שמירה על תרביות מעבדה של Gryllus bimaculatus, מודל אורתופטרני רב-תכליתי לחקלאות חרקים ופיזיולוגיה של חסרי חוליות

Summary

מאמר זה מתאר שיטות בסיסיות לתקנון גורמים חשובים כגון צפיפות, זמינות הזנה, מקור הידרציה ובקרות סביבתיות לגידול ארוך טווח של תרביות מעבדה של הקריקט האכיל, Gryllus bimaculatus.

Abstract

גרילוס בימקולטוס (שם מדעי: Gryllus bimaculatus ) הוא מין של קריקט גדול גוף המופץ ברחבי אפריקה ודרום אירואסיה, שם הוא נקטף לעתים קרובות בטבע כמזון אנושי. מחוץ לטווח הטבעי שלו, culturing G. bimaculatus הוא אפשרי בשל הפלסטיות התזונתית שלו, מחזור הרבייה המהיר, חוסר הדרישה לדיאפאוזה, הסבילות לגידול בצפיפות גבוהה וחוסן מפני פתוגנים. לפיכך, G. bimaculatus יכול להיות מודל רב-תכליתי למחקרים של פיזיולוגיה של חרקים, התנהגות, אמבריולוגיה או גנטיקה.

פרמטרים תרבותיים, כגון צפיפות גרב, רפוגיה בתוך הכלוב, פוטופריוד, טמפרטורה, לחות יחסית ותזונה, כולם משפיעים על צמיחת הקריקט, ההתנהגות וביטוי הגנים ויש לתקנם אותם. בספרות המתפתחת על גידול חרקים למאכל אדם, צרצרים אלה משמשים לעתים קרובות כדי להעריך תערובות מזון מועמדות שמקורן בשאריות יבול, תוצרי לוואי של עיבוד מזון וזרמי פסולת אחרים בעלות נמוכה.

כדי לתמוך בניסויים מתמשכים המעריכים את ביצועי הצמיחה של G. bimaculatus ואת האיכות התזונתית בתגובה למצעי הזנה משתנים, פותחה מערכת מקיפה של פרוטוקולים סטנדרטיים לרבייה, תחזוקה, טיפול, מדידה והמתת חסד במעבדה. הזנת קריקט סטנדרטית בתעשייה הוכיחה את עצמה כראויה מבחינה תזונתית ומתאימה מבחינה תפקודית לתחזוקה ארוכת טווח של מלאי גידול קריקט, כמו גם לשימוש כמזין בקרה ניסיוני. גידול צרצרים אלה בצפיפות של 0.005 צרצרים/ס"מ³ בכלובי פוליאתילן 29.3 ליטר בטמפרטורה ממוצעת של 27 מעלות צלזיוס על פוטופריוד 12 בהיר (L)/12 כהה (D), עם קור קוקוס לח המשמש הן כמקור הידרציה והן כמדיום oviposition, שמר בהצלחה על צרצרים בריאים לאורך טווח של שנתיים. בעקבות שיטות אלה, צרצרים בניסוי מבוקר הניבו מסה ממוצעת של 0.724 גרם 0.190 גרם בקציר, עם 89% ניצולים ו-68.2% התבגרות מינית בין מלאי (22 יום) לקציר (65 ימים).

Introduction

כפי שאפיין את החרק האייקוני, זבוב הפירות Drosophila melanogaster, השימוש בחרקים כאורגניזמים מודל מעבדה מספק יתרונות מובהקים למחקרים בגנטיקה, טוקסיקולוגיה ופיזיולוגיה¹. גודלם הקטן של החרקים מקטין את השטח הדרוש לתרביות ואת כמות המזון והחומרים המתכלים הנדרשים. חרקים רבים מתרבים במהירות והופכים אותם למתאימים באופן ייחודי ליצירת קווים גנטיים מיוחדים ומחקרים הדורשים הערכה של דורות עוקבים מרובים.

מחקרים רבים מתמקדים בחרקים הולומטבוליים כמו דרוזופילה, שמפגינים מטמורפוזה מלאה וגורים. עם זאת, דגמים אחרים זמינים, כולל Gryllus bimaculatus (דה גיר), קריקט השדה בעל שני המקומות. G. bimaculatus הוא חרק פטרומטבולי שעובר בין 7 ל -11 אינסטארים נימפאליים לפני שהוא מגיע לבגרות מינית². קריקט זה מציג מגוון רחב של התנהגויות הקשורות לברירה מינית, כולל צעידה, תצוגות טריטוריאליות ושמירה על בני זוג³. צרצרים לא בוגרים אינם דומים לזחלים של מיני חרקים הולומטבוליים בכך שהם, בדומה לצעירים רבים של paurometabolous, מסוגלים לחדש גפיים אבודות ופגומות במהלך אקדיסיס⁴. בנוסף, הגנום המרוצף במלואו של G. bimaculatus פורסם בשנת 2021⁵. מאפיינים אלה הופכים את הצרצרים הללו למושכים כמטרה למחקר בסיסי.

צרצרי שדה דו-נקודתיים מגודלים באופן נרחב למאכל אדם ולמזון לבעלי חיים. היקף הפעולות הללו הוא לעתים קרובות הרבה יותר גדול מאשר עבור מחקר מעבדה ^6,7. למרות ההבדל בקנה המידה, האתגרים העומדים בפני החוקרים חופפים מאוד לאלה שנתקלים בהם חקלאי קריקט מסחריים. שיקולים אלה מתכנסים בהקשר של מחקר מבוסס מעבדה שמטרתו לשפר את ייצור החרקים האכילים. ככל שתעשיית החרקים האכילים ממשיכה להתפתח ולצמוח, אופטימיזציה של תשומות מזון ואינספור היבטים אחרים של הייצור היא המטרה העיקרית⁸. למחקרי מעבדה המוכיחים שיפורים מדודים ביעילות הגידול, בשורדים או בזמן הייצור של צרצרים אלה יש פוטנציאל לסייע בהגדלת הרווחיות של פעולות גידול הקריקט בטווח הארוך.

פרוטוקולי גידול סטנדרטיים מאפשרים השוואה מדוקדקת יותר בין מחקרים שבחנו אופטימיזציה של גידול. עד כה פורסמו מעט פרוטוקולים מעמיקים לגידול G. bimaculatus במעבדה. פרוטוקול אידיאלי ישקף את התנאים שבהם נתקלים בפעולות חקלאיות קריקט בעולם האמיתי, תוך שמירה על התנאים המבוקרים בקפידה הדרושים למדידה מדויקת של שינויים בביצועי הצמיחה הנובעים מטיפולים ניסיוניים והדגשת אסטרטגיות להפחתת סיכונים. השיטות המתוארות במאמר זה פותחו על סמך פרוטוקולים, טכניקות ומכשירים שפורסמו ששימשו לגידול מגוון מיני קריקט במגוון רחב של קני מידה של ייצור מעבדתי ומסחרי 2,9,10,11,12. שיטות אלה מבוססות גם על מספר מקורות שאינם עוברים ביקורת עמיתים, כולל עלונים טכניים שלא פורסמו ותקשורת אישית עם חקלאי קריקט מסחריים בצפון אמריקה. פרוטוקול זה פותח מתוך כוונה להקל על הקמת תרביות מעבדה של G. bimaculatus במיוחד לשימוש בניסויים הקשורים לחקלאות חרקים.

Protocol

1. הכנת מצע ההטיה

הערה: קויר קוקוס הוא מצע אוביפוזיציה אידיאלי עבור G. bimaculatus. לשיטות מפורטות כיצד להפריד בין coir מלבני coir דחוסות ולהערה על בטיחות הנשימה, ראה חומרים משלימים שלב 1.1.

1. לשטוף ידיים עם מים וסבון.
2. טארקו מיכל נקי על איזון ושקלו מסה של קוקוס יבש בגודל של אגרוף אנושי בערך.
3. מכניסים את הקויר למיכל אטום ונקי, שיכול להכיל הרחבה של עד פי 6 מהנפח המקורי.
4. בידיים נקיות, מפרקים בעדינות גושים של קור מהחתיכה שהוסרה מהגוש הגדול יותר.
5. באמצעות גליל מדורג של 50 מ"ל, מדוד את הנפח הנכון של מים שעברו דה-יוניזציה (DI) כדי להשיג יחס של 5:1 לפי מסה של חמישה חלקים מים לחלק אחד של קויר יבש.
6. הוסיפו את מי ה-DI הנמדדים באיטיות, והוסיפו לחות שווה לכל חלקיקי הקויר. תקעו גושים באופן ידני כדי להבטיח הידרציה אחידה.
7. מחדש את המיכל שבו שוקלים בעבר את הקויר.
8. שוקלים 75 גרם של קואר רטוב.
9. מעבירים 75 גרם של הקויר הרטוב לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ על 15 מ"מ באמצעות כף פלסטיק נקייה כדי להבטיח שהקואר מפוזר באופן שווה סביב תחתית המנה ושאין גושים.
10. תייג את הצד של צלחת הפטרי בנייר דבק עם תווית המציינת את מושבת הלידה ואת תאריך אירוע איסוף הביצים.
11. יש למדוד 45 מ"ל נוספים של מי DI בצילינדר מדורג.
12. הוסיפו מים באופן שווה על פני השטח של הקויר הארוז בצלחת הפטרי כדי להבטיח הידרציה אחידה. יש לוודא כי הקויר רווי עד כדי כך שהמים אוגרים כ-1/4 מהדרך במעלה דפנות המיכל.
13. לאחר שארזו את צלחת הפטרי, אטמו את הקויר הרטוב שנותר בכלי אטום לאחסון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: בעקבות השיטות שנקבעו על ידי מאמר זה, G. bimaculatus אנשים יגיעו לבגרות מינית לאחר ממוצע של 58 ימים לאחר oviposition.
14. איסוף ביצים
    1. מקם את מצע הצרצרים המיובש בכלובים המכילים את המלאי ההורי הרצוי של צרצרים רחוק ככל האפשר מההזנה בשל הפוטנציאל של צרצרים להעביר באופן מכני גרגירי מזון על מצע ההזנה.
    2. תעד את התאריך והשעה.
       הערה: צפיפות העבודה הסטנדרטית עבור מושבות קריקט רבייתיות שגודלו בשיטות אלה היא n = 150 פרטים בוגרים. בצפיפות זו, חלון אוביפוזיציה של 24 שעות יניב בין 800 ל-1,500 ביצים, בהתאם לגיל המושבה, למאמץ ההטלה הקודם וליחס המין של כלוב האב.
    3. הניחו על משטח העבודה כלי קיבול פסולת קטן הניתן לאוטוקלאבים כדי לקחת בחשבון את סיכון ההכלה הנשקף על ידי טיפול וניקוי של מצעי oviposition עשירים בביצים.
    4. מניחים כלוב פלסטיק נקי וריק בנפח 29.3 ליטר על הספסל ליד כלי הקיבול לאשפה כדי לשמש ככלוב המקבל של מצע הביצים העשיר בביצים.
    5. הניחו את כלוב ה-29.3 ליטר המכיל את מלאי הקריקט ההורי ואת מצע ה-oviposition בצד הנגדי של כלי קיבול האשפה מהכלוב הריק.
    6. לאחר השעה 24 שעות, הסירו את מצע הקריקט מכלוב הקריקט האב ואתרו אותו מעל כלי פסולת אוטוקלאבי.
    7. בדקו את החלק העליון של מצע ה-oviposition עבור חלקיקים כלשהם של frass או הזנה שייתכן שהצרצרים בעטו על פני השטח של הקויר.
       הערה: כל חומר, שאינו מסת ביצה או קויר, יכול לגרום להיווצר עובש על המצע במהלך הדגירה.
    8. מוציאים מזהמי קואר לתוך כלי הפסולת בעזרת כף מדידה נקייה או כף פלסטיק.
    9. מכניסים את כף הפלסטיק לכלי הקיבול של הפסולת.
    10. מניחים את מצע האוביפוזיציה המנוקה בכלוב הנקי בנפח 29.3 ליטר.
    11. מניחים את הכלוב באינקובטור שנקבע ל-27 מעלות צלזיוס בלחות יחסית של 60% על פוטופריוד D/12 h L של 12 שעות.
    12. החזירו את הכלוב המכיל את מלאי הרבייה למיקום המקורי ונקו את כל הפריטים ממשטח העבודה.
    13. הכניסו את כלי הקיבול לפסולת במקפיא במתקן המוקדש לאחסון פריטים שעלולים להיות מזוהמים בביצי קריקט.
    14. לחטא את משטח העבודה עם תמיסת אקונומיקה של 10% ולתת לו לשבת במשך 60 שניות.
    15. נגבו את משטח העבודה יבש במגבת נייר נקייה. פתחו את המקפיא והשליכו את מגבת הנייר לכלי הקיבול לפסולת.
15. ערפול וניטור מצעי ביצים מדי יום
    הערה: לשיטות המשמשות לכיול נפח הערפל המועבר על-ידי בקבוק תרסיס, ראה חומרים משלימים שלב 1.2.
    1. מקם בקבוק תרסיס מעל מצע ההטלה כך שהמים המבוטאים יתפזרו באופן שווה על פני השטח של המצע.
    2. בצע את מספר מפעילי המשאבה המחושבים בשלב החומרים המשלימים 1.2 עבור כל מצע oviposition מדי יום במשך 11 ימים רצופים.
    3. בדוק כל מצע oviposition מדי יום, ניטור עבור צמיחת עובש נימה על פני השטח של coir.
    4. אם נצפתה צמיחה פטרייתית, השתמשו בכפית נקייה או בסקופולה כדי להסיר כתמים של עובש על פני השטח.
    5. השליכו את הכלי ואת הקויר שהוסר במיכל הפסולת האוטוקלבי המאוחסן במקפיא המתקן.
       הערה: לא ברור אם התבנית משפיעה לרעה על התפתחות הקריקט.
    6. ביום ה-11 שלאחר ההדחה, התחילו להתבונן מקרוב במצע של צרצרים צעירים.
       הערה: ב 27 °C (74 °F), הביצים של G. bimaculatus דורשים 11-13 ימים כדי לבקוע.
16. הקמת כלובי לידה
    1. בחר שני קרטוני ביצים מסחריים בגודל 30.8 ס"מ על 30.8 ס"מ (12 אינץ' x 12 אינץ') שאינם בשימוש. בעזרת סכין שירות או גזירה חזקה, חתכו אותם לשש רצועות נפרדות ברוחב 10.1 ס"מ (4 אינץ') בגודל שווה. מברישים את הקצוות החתוכים בידיים כדי להסיר חלקיקים משתלשלים של קרטון.
    2. מניחים את ששת חלקי הקרטון הנפרדים בגודל 10.1 ס"מ על 30.8 ס"מ (4 אינץ' x 12 אינץ') אנכית לתוך החלק התחתון של הכלוב כאשר הציר הארוך יותר של הקרטון משתרע על הציר האופקי הצר יותר של כלוב 29.3 ליטר. הניחו חתיכת קרטון שביעית שטוחה על פני החלק העליון של ששת החלקים הזקופים.
    3. בחר שלוש חתיכות של מגבת נייר חומה מחוספסת בערך 25 ס"מ x 25 ס"מ. מקפלים כל אחד לשניים. מניחים שניים כך שהם מכסים את החלק העליון של הצד הפרוקסימלי של מבנה הקרטון. מניחים אחד מעל ערימת הקרטונים בצד הדיסטלי.
    4. ביום ה-11 שלאחר ההטלה, הזיזו את מצע ה-oviposition לפינה הימנית הפרוקסימלית של הכלוב.
17. טיפול בכוכבים מוקדמים
    הערה: ביום ה-14 שלאחר ההטלה, רוב הביצים הקיימות יבקעו ונימפות קריקט בשלב מוקדם ידרשו מזון ומים. צרצרים צעירים אינם מסוגלים לשבור את מתח הפנים של טיפות מים ויכולים לטבוע אם מים נאגרים בסביבתם. עם זאת, הם גם רגישים לייבוש. מתן לחות יחסית עקבית של כ-60% בשלב זה של התפתחות חשוב להבטחת ההישרדות.
    1. כאשר מתבוננים בפתח, מערפלים את מגבות הנייר המונחות מעל החלק העליון של הקרטונים בשלב 1.4.3 עד שהם נרטבים אך לא שופכים מים באופן פעיל.
    2. נגבו היטב את שני צידי מכסה צלחת פטרי 100 מ"מ עם 70% אתנול והניחו לו להתייבש. השתמש בו ככלי הקיבול שבו יימסר הזנת קריקט.
       הערה: צרצרים של כוכב ראשון דורשים חלקיקי הזנה קטנים יותר מאשר צרצרים בשלבי ההתפתחות הבאים. הזנה עדינה זו צריכה להינתן לצרצרים במשך 20 הימים הראשונים שלאחר הופעתם.
    3. מכניסים 50 גרם מההזנה לתוך בלנדר 60 וואט במנה אחת וטחינה ב-10,000 סל"ד למשך דקה אחת.
    4. יש למדוד 1 גרם מההזנה ולנער אותה על מכסה צלחת הפטרי בכלוב. בעזרת הקצה הנקי של כף או כף מדידה, פזרו את ההזנה בצורה אחידה ככל האפשר על תחתית המנה.
    5. החלף את ההזנה כל יומיים. יש להשתמש בקצה הכף כדי להבריש צרצרים מצלחת ההזנה לפני הסרתה. השליכו את ההזנה הישנה במיכל הפסולת הניתן להפרדה אוטומטית.
    6. עקוב אחר צמיחת עובש בהזנה. אם ההזנה מתחילה להיראות לבנה או ירקרקה, השליכו את צלחת הפטרי והאכילו מיד.
    7. לאחר 14 יום, השתמשו במכחול באורך 2.54 ס"מ (1 אינץ') כדי להסיר צרצרים הנצמדים למצע הקויר המולד על ידי הברשה של כל הצרצרים ממשטח הקויר והצדדים של צלחת הפטרי לתוך הכלוב.
    8. מניחים את מצע הפסולת שהוסר לתוך כלי הקיבול של הפסולת האוטוקלבית ומאחסנים אותו במקפיא עד לאוטו-אקלים.
    9. החליפו את מצע הלידה בצלחת קויר טרייה להכנת הידרציה בשלבים 1.1.5-1.1.1.9.
    10. השתמשו בבקבוק שטיפת מים DI כדי להוסיף מים עד שפני השטח של הקויר מנצנצים אך אינם מתמזגים.
        הערה: צפיפות קריקט משפיעה מאוד על ביצועי הצמיחה ב- G. bimaculatus¹³. שמירה על מלאי הרבייה בצפיפות מופרזת עלולה להכניס השפעות אפיגנטיות לא רצויות הנגרמות על ידי צפיפות לניסויים שבהם נעשה שימוש בצאצאיהם⁹. יש "לדלל" את הצרצרים מהצפיפויות הגבוהות העולות ממצעי האוביפוזיציה ולהתפזר לצפיפויות העומדות בתקן של 0.005 צרצרים/ס"מ³ של שטח.

2. טיפול בכוכבים משלושה עד מבוגרים

1. הקמת כלובים
   הערה: לפרטים על הטכניקה לבניית המכסה המוקרן, ראה חומרים משלימים שלב 1.3.1.
   1. חזור על שלב 1.4.1.
   2. התקינו חמש חתיכות קרטון ביצים חתוכות בקצה הדיסטלי של הכלוב, כך שהקעורות בצורת ביצה פונות החוצה. יש לוודא שהקצוות הקצרים נמצאים בערך בצידי הכלוב, שהצד הארוך יושב שטוח על הקרקעית, ויש כ-3 ס"מ של רווח בין כל פיסת קרטון.
   3. הניחו את פיסת הקרטון החתוכה האחרונה על גבי חלקי הקרטון הזקופים, כגון הגג על הבית, כפי שמוצג באיור משלים S1.
   4. בצע את השלבים 1.1.8-1.1.13 כדי להכין את מצעי ההידרציה.
   5. הניחו את מצע ההידרציה בפינה הימנית הפרוקסימלית של כלוב הקריקט כפי שמוצג באיור משלים S2.
   6. השתמשו בבקבוק שטיפה כדי להוסיף 6-10 מ"ל של מי DI עד שמשטח הקויר נראה רטוב ורפלקטיבי, אך הקויר אינו שקוע במלואו.
      הערה: פני השטח צריכים להיראות גומות קלות, כאשר מתח פני השטח גורם למים לעקוב אחר קווי המתאר של הקויר.
   7. הפכו את המכסה של צלחת פטרי 100 מ"מ והניחו אותה על הצד השמאלי הפרוקסימלי של הכלוב. הוסף 2-3 גרם של הזנת קריקט סטנדרטית כפי שמוצג באיור משלים S2.
2. שינוי צפיפות המושבה
   הערה: בצע שלב זה במשך 20 יום לאחר הבקיעה או כאשר הצרצרים מגיעים למסה ממוצעת של 0.01 גרם.
   1. על משטח העבודה, הניחו מיכל גדול שיכול להכיל את תוכנית הרצפה של שלושה כלובים בנפח 29.3 ליטר העומדים זה לצד זה.
      הערה: זוהי הכלה משנית ותשלוט בצרצרים הבורחים במהלך העברתם ממושבה אחת לאחרת.
   2. הסר את המושבה המקורית ממתלה הגידול והנח אותה על משטח העבודה.
   3. בצד ימין של המושבה המקורית, הניחו כלוב ריק באותו גודל.
   4. בצד ימין של הכלוב הריק, הניחו כלוב שהוקם לפי מדרגות 2.1.1-2.1.7.
   5. בדוק כדי לוודא שהצרצרים אינם נצמדים לחלק התחתון של המכסה המוקרן של הכלוב המכיל את הצרצרים. אם נצפתה, הקש על החלק העליון של הכלוב כדי לעקור אותם.
   6. פתחו את המכסה המוקרן של הכלוב המכיל את הצרצרים.
   7. בתנועה אחת עדינה וחלקה, מעבירים את קרטון "הגג" ואת כל הצרצרים הנצמדים לקווי המתאר שלו לתוך הכלוב האמצעי.
   8. ברגע שהקרטון נמצא בתוך הכלוב האמצעי, התסיסו בעדינות את הקרטון על הצדדים כדי לעקור את כל הצרצרים.
   9. בדיקה חזותית שכל הצרצרים היטלטלו חופשי לפני שהם מחזירים את פיסת הקרטון לצד הפרוקסימלי של כלוב המקור כדי לאפשר לצרצרים הנותרים להיצמד לקרטון.
   10. חזור על שלבים 2.2.8-2.2.9 עם כל חתיכות הקרטון בכלוב, עובד ברצף מקדימה לחלק האחורי של הכלוב המקורי עד שכל הצרצרים הועברו לכלוב האמצעי.
   11. הטה בעדינות את הכלוב האמצעי המכיל את הצרצרים כך שכל הצרצרים הכלולים מופנים לעבר הפינה התחתונה.
   12. הרימו את הכלוב המכיל את הצרצרים מעל כלוב הנמען.
   13. הטה באיטיות את כלוב התורם כך שהצרצרים יתחילו להשיג רכישה בצדדים ויוכלו לנוע באופן מבוקר אל מחוץ למסה בפינה התחתונה כפי שמוצג באיור משלים S3.
   14. אם הצרצרים מתקדמים מהר מדי, התאימו את הזווית שבה מוחזק הכלוב האמצעי, מה שגורם לצרצרים ליפול לאחור.
   15. בזמן שהכלוב מוטה, השתמשו במברשת באורך 2.54 ס"מ (1 אינץ') כדי לכוון את הצרצרים לכלוב המקבל, וספרו כל אחד מהם עד שהספירה הכוללת תהיה שווה ל-150 פרטים. השתמשו במברשת כדי להרתיע את אלה שמתקדמים מהר מדי לספירה מדויקת.
   16. תייג את כלוב הקריקט החדש עם תאריך, מלאי הורי ומספר הצרצרים הכלולים.
   17. המתת חסד הומני של עודפי צרצרים שעדיין נמצאים בתחתית המכלים האמצעיים והמקוריים על ידי הכנסת המיכל כולו למקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
   18. בדוק את כלוב המקור כדי לוודא שכל הצרצרים הועברו.
   19. מקם את כלובי הקריקט על מדפי גידול צמחים 25 ס"מ מתחת למכסי אדים בהירים המכילים אורות פלורסנט בספקטרום מלא המוגדרים לטיימר חיצוני ברמה ביתית המתוכנת לשמור על פוטופריוד L/D של 12 שעות. ראה איור משלים S4.
   20. מעבירים את כל הצריפים, הכלים של מצע הידרציה ומזון מנוצלים, מגבת נייר, אקסוביה וצרצרים מתים שנותרו בכלוב המקור לתוך כלי קיבול הפסולת הניתן לאוטוקלאבים.
   21. אלא אם כן יש לאחסן את הפסולת באופן מיידי, אחסנו אותה במקפיא במתקן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
   22. בדקו את הרצפה, את בגדי העובדים, את כלוב ההכלה המשני ואת משטח העבודה לאיתור צרצרים נמלטים.
   23. יש לחטא את משטח העבודה ואת כלוב ההכלה המשני בעזרת תמיסת אקונומיקה של 10%, ולהשליך את מגבות הנייר לכלי הקיבול של הפסולת האוטוקלבית.
3. האכלה והשקיה
   1. פתחו את מיכל אחסון ההזנה האטום ומלאו ריקה של 100 מ"ל עם הזנת קריקט. הושיטו יד לכל מושבה והפקידו רבע מהמזון המוחזק בכוס למכסה צלחת פטרי המחזיק את ההזנה.
   2. כדי להשקות צרצרים, הכינו צלחת פטרי של קויר בעקבות שלבים 1.1.9-1.1.13.
   3. הגדל את קצב ההזנה בהתאם לשיעור הצריכה כדי להבטיח זמינות של הזנת ad libitum .
      הערה: הביקוש לפיד קריקט משתנה במהלך הפיתוח.
4. העברת צרצרים לכלובים נקיים
   1. מעבירים את הצרצרים לכלובים נקיים כל שבועיים. שכפלו את סידור הכלובים משלבים 2.2.1-2.2.4
      הערה: כמויות משמעותיות של פראס יצטברו בקעורים של קרטוני הביצים.
   2. העברת צרצרים לכלובים נקיים, לאחר שלבים 2.2.5-2.2.23.
   3. תמרן בעדינות את הקרטונים כך שרוב הצרצרים ייפלו לתוך כלוב המקור תוך מתן אפשרות לצרצרים להיאחז בקרטון במהלך חזרה על צעדים 2.2.7-2.2.10.
   4. השתמשו במברשת או בכף פלסטיק כדי לעודד את כל הצרצרים הלכודים בפרשה לעבור מהכלוב האמצעי לכלוב נקי.
   5. בדוק את כלוב המקור כדי לוודא שכל הצרצרים הועברו.
   6. מעבירים את כל הצריפים, הכלים של מצע הידרציה ומזון מנוצלים, מגבת נייר, אקסוביה וצרצרים מתים שנותרו בכלוב המקור לתוך כלי קיבול הפסולת הניתן לאוטוקלאבים.
   7. אלא אם כן יש לאחסן את הפסולת באופן מיידי, אחסנו אותה במקפיא במתקן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
   8. בדקו את הרצפה, את בגדי העובדים, את כלוב ההכלה המשני ואת משטח העבודה לאיתור צרצרים נמלטים.
   9. יש לחטא את משטח העבודה ואת כלוב ההכלה המשני עם תמיסת אקונומיקה של 10%, ולהשליך מגבות נייר בכלי קיבול לפסולת אוטוקלאבית.
5. הקמת כלובים ניסיוניים
   הערה: כלובי ניסוי הם מיכלי פלסטיק המאכלסים פחות צרצרים. המערך שלהם זהה לכלובים של 29.3 ליטר המכילים מלאי רבייה אך מסתמכים על מיכלים של 7.1 ליטר המצוידים בכלים קטנים יותר של מים, מזון ומכילים שטח פנים מופחת של קרטון ביצים.
   1. מניחים שישה חתיכות קרטון בגודל 10.1 ס"מ על 15.4 ס"מ (4 אינץ' x 6 אינץ') לתוך הקצה הדיסטלי של כל כלוב ניסיוני כאשר הצירים הארוכים של הקרטונים משתרעים על פני רוחב הממד הצר של הכלוב והצירים הקצרים של הקרטונים המכוונים לכיוון המכסה והרצפה.
   2. ארזו 10 גרם מתערובת העבודה של הקויר הלח לתוך צלחת פטרי.
   3. השתמשו בבקבוק שטיפה המכיל מי DI כדי להוסיף כ-15 מ"ל של מי DI, או עד שנוצר מניסקוס על פני השטח של הקויר.
   4. הפוך את המכסה של צלחת פטרי 60 מ"מ x 15 מ"מ כדי להחזיק את ההזנה.
      הערה: קצב ההזנה עשוי להשתנות לאורך כל תקופת הניסוי. להליך האקראיות והגרב של קריקט הכלוב הניסיוני, ראו חומרים משלימים שלב 1.4.
6. הפסקת חרקים
   1. כאשר הצרצרים אינם נחוצים עוד לרבייה או לשימוש ניסיוני, בצע את שלב 2.2.17.
   2. כאשר הצרצרים מתים, מוציאים את הכלוב מהמקפיא. הסר את המכסה והעביר את כל החומרים הכלולים לכלי קיבול לפסולת הניתנת לטיפול אוטומטי. מעבירים את הפסולת בחזרה למקפיא עד לאוטוקלאב.
   3. לטבול את הכלוב הריק לתוך תמיסת אקונומיקה 10% ולאפשר לו לשבת לפחות 5 דקות.
   4. שטפו את הכלוב הריק במי ברז קרים כדי להסיר את שאריות האקונומיקה, תוך שימת לב מיוחדת לתעלות בתחתית המיכל.

תוצאות

נתונים המוכיחים גידול קריקט מוצלח מבקיעה לגיל 65 ימים נאספו במהלך ניסוי הזנה בספטמבר 2021. צרצרים גודלו מביצים בעקבות שלבים 1.1.1-2.6.1 של פרוטוקולים אלה, ושישה כלובים משוכפלים היו מלאים ב-24 צרצרים אקראיים בני 22 יום (כוכב שלישי) בעקבות שלב 2.7 לעיל. צרצרים גודלו אז בתנאי חדר סביבה; עם זאת, בשל יחידת ט?...

Discussion

הפשטות של גישה זו לגידול קריקט יכולה להועיל למגוון תחומי מחקר ומייצגת תבנית גנרית לגידול קריקט מוצלח, הניתנת להתאמה בקלות למגוון צרכים ניסיוניים. בהשוואה למספר מחקרים אחרים על G. bimaculatus, גודל הגוף הבודד המבוגר קטן יותר וההתבגרות איטית יותר¹⁴, אותה אנו מייחסים לטמפרטורת גי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid	HOMZ	3430CLBL	Used to house breeding stock
3-tier/12-tray Grow Light Stand	Fischer Scientific	NC1938548
50-gal (189.27L) tote bin with lid	Sterilite	#14796603	Used as secondary containment when handling crickets
50 mL polypropylene graduated cylinder	Fischer Scientific	S95171
7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid	HOMZ	3410CLBL	Used to house exprimental stock
Accuris 500 g x 0.01 g Balance	Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific	W3300-500	Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+"
Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush	Ace Hardware	#1803261
Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle	Fischer Scientific	03-421-160
Bright aluminum window screen	Phifer	UNSPSC# 11162108	Mesh size 18 x 16"
Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids	Wal-Mart	N/A
Deionized water
Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade	Home Depot	#313114935
Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12"	Uline	S-5189
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm	Fischer Scientific	FB0875714
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm	Fischer Scientific	FB0875713A
Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels	Home Depot	#205675843
Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks	Infinity Bond	Infinity IM-Tough-Guy-12
Mazuri Cricket Diet	Land O' Lakes International	SKU#  3002219-105
Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer	Wal-Mart	N/A
Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block	Home Depot	#300679904