高，这有可能有助于提高蟋蟀养殖业务的长期盈利能力。

标准化的饲养方案可以在研究饲养优化的研究之间进行更密切的比较。迄今为止，在实验室中饲养G. bimaculatus的深入方案很少发表。理想的协议将反映现实世界中板球养殖作业中遇到的条件，同时保持严格控制的条件，以准确测量实验处理引起的生长性能变化，并突出风险缓解策略。本文中描述的方法是基于已发表的协议，技术和设备开发的，用于在广泛的实验室和商业生产规模^2，9，^10，11，12中饲养各种蟋蟀物种。这些方法也得到了几个非同行评审来源的信息，包括未发表的技术公告和与北美商业板球农民的个人交流。该方案的开发旨在促进建立专门用于昆虫农业相关试验的双斑蚴实验室培养物。

研究方案

1. 制备产卵底物

注意:椰子椰壳纤维是 双斑蝽的理想产卵底物。有关如何将椰壳纤维与压缩椰壳体砖分离的详细方法以及有关呼吸安全的注意事项，请参阅 补充材料 步骤1.1。

1. 用肥皂和水洗手。
2. 将一个干净的容器放在天平上，称量一团大约相当于人类拳头大小的干椰子椰壳。
3. 将椰壳纤维放入可密封、干净的容器中，该容器可容纳高达原始体积6倍的膨胀。
4. 用干净的手，轻轻地从从较大块中取出的那块上轻轻地分解一团的椰壳纤维。
5. 使用 50 mL 量筒，测量正确体积的去离子 （DI） 水，以达到 5:1 的质量比，即五份水与一份干椰壳纤维的质量比。
6. 缓慢加入测得的去离子水，均匀地补充水分。手动浸渍团块，以确保均匀保湿。
7. 重新去皮之前称重椰壳的容器。
8. 称出75克湿槐壳纤维。
9. 使用干净的塑料勺将75克润湿的椰壳纤维转移到100 mm x 15 mm培养皿中，以确保椰壳均匀地分布在培养皿的底部并且没有结块。
10. 用实验室胶带在培养皿的侧面贴上标签，标明出生菌落和卵子收集事件的日期。
11. 在量筒中测量额外的 45 mL 去离子水。
12. 在培养皿中包装的椰壳纤维表面上均匀地加水，以确保均匀的水合作用。确保椰壳纤维饱和到水在容器侧面的大约1/4处。
13. 一旦培养皿被包装好，将剩余的润湿椰壳膜密封在密闭容器中，以便在-20°C下储存。
    注意:按照本文规定的方法， 双斑蚴 个体将在产卵后平均58天后达到性成熟。
14. 收集卵子
    1. 将水合产卵基质放入包含所需蟋蟀亲本的笼子中，尽可能远离饲料，因为蟋蟀有可能机械地将饲料颗粒转移到产卵基质上。
    2. 记录日期和时间。
       注意:按照这些方法饲养的生殖蟋蟀菌落的标准化工作密度为n = 150个成年个体。在该密度下，24小时的产卵窗口将产生800至1，500个卵，具体取决于菌落年龄，先前的产卵努力和亲本笼子性别比。
    3. 在工作台面上放置一个可高温高压灭菌的小垃圾容器，以考虑处理和清洁富含鸡蛋的产卵基材所带来的密封风险。
    4. 在垃圾容器旁边的工作台上放置一个干净的空29.3 L塑料笼，作为富含鸡蛋的产卵基质的接收笼。
    5. 将装有母蟋蟀和产卵基质的29.3升笼子放在空笼子的垃圾容器的另一侧。
    6. 24小时后，从母蟋蟀笼中取出产卵基质，并将其定位在可高压灭菌的废物容器上。
    7. 检查产卵基材的顶部是否有蟋蟀可能踢到椰壳表面的任何碎屑或饲料颗粒。
       注意:任何物质，不是蛋块或椰壳纤维，都可能导致在孵化期间在基质上形成霉菌。
    8. 用干净的勺子或塑料勺将椰壳纤维污染物清除到废物容器中。
    9. 将塑料勺放入废物容器中。
    10. 将清洁的产卵基材放入干净的29.3L笼中。
    11. 将笼子置于培养箱中，在12小时D / 12小时L光周期上设置为27°C，相对湿度为60%。
    12. 将装有种畜的笼子放回原始位置，并从工作台面上清除所有物品。
    13. 将废物容器放入设施内的冰箱中，专用于储存可能被蟋蟀蛋污染的物品。
    14. 用10%漂白剂溶液消毒工作表面，并静置60秒。
    15. 用干净的纸巾擦干工作表面。打开冰箱，将纸巾丢弃在废物容器中。
15. 每天喷洒和监测鸡蛋基质
    注意:有关用于校准喷雾瓶输送的雾量的方法，请参阅 补充材料 步骤1.2。
    1. 将喷雾瓶放在产卵基材上，使表达的水均匀地分布在基材表面上。
    2. 连续 11 天，每天对每个产卵基材执行 补充材料 步骤 1.2 中计算的泵致动次数。
    3. 每天检查每个产卵基质，监测椰壳纤维表面的丝状霉菌生长。
    4. 如果观察到真菌生长，请使用干净的勺子或勺子去除表面霉菌斑点。
    5. 将工具和去除的椰壳在设施冰箱中储存的可高温高压灭菌废物容器中处理。
       注意:目前尚不清楚霉菌是否会对板球的发展产生不利影响。
    6. 在产卵后的第11天，开始仔细观察幼年蟋蟀的基质。
       注意:在27°C时， 双斑 蚴的卵需要11-13天才能孵化。
16. 设置产卵笼
    1. 选择两个未使用的 30.8 厘米 x 30.8 厘米（12 英寸 x 12 英寸）商业鸡蛋纸盒。用美工刀或强力剪刀将它们切成六个单独的10.1厘米（4英寸）宽，尺寸相等的条带。用手刷掉切边，去除纸板上悬垂的颗粒。
    2. 将六个单独的10.1厘米x 30.8厘米（4英寸x 12英寸）纸箱垂直放入笼子的底部，纸箱的较长轴跨越29.3升笼的较窄水平轴。将第七块纸箱平放在六个直立件的顶部。
    3. 选择三条粗糙的棕色纸巾，约25厘米x 25厘米。将各折成两半。放置两个，使它们覆盖纸箱结构的近端的顶部。将一个放在远端的纸箱堆上。
    4. 产卵后第11天，将产卵底物移动到笼子的近端右上角。
17. 照顾早龄儿童
    注意:在产卵后的第14天，大多数有活力的卵将孵化，早期阶段的蟋蟀若虫将需要饲料和水。年轻的蟋蟀无法打破水滴的表面张力，如果水聚集在环境中，可能会淹死。然而，它们对干燥也很敏感。在这个发育阶段提供约60%的一致相对湿度对于确保生存非常重要。
    1. 当观察到舱口时，在步骤1.4.3中将放置在纸箱顶部的纸巾雾化，直到它们被弄湿但不主动脱落水。
    2. 用70%乙醇彻底擦拭100毫米培养皿盖的两侧，并使其干燥。将其用作输送蟋蟀饲料的容器。
       注意:在随后的发育阶段，一龄蟋蟀需要比蟋蟀更小的饲料颗粒。这种更精细的饲料应该在出苗后的前20天给予蟋蟀。
    3. 将50克饲料舀入60瓦单份搅拌机中，以10，000rpm碾磨1分钟。
    4. 测量1克饲料并将其摇到笼子里的培养皿盖上。使用勺子或勺子的干净端，将食物尽可能均匀地摊开在盘子的底部。
    5. 每 2 天更换一次饲料。在取出蟋蟀之前，用勺子的末端从饲料盘上刷出蟋蟀。将旧饲料丢弃在可高温高压灭菌的废物容器中。
    6. 监测饲料上的霉菌生长。如果饲料开始出现白色或绿色，丢弃培养皿并立即喂食。
    7. 产卵后14天，使用2.54厘米（1英寸）的画笔将所有蟋蟀从椰壳表面和培养皿侧面刷入笼子中，以去除附着在出生椰壳纤维基质上的蟋蟀。
    8. 将去除的产卵基质放入可高温高压灭菌的废物容器中，并将其储存在冰箱中直至高压灭菌。
    9. 用按照步骤1.1.5-1.1.9制备的新鲜椰壳纤维皿代替出生基质以进行水合作用。
    10. 使用DI水洗瓶加水，直到椰壳纤维表面闪闪发光但不聚集。
        注意:蟋蟀密度强烈影响 G. bimaculatus¹³的生长性能。将种畜保持在过高的密度可能会将不需要的拥挤诱导的表观遗传效应引入使用其后代的实验中⁹.蟋蟀必须从产卵基质中出现的高密度中"变薄"，并分布成符合0.005蟋蟀/ cm³ 空间标准的密度。

2. 照顾三龄至成人

1. 设置笼子
   注:有关构建屏蔽盖的技术的详细信息，请参阅 补充材料 步骤 1.3.1。
   1. 重复步骤 1.4.1。
   2. 在笼子的远端安装五个切好的鸡蛋盒，使鸡蛋形状的凹面朝外。确保短端围绕笼子的两侧，长端平坦地靠底部，每块纸箱之间有大约3厘米的空间。
   3. 将最后切割的纸箱件放在直立纸箱件的顶部，例如房屋的屋顶，如 补充图S1所示。
   4. 按照步骤1.1.8-1.1.13准备水合底物。
   5. 将水合底物放在蟋蟀笼的近端右角，如 补充图S2所示。
   6. 使用清洗瓶加入6-10 mL去离子水，直到椰壳膜表面出现湿润和反光，但椰壳纤维没有完全浸没。
      注意:表面应呈轻微凹陷，表面张力使水沿着椰壳纤维的轮廓。
   7. 倒置100毫米培养皿的盖子，并将其放在笼子的近端左侧。加入2-3克标准蟋蟀饲料 ，如补充图S2所示。
2. 修改菌落密度
   注意:在孵化后20天或蟋蟀达到0.01克的平均质量时进行此步骤。
   1. 在工作台面上，放置一个大容器，可容纳三个并排站立的29.3升保持架的平面图。
      注意:这是次要收容，将控制在从一个殖民地转移到另一个殖民地时逃脱的蟋蟀。
   2. 从饲养架上取下原始菌落并将其放在工作台面上。
   3. 在原始殖民地的右侧，放置一个相同大小的空笼子。
   4. 在空笼子的右侧，放置一个按照步骤2.1.1-2.1.7设置的笼子。
   5. 检查以确保蟋蟀没有附着在装有蟋蟀的笼子的屏蔽盖的底部。如果观察到，点击笼子的顶部以将其移开。
   6. 打开装有蟋蟀的笼子的屏蔽盖。
   7. 在一个轻柔，平稳的运动中，将"屋顶"纸箱和所有粘附在其轮廓上的蟋蟀转移到中间笼子中。
   8. 一旦纸箱进入中间笼子，轻轻搅拌纸板靠在侧面，以清除所有蟋蟀。
   9. 目视检查所有蟋蟀是否都已自由摇晃，然后将纸箱件放回原产地笼子的近端，以使剩余的蟋蟀粘附在纸箱上。
   10. 重复步骤2.2.8-2.2.9，将所有纸箱放在笼子里，从原笼子的前面到后面依次工作，直到所有蟋蟀都转移到中间笼子里。
   11. 轻轻倾斜装有蟋蟀的中间笼子，使所有蟋蟀都指向底角。
   12. 将装有蟋蟀的笼子抬过接收笼子。
   13. 慢慢地倾斜供体笼，使蟋蟀开始在侧面获得购买，并且可以以受控的方式从底部角落的质量中移出，如 补充图S3所示。
   14. 如果蟋蟀前进得太快，调整中间笼子保持的角度，使蟋蟀后退。
   15. 当笼子倾斜时，使用2.54厘米（1英寸）的画笔将蟋蟀引导到接收笼中，计数每个，直到总数等于150个个体。使用刷子来阻止那些前进得太快的人，以便准确计数。
   16. 在新放养的蟋蟀笼上标有日期，亲本和所含的蟋蟀数量。
   17. 通过将整个容器放入-20°C的冰箱中至少30分钟，对仍在中间和原始容器底部的多余蟋蟀进行人道安乐死。
   18. 检查原产地的笼子，以确保所有蟋蟀都已转移。
   19. 将蟋蟀笼放置在植物生长架上，在灯罩下方25厘米处，该遮光罩包含全光谱荧光灯，设置为住宅级户外计时器，该计时器编程以保持12小时的L / D光周期。参见 补充图 S4。
   20. 将所有碎屑、用过的水化基质和饲料、纸巾、外泄物和产地笼子中剩余的死蟋蟀转移到可高温高压灭菌的废物容器中。
   21. 除非立即对废物进行高压灭菌，否则请将其储存在-20°C的设施内冷冻室中。
   22. 检查地板、工人服装、二级安全壳笼和工作台面上是否有逃生的蟋蟀。
   23. 用10%漂白剂溶液对工作台面和二级密封笼进行消毒，将纸巾丢弃到可高温高压灭菌的废物容器中。
3. 喂食和浇水
   1. 打开密闭饲料储存容器，用蟋蟀饲料填充空的100 mL样品杯。伸手进入每个菌落，将杯中四分之一的饲料放入保存饲料的培养皿盖中。
   2. 要给蟋蟀浇水，请按照步骤1.1.9-1.1.13准备椰壳纤维培养皿。
   3. 提高与消耗率相称的进料速率，以确保 随意 进料的可用性。
      注意:蟋蟀饲料需求在整个开发过程中不断变化。
4. 将蟋蟀转移到清洁笼子里
   1. 每2周将蟋蟀转移到清洁笼子中。复制步骤 2.2.1-2.2.4 中保持架的排列
      注意:大量的碎屑将积聚在鸡蛋盒的凹陷中。
   2. 按照步骤2.2.5-2.2.23将蟋蟀转移到清洁笼子中。
   3. 轻轻地操纵纸箱，使大部分碎屑落入原产地的笼子里，同时让蟋蟀在重复步骤2.2.7-2.2.10时附着在纸箱上。
   4. 用刷子或塑料勺子鼓励任何被困在裂缝中的蟋蟀从中间笼子移动到干净的笼子里。
   5. 检查原产地的笼子，以确保所有蟋蟀都已转移。
   6. 将所有碎屑、用过的水化基质和饲料、纸巾、外泄物和产地笼子中剩余的死蟋蟀转移到可高温高压灭菌的废物容器中。
   7. 除非立即对废物进行高压灭菌，否则请将其储存在-20°C的设施内冷冻室中。
   8. 检查地板、工人服装、二级安全壳笼和工作台面上是否有逃生的蟋蟀。
   9. 用10%漂白剂溶液对工作台面和二级隔离笼进行消毒，将纸巾丢弃在可高温高压灭菌的废物容器中。
5. 设置实验笼
   注意:实验笼是塑料容器，可容纳较少的蟋蟀。它们的设置与包含种畜的29.3升网箱相同，但依赖于7.1升容器，这些容器放养着较小的水皿，饲料，并且包含减少的鸡蛋盒表面积。
   1. 将六个10.1厘米x 15.4厘米（4英寸x 6英寸）的纸箱片放入每个实验笼的远端，纸箱的长轴跨越笼子的窄尺寸宽度，纸箱的短轴朝向盖子和地板。
   2. 将10克水合椰壳纤维工作混合物包装到培养皿中。
   3. 使用装有去离子水的洗涤瓶加入约15毫升去离子水，或直到椰壳膜表面形成半月板。
   4. 倒置60 mm x 15 mm培养皿的盖子以容纳饲料。
      注意:在整个试验期间，喂养率可能会有所不同。关于实验性笼蟋蟀随机化和放养程序，见 补充材料 步骤1.4。
6. 终止昆虫
   1. 当不再需要蟋蟀用于繁殖或实验用途时，请按照步骤2.2.17进行操作。
   2. 当蟋蟀死了，从冰箱里取出笼子。取下盖子，将所有包含的材料转移到可高温高压灭菌的废物容器中。将废物转移回冰箱，直到高压灭菌。
   3. 将空笼浸入10%漂白剂溶液中，并使其静置至少5分钟。
   4. 用冷自来水对空笼进行三重冲洗，以去除漂白残留物，并特别注意容器底部的通道。

结果

在2021年9月的饲料试验中收集了证明从孵化到65天龄的蟋蟀成功饲养的数据。按照这些方案的步骤1.1.1-2.6.1，从卵中生长蟋蟀，在6个重复的笼子里放养24只随机的22天大（三龄）蟋蟀，遵循上述步骤2.7。然后，在环境室条件下饲养蟋蟀;然而，由于设施空气处理装置故障，在20%相对湿度下，平均室温为25±1°C，而不是建议的27°C。 在孵化后22至65天之间每周测量两次蟋蟀质量。该实验的结果概述如下，?...

讨论

这种蟋蟀饲养方法的简单性可以使一系列研究领域受益，并代表了成功的蟋蟀饲养的通用模板，可轻松适应各种实验需求。与其他几项关于 双斑 蚴的研究相比，个体身体的成年体型较小，成熟度较慢¹⁴，我们将其归因于环境强加给我们的次优饲养温度。上述方法已在2年的时间里得到使用和改进。在商业蟋蟀养殖中有时观察到问题的证据，包括具有经典临床体征的病原体?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid	HOMZ	3430CLBL	Used to house breeding stock
3-tier/12-tray Grow Light Stand	Fischer Scientific	NC1938548
50-gal (189.27L) tote bin with lid	Sterilite	#14796603	Used as secondary containment when handling crickets
50 mL polypropylene graduated cylinder	Fischer Scientific	S95171
7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid	HOMZ	3410CLBL	Used to house exprimental stock
Accuris 500 g x 0.01 g Balance	Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific	W3300-500	Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+"
Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush	Ace Hardware	#1803261
Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle	Fischer Scientific	03-421-160
Bright aluminum window screen	Phifer	UNSPSC# 11162108	Mesh size 18 x 16"
Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids	Wal-Mart	N/A
Deionized water
Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade	Home Depot	#313114935
Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12"	Uline	S-5189
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm	Fischer Scientific	FB0875714
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm	Fischer Scientific	FB0875713A
Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels	Home Depot	#205675843
Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks	Infinity Bond	Infinity IM-Tough-Guy-12
Mazuri Cricket Diet	Land O' Lakes International	SKU#  3002219-105
Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer	Wal-Mart	N/A
Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block	Home Depot	#300679904