肺动脉高压大鼠模型中右心室功能的综合超声心动图评估

摘要

本协议描述了肺动脉高压大鼠模型中右心室形态和功能的超声心动图特征。

摘要

肺动脉高压（PAH）是一种由肺部小动脉血管收缩和重塑引起的进行性疾病。这种重塑导致肺血管阻力增加、右心室功能恶化和过早死亡。目前批准的PAH疗法主要针对肺血管扩张剂途径;然而，最近新兴的治疗方式集中在涉及疾病发病机制的其他新途径上，包括右心室（RV）重塑。允许对新疗法进行纵向评估的成像技术对于确定新药在临床前研究中的疗效非常有用。无创经胸超声心动图仍然是评估心脏功能的标准方法，并广泛用于啮齿动物模型。然而，由于其解剖位置和结构，右心室的超声心动图评估可能具有挑战性。此外，临床前啮齿动物模型中缺乏超声心动图的标准化指南，因此难以在不同实验室的研究中对RV功能进行统一的评估。在临床前研究中，大鼠久效（MCT）损伤模型被广泛用于评估治疗PAH的药物疗效。该协议描述了幼稚和MCT诱导的PAH大鼠中RV的超声心动图评估。

引言

PAH 是一种进行性疾病，定义为静息时的平均肺动脉压大于 20 mmHg¹。PAH 的病理改变包括肺动脉 （PA） 重塑、血管收缩、炎症以及成纤维细胞活化和增殖。这些病理变化导致肺血管阻力增加，从而导致右心室重塑、肥大和衰竭²。PAH是一种复杂的疾病，涉及几种信号通路之间的串扰。目前批准的治疗PAH的药物主要针对血管扩张剂途径，包括一氧化氮-环鸟苷单磷酸途径、前列环素途径和内皮素途径。针对这些途径的疗法已被用作单一疗法和联合疗法3^，4。尽管在过去十年中PAH的治疗取得了进展，但美国REVEAL 登记处的调查结果显示，新诊断患者的 5 年生存率很低⁵.最近，新兴的治疗方式集中在疾病修饰剂上，这些药物可以影响PAH中发生的血管重塑的多因素病理生理学，以期破坏疾病⁶。

PAH的动物模型是评估新药物治疗效果的宝贵工具。MCT诱导的PAH大鼠模型是一种广泛使用的动物模型，其特征是肺动脉血管重塑，这反过来又导致肺血管阻力增加和右心室肥厚和功能障碍^7，8。为了评估新疗法的疗效，研究人员通常专注于右心室压力的终末评估，而不考虑PA压力，右心室形态和右心室功能的纵向评估。使用无创和非终末成像技术对于全面检查动物模型中的疾病进展至关重要。经胸超声心动图仍然是评估动物模型中心脏形态和功能的标准方法，因为与其他成像方式（如磁共振成像）相比，经胸超声心动图成本低且易于使用。然而，由于右心室位于胸骨阴影下方、其发达的小梁和解剖形状，因此对右心室的超声心动图评估可能具有挑战性，所有这些都使得难以描绘心内膜边界⁹，^10，11。

本文旨在描述一种综合方案，以评估 Sprague Dawley （SD） 大鼠幼稚和 MCT 诱导的 PAH 的右心室尺寸、面积和体积以及收缩和舒张功能。此外，该协议详细介绍了一种评估正常和扩张右心房超声心动图尺寸的方法。

研究方案

该协议中的所有实验均按照伊利诺伊大学芝加哥分校芝加哥机构动物护理和使用委员会的动物护理指南进行。雄性斯普拉格道利（SD）大鼠在注射MCT时体重在0.200-0.240公斤之间;但是，本文中描述的方案可用于更广泛的体重范围。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 研究设计

1. 动物
   1. 获得雄性SD大鼠并让它们适应4-7天。实验组将大鼠安置在干净的笼子中，并将它们保持在保持在20-26°C（68-79°F）的房间中，并用荧光灯定时照明以提供14小时光照，10小时黑暗循环。
   2. 在实验期间，让老鼠 随意获得标准 饮食和自来水。
2. 中链甘油三环化合物管理
   1. 在研究第0天，向大鼠皮下给予MCT（60mg / kg在HCl / NaOH中，pH 7.4;见 材料表;MCT 组）或载体（去离子水，pH 7.4;控制组）。
      注意:由于与 MCT 剂量相关的处理预防措施，所有大鼠都应在研究第 0 天在化学危害住房室中给药，并在那里饲养直到研究第 7 天。
   2. 在研究第7天，在研究期间将大鼠转移回一般住房房间。
3. 临床观察
   1. 每天对笼侧进行一次总体健康和外观观察。观察动物的死亡率以及疼痛和痛苦的迹象。
   2. 在原始数据笔记本中记录整个研究期间记录的任何异常观察结果。
4. 体重
   1. 在研究第 0 天（给药前）、整个研究期间每周和超声心动图当天记录体重。

2. 超声心动图

1. 制备
   1. 在MCT给药后的研究第23天，在诱导室中用100%氧气（1L / min）驱动的2%-3%异氟醚麻醉大鼠（参见 材料表）。
   2. 一旦失去意识，将大鼠从腔室中取出，并以背褥位置将它们转移到成像站动物平台（见 材料表）。使用连接到蒸发器的鼻锥施用异氟烷，蒸发器提供由 100% 氧气（1 L/min）驱动的 1%-2% 异氟烷。
   3. 将电极凝胶涂在每只爪子上，并将爪子固定在动物平台的心电图导板中。
   4. 通过剃须胸部并使用脱毛剂去除皮毛（见材料表）。将直肠温度探头（见 材料表）固定到位。将棉卷放在动物的左右两侧，并用胶带固定它们，以便在平台倾斜时保持动物的位置。
2. 监测
   1. 在整个过程中通过超声成像系统（见材料表）监测体温和心率（HR）。
   2. 如果可能，将体温保持在 37 ± 0.5 °C，并将心率保持在 350 bpm 或以上。使用加热台和加热灯来保持温度。
3. 图像采集
   1. 使用配备固态阵列超声换能器的高频超声图像系统进行经胸超声心动图检查（见 材料表）。
      注意:超声心动图方法中注明的所有方向均指超声医师的右侧或左侧。
   2. 左心室 （LV） 胸骨旁长轴 （PLAX） 视图
      1. 当大鼠处于背褥位时，将平台向左倾斜并将其尾部向下约 10°。
      2. 将换能器置于支架中的半锁定位置，凹口指向尾部方向。移动换能器，使其指向左侧胸骨旁线。逆时针旋转换能器约 30°-45°，并沿 y 轴（横向换能器轴）略微倾斜。
      3. 将温热的超声凝胶（见 材料表）涂在大鼠的胸部并降低换能器，直到它与凝胶接触。
      4. 向右或向左移动平台，在屏幕中央获得整个LV的视图。如有必要，调整图像深度并将焦点区域移动到后壁。
      5. 在平台位置进行微调，以确保主动脉和顶点在同一水平面上，并且左心室流出道可见。
      6. 按 电影存储 记录数据。左心室图像的PLAX视图示例如图 1A所示。
         注意:左心室成像可以熟悉心脏在胸部的位置。扩张的右心室可以移位左心室。
   3. 右心室流出道改良的PLAX视图
      1. 将平台向右倾斜约 10°-15°，并将其尾部向下倾斜约 5°。
      2. 移动换能器以指向大鼠的右胸骨旁线。将换能器逆时针旋转约 30°。
      3. 将超声波凝胶涂在大鼠的胸部并降低换能器，直到它与凝胶接触。
      4. 向左或向右移动平台，直到 RV 在视野中。在此修改后的PLAX视图中，右心室壁和室间隔（IVS）清晰可见，如图 1B所示。
      5. 如有必要，逆时针旋转换能器，以确保主动脉瓣和二尖瓣可见。
      6. 将焦点区域移动到右心室游离壁区域以改善心内膜边界定义，并在必要时调整增益。
      7. 按 电影存储 记录数据。
      8. 将 M 模式样品体积线放置在 RV 最宽的区域，并调整门以包含 RV 和 LV。样品体积线通常放置在大鼠两个相邻椎骨的阴影之间。
      9. 按 更新 ，然后按 电影存储 记录数据。修改后的PLAX视图图像中的M模式示例如图 1C所示，这些图像用于分析舒张期右心室内径（RVIDd）、收缩期右心室内径（RVIDs）和右心室游离壁厚（RVFWT）。
      10. 提起换能器并重新定位它，使其仅略微向大鼠的右胸骨旁线倾斜。将平台移动到仅略微向右倾斜的位置。
      11. 降低换能器，直到它与凝胶接触。
      12. 向尾向右或向左移动平台，直到看到右心室流出轨道并且肺动脉瓣 （PV） 聚焦且清晰可见。
      13. 按 电影存储 记录数据。 图2A显示了右心室流出道图像水平上改良PLAX视图的B模式示例;这些图像用于分析PV直径。
      14. 保持相同的B模式图像位置，按 颜色 以帮助识别通过PV的流量。调整速度以优化混叠，以便可以看到最高速度点。如有必要，通过减小彩色多普勒图像框的大小来提高帧速率。
      15. 按 PW （脉冲波）以量化血流谱。将样品体积门尺寸增加到最大值。
      16. 如有必要，调整基线速度和多普勒增益，使血流可见。
      17. 将PW角度平行于流经PV的方向对齐。将样品体积置于最高速度（混叠点）或PV小叶的尖端。
      18. 按 更新 以查看肺搏。
      19. 按 电影存储 记录数据。PV PW多普勒图像的示例如图 2B所示;这些图像用于分析肺射血时间 （PET）、肺加速时间 （PAT）、肺收缩压峰值速度 （PV PSV）、心输出量 （PV CO）、每搏输出量 （PV SV）、HR 和心动周期长度 （CL）。
   4. RV 聚焦顶端四腔室视图
      1. 将平台向左角倾斜，并尽可能向下倾斜。
      2. 逆时针旋转换能器30°-45°，然后移动换能器，使其指向动物的右肩/耳朵。
      3. 降低换能器，直到它与凝胶接触。这个位置允许典型的四室视图，其中左心室和左心房 （LA） 可见，但胸骨阴影在右心室游离壁上方。
      4. 调整心尖四腔室视图，通过将换能器稍微侧向于真顶点来获取 RV 聚焦视图。进行微调，直到获得最大平面。如有必要，稍微向尾部移动平台。在这个视图中，胸骨的阴影位于隔膜中，并且RV自由壁清晰可见。
      5. 确保右心室、右心房 （RA） 和三尖瓣 （TV） 在声学窗口中可见。
         注意:如果右心室非常扩张，则左心室可能不完全可见。手动握住换能器可以微调换能器角度，以改善 RV 的可视化效果。
      6. 确保右心室未缩短，左心室流出道未打开。
      7. 按电影存储记录数据。图3A，B显示了RV聚焦顶端四室视图图像的B模式示例;这些图像用于分析右心房区 （RAA）、右心室舒张末期区 （RVEDA） 和右心室收缩末期区 （RVESA）。
      8. 将 M 模式光标穿过 RV 自由壁上的三尖瓣环。确保具有最佳图像方向，以避免低估速度。按 更新 和 电影存储 以记录数据。
         注:三尖瓣环的运动图像示例如图 4A，B所示;这些图像用于分析三尖瓣环平面收缩偏移（TAPSE）。
      9. 按 B 模式 ，然后按 颜色 以帮助识别通过电视的流量。调整速度以优化混叠，以便可以看到最高速度点。通过减小彩色多普勒图像框的大小来提高帧速率。
      10. 按 PW 以量化血流谱。将样品体积门尺寸增加到最大值。
      11. 如有必要，调整基线速度和多普勒增益。
      12. 将PW角度平行于RV流入的方向对齐。将样品体积置于最高速度（混叠点）或三尖瓣小叶的尖端。
          注意:对三尖瓣流入速度进行成像可能具有挑战性;可能需要对传感器位置进行微调。
      13. 按 更新 以查看三尖瓣流入速度。
      14. 按 电影存储 记录数据。三尖瓣PW多普勒图像的示例如图 5A，B所示;这些图像用于分析舒张期早期充盈期间通过电视的血流速度（E），舒张期晚期充盈期间通过电视的血流速度（A），三尖瓣闭合开放时间（TCO）和喷射时间（ET）。
      15. 返回 B 模式并按 纸巾。稍微调整平台以确保三尖瓣环清晰可见，并将组织多普勒样本体积门放在右心室游离壁的三尖瓣环处。将样品体积门增加到最大宽度。
      16. 如有必要，调整基线速度和多普勒增益。
      17. 按 更新 以查看组织多普勒图像。
      18. 按 电影存储 记录数据。组织多普勒图像的示例如图 6A，B所示;这些图像用于分析舒张早期的三尖瓣环速度（E'）、晚期三尖瓣环速度（A'）和收缩期的三尖瓣环速度（S'）。
          注意:TAPSE 和组织多普勒始终在右心室游离壁而不是室间隔处测量。
4. 图像分析
   1. 使用仪器兼容软件离线执行图像分析（参见 材料表）。
   2. 避免所有测量发生吸气的区域，并始终对要分析的每个参数进行至少三次测量。
   3. 右心室 M 模式的改进胸骨旁长轴视图
      1. 选择从右心室 M 型的改良胸骨旁长轴视图中获得的图像，并分析 RVIDd （mm）、RVID （mm） 和 RVFWT （mm）。
      2. 从通用测量工具中选择 深度 。
      3. 追踪舒张期和收缩期右室的内径（图1C），并将测量值分别标记为RVIDd和RVID。
      4. 选择 深度 工具以测量 RV 自由壁的厚度。将光标与ECG的R波峰值对齐，并追踪舒张末期的壁（图1C）。从右心室心内膜边界排除右心室小梁和肌（如果存在），以准确测量右心室壁厚度。如果存在心外膜脂肪，还要排除心外膜脂肪，以避免错误增加的测量值。
         注意:右心室小梁和肌表现为跟随右心室壁运动的停产线。RVIDd、RVID 和 RVFWT 测量值将显示在通用包部分下的报告中。当心包明显增厚时，右心室壁的测量可能很困难;因此，请仔细选择分析区域。
   4. 光伏 B 模式
      1. 选择从PV B模式获得的图像并分析PV直径（mm）。
      2. 从心脏套件下拉菜单中选择 RV 和 PV 功能 。
      3. 选择 PV 直径 并选择阀门打开的框架。在阀门水平处，跟踪墙与壁的距离，避免阀环（图 2A）。
         注意:测量值将显示在RV和PV功能部分下的报告中。
   5. 光伏PW多普勒
      1. 选择从PV PW多普勒获得的图像以分析PET（毫秒），PAT（毫秒），PV PSV（毫米/秒），心率（每分钟心跳），CL（毫秒），PAT/PET比值，心输出量（PV CO;mL/min），每搏量（PV SV;μL）和PAT/CL比值。
      2. 从心脏套件下拉菜单中选择 RV 和 PV 功能 ，然后选择至少三个具有代表性的 PA 速度。
      3. 选择 PAT 并跟踪从加速点开始到速度峰值结束的 PA 流速。
      4. 选择 PET 并从加速度点开始测量，并在信号达到基线时结束。
      5. 选择 PV峰值vel，将光标放在最高速度点，然后单击鼠标左键。
      6. 要获得 PV 速度时间积分 （PV VTI） 测量值，请选择峰值 Vevo 工具下的负选项。
         注意:检测灵敏度可以更改，但在整个研究中应保持恒定值。
      7. 从下拉菜单中选择 光伏 VTI 。通过左键单击峰的起点开始测量，并在峰的末端右键单击结束测量以完成测量。根据需要通过移动线条来调整峰值轮廓。
      8. 将光标放在 PV VTI 测量处，右键单击以选择 属性，然后在参数选项中启用 HR 测量。对所有三个光伏 VTI 测量重复此步骤。
      9. 从通用测量工具中选择 时间 ，并跟踪从一个周期的加速点到下一个周期的加速点的时间以计算CL（图2B）。
         注意:测量值将显示在RV和PV功能部分下的报告中。PAT/PET 比率、PV CO 和 PV SV 由仪器软件计算。
   6. RV 聚焦顶端四腔室视图 B 模式
      1. 选择从 RV 聚焦顶端四室视图 B 模式获得的图像，以分析 RAA（mm 2）、RVEDA （mm 2）、RVESA （^{mm 2}） 和 RV 分数面积变化 [RVFAC = （RVEDA-RVESA）/RVEDA， %]。
      2. 从心脏包下拉菜单中选择 SAX （胸骨旁短轴）。
      3. 从 RV 聚焦的根尖四腔视图中选择舒张末期的 B 模式图像。确保整个 RV 都在视图中，包括顶点和侧壁。
      4. 选择 ENDOarea;d 并追踪右心内膜，从心内膜环，沿游离壁到心尖，然后沿室间隔回到心室间隔环，排除小梁（如果存在）。
      5. 在收缩末期选择 B 模式图像，从 SAX B 模式下拉窗口中选择 ENDOarea;s ，然后重复 RV 的跟踪。 使用相同的图像，从通用测量工具中选择 2D 区域 ，并通过跟随心内膜并排除腔静脉和 RA 附属物来追踪 RA。三尖瓣小叶和环之间的区域也被排除在外（图3）。
      6. 在另外两张图像中重复舒张期和收缩期的ENDO面积测量以及RA面积测量。
         注意:舒张期和收缩期右心室区域的测量值将显示在 SAX-B 模式部分下的报告中。RA 区域将显示在通用包装测量值下。RVFAC使用公式RVFAC = （RVEDA-RVESA）/RVEDA¹⁰计算。
   7. 三尖瓣环外侧的 M 模式
      1. 选择从三尖瓣环的侧面获得的M模式图像来分析TAPSE（mm）。
      2. 从通用测量工具中选择 深度， 然后选择至少三个连续心脏部位的区域，不受吸气干扰。
      3. 在三个连续的心动周期中追踪RV环段从舒张末期到收缩峰值的距离（图4）。
         注意:测量值将显示在通用包部分下的报告中。
   8. 电视PW多普勒
      1. 选择从电视PW多普勒获得的图像以分析E（毫米/秒），A（毫米/秒），TCO（毫秒），ET（毫秒）和右心室心肌性能指数[RVMPI = （TCO-ET）/ET]¹¹。
      2. 从心脏套餐下拉菜单中选择电视流，然后选择至少三个具有代表性的 电视 速度。
      3. 选择 TV E（三尖瓣早期填充），将光标放在E波的最高速度点，然后单击鼠标左键;从最高速度到基线绘制一条线。同样，选择 TV A（三尖瓣后期填充），将光标置于A波的最高速度，然后单击鼠标左键;另一条线从最高速度到基线（图5）。
      4. 要测量喷射时间 （ET），请从通用测量工具中选择 时间 工具，并测量三尖瓣流入（流量喷射的区域）从开始（前缘）到停止（后缘）的时间。将测量值标记为 ET（图 5）。
      5. 要测量 TCO 时间，请选择 时间 工具并追踪从一个周期的三尖瓣 A 波结束到下一个周期的三尖瓣 E 波开始的时间。将测量值标记为 TCO（图 5）。
         注意:TV E 和 TV A 的测量值将显示在"电视流量"部分下的报告中。ET 和 TCO 测量值将显示在通用包装测量值下。RVMPI的计算公式为（TCO-ET）/ET11。E、ET 和 TCO 以恒定的 R-R 区间进行测量，以最大程度地减少误差。ET测量也可以从中间边缘到后缘进行;在整个分析过程中，测量结果获取方式的一致性最为重要。
   9. 右心室外侧三尖瓣环组织多普勒
      1. 选择从右心室外侧三尖瓣环组织多普勒获得的图像以分析 E' （mm/s）、A' （mm/s）、S' （mm/s） 和 E/E' 比率。
      2. 从心脏包下拉菜单中选择 TV Flow ，然后选择至少三个具有代表性的游离壁组织速度。
      3. 选择 TV LW E，将光标放在E'波的最高速度点，然后单击鼠标左键;从最高速度到基线绘制一条线。同样，选择 TV LW A，将光标放在A'波的最高速度点，然后单击鼠标左键;从最高速度到基线绘制另一条线（图6）。
      4. 从心脏包下拉菜单中选择 MV 流量，然后选择 S WAVE。
      5. 在弹射阶段将光标置于最高收缩速度，不要过度获得多普勒包络，然后单击鼠标左键;从最高速度到基线绘制一条线（图6）。
         注意:测量值将显示在"电视流量"和"MV 流量"部分下的报告中。E/E' 比率是手动计算的。
5. 尸检
   1. 按照机构批准的方案，在 MCT 给药后的研究第 24 天，通过在异氟烷过量下放血对大鼠实施安乐死。
   2. 取出心肺阻滞，通过脉管系统 轻轻 注入冰冷的盐水，直到灌注液清除。将心脏和肺部分开，去除多余的盐水。
   3. 分别称量每个器官。
   4. 移除心房并丢弃。
   5. 将左心室与隔膜 （LV+S） 与右心室分开，并分别称量心室。
   6. 切除左胫骨并将其与软组织分开。
   7. 使用数字卡尺获得胫骨的纵向测量值（见 材料表）。
   8. 将解剖的心脏、肺和胫骨与其余的尸体一起处理。
      注意:心脏重量 （HW）、肺重量 （LW）、LV+S 重量和右心室重量按胫骨长度 （TL） 归一化。RV 肥大由富尔顿指数评估，其中右心室体重由 LV+S 体重 [富尔顿指数 = RV/（LV+S）]¹² 归一化。

结果

在这项研究中，MCT处理的大鼠被用作PAH的模型。超声心动图分析在MCT给药后的研究第23天进行，所有测量和计算均代表连续三个周期的平均值。从对照（载体:去离子水）和MCT处理的大鼠（60mg / kg）获得的超声心动图参数如 表1所示。

对照和MCT处理的大鼠的PLAX视图的代表性图像如图 1A所示。这些图像用作心脏位置和左心室形态的初步评估。RV ...

讨论

RV的超声心动图评估是筛选PAH动物模型中新疗法有效性的宝贵发现工具。深入表征RV结构和功能是必要的，作为治疗PAH地址RV重塑的新靶点4^，14。本研究描述了一个详细的协议，可以成功表征RV的结构和功能。

复杂的结构几何形状和胸骨后面的位置使得右心室的超声心动图表征变得困难;因此，改进的超声心动图视图用于促进右心室可...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium cloride injection USP	Baxter	2B1324
Braided cotton rolls	4MD Medical Solutions	RIHD201205
Depilating agent	Wallgreens	Nair Hair Remover
Electrode gel	Parker Laboratories	15-60
High frequency ultrasound image system and imaging station	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
Isoflurane	MedVet	RXISO-250
Male sprague Dawley rats	Charles River Laboratories	CD 001	CD IGS Rats (Crl:CD(SD))
Monocrotaline (MCT)	Sigma-Aldrich	C2401
Rectal temperature probe	Physitemp	RET-3
Sealed induction chambers	Scivena Scientific	RES644	3 L size
Solid-state array ultrasound transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo MicroScan transducer MS250S
Stainless steel digital calipers	VWR Digital Calipers	62379-531
Ultrasound gel	Parker Laboratories	11-08
Vevo Lab software	FUJIFILM VisualSonics, Inc.		Verison 5.5.1