磁共振引导立体定向输注猪脑

摘要

这里介绍的方案展示了使用对流增强输注、实时磁共振成像 （MRI） 可视化指导和实时输液分布可视化对猪大脑的立体定向。

摘要

该程序的总体目标是通过实时磁共振（MR）可视化指导在猪脑中进行立体定位，以提供精确的输注。受试者俯卧在 MR 孔中，以最佳方式进入颅骨顶部，躯干抬起，颈部弯曲，头部向下倾斜。固定在双侧颧骨上的两个锚针使用头部支架将头部固定下来。将磁共振成像（MRI）柔性线圈放置在头架上，以便头骨可以进入干预程序。放置在头皮上的计划网格用于确定套管的适当入口点。立体定向框架通过软件投影进行固定和迭代对齐，直到投影径向误差小于0.5 mm。使用手钻创建一个用于插入套管的毛刺孔。使用钆增强共输注来可视化细胞悬液的输注。在给药过程中实时记录重复的T1加权MRI扫描，以可视化钆的分布体积。MRI引导的立体定向允许精确和受控地输注到猪脑中，同时监测套管插入的准确性和确定药物的分布体积。

引言

在该协议中，我们描述了介入磁共振成像（iMRI）立体定向系统的应用，用于套管放置和实时可视化输注到猪脑中。iMRI系统的发展允许准确的导管放置¹。iMRI允许可视化全身麻醉下输液剂在患者大脑中的分布1，^2，以实时评估手术的准确性。

MR引导的立体定向系统是一个目标平台，可实现亚毫米级目标精度¹。它使用头骨安装的瞄准装置与专用软件相结合，该软件提供大脑的解剖成像，并具有投影的导线插入轨迹和调整参数。用于对大脑进行立体定向手术干预的iMRI引导已被证明在临床应用中是有效的，例如治疗帕金^森病的深部脑刺激2，³，4，⁵，^局灶性消融治疗癫痫6，⁷，以及药物对流增强输送（CED）到中枢神经系统8^，9。

CED方法用于通过流体对流直接将治疗剂输送到中枢神经系统。这是基于一个小的静水压力梯度，该梯度使输液从输液套管的尖端流入周围的细胞外空间¹⁰。立体定向方法用于将高浓度的大分子、小分子¹¹、¹²、细胞移植 13、^14、15 或治疗剂递送到选定的脑组织靶标中，从而绕过血脑屏障。渗透性、扩散系数、背压、摄取和清除机制等因素会影响治疗剂的扩散¹⁶。该技术利用钆基共输注^物1用于临床CED，以实时监测输注剂进入实质靶标。iMRI监测组织中的分布体积和相关动力学等参数，以达到目标精度。

通过 MR 引导的立体定位系统 对 输注剂的 CED 研究已在非人灵长类动物中进行了研究，从而产生了准确、可预测和安全的程序。输液插管的放置精度已被证明达到亚毫米的放置误差¹⁷。该系统提供可预测的输液分布，观察到分布体积随输液量呈线性增加，导致随后引入用于 CED 输注的抗反流套管¹⁸。据报道，这种iMRI输注程序对非人灵长类动物没有不良影响¹⁹。

在这里，我们将MR引导的固醇计法的应用扩展到猪脑，以递送和监测由300μL细胞悬液组成的输注剂的分布。猪脑的大小允许成像和神经外科干预，可以在临床上应用于人类，这在较小的疾病动物模型中是不可能的²⁰。此外，猪的免疫系统在对生物或其他治疗剂的反应方面产生与人类相似的反应²¹。因此，与这种动物物种进行立体定向药物递送程序具有直接的转化临床意义，并且在逻辑上可能比非人类灵长类动物研究更容易。

我们使用猪模型（家猪，雌性，25公斤，14周龄）进行MR引导的立体定向。本研究报告了猪立体定向手术的视觉实施。我们描述了空间适应猪头，视频和图像中程序的可视化，以及同步MR成像以评估猪脑中的输注液分布。MR引导的立体定向在3T MRI空间中进行。

通过这个实验，我们小组展示了MR引导的立体定向在猪脑中的性能，以及跟踪大脑内输液的基本成像时间表。在人类中进行临床立体定向的一般技术可以应用于猪头骨和大脑。

该程序的总体目标是在实时MRI可视化指导下在猪脑中进行MR引导的立体定位。这是通过首先将俯卧在MRI孔中的受试者定位以实现最佳进入颅骨顶部来实现的。第二步是通过MRI辅助可视化引导计划手术插入，这涉及放置和扫描基准网格，以确定预先计划轨迹的适当切入点。这是通过高分辨率（1 mm各向同性）T1加权3D磁化制备快速梯度回波（MPRAGE）扫描实现的，持续时间为7分44秒。接下来，我们将立体定向框架固定在头部，并通过软件投影迭代调整对齐方式，直到投影径向误差小于0.5 mm。倾斜方向的快速2D涡轮自旋回波扫描（持续时间为13秒）提供图像引导。然后，在皮肤上切开一个切口，并使用手钻创建一个毛刺孔，以便在预定义的坐标处插入输液套管。最后一步是通过重复的T1加权MRI扫描（3D MPRAGE;1分45秒）实时监测输注。结果表明，MR引导的立体定位允许精确和受控地输注到猪脑中，基于实时MR引导和随后用于可视化分布体积的T1加权3D MPRAGE扫描（1 mm各向同性分辨率）。

研究方案

该研究已获得休斯顿卫理公会研究所机构动物护理和使用委员会的批准，IACUC批准号为IS00006378。所有实验方法均按照国家和机构的相关指南和规定进行。

1. 动物定位

1. 定位受试者以最佳方式接近颅骨顶部:将受试者放在MRI工作台上，为MRI扫描做准备。
   注:主题信息:家猪，雌性，25公斤，14周龄。
   1. 用氯胺酮（600 mg 肌内注射 [IM]）和咪达唑仑（5 mg IM）镇静受试者。给予镇痛药氢吗啡酮（4 mg 肌注）、卡洛芬（每 盎司 100 毫克）和芬太尼（外用 25 微克）、抗生素头孢曲松（550 毫克静脉注射 [IV]）和氯化钠（0.9% 静脉注射）。
   2. 插管受试者。用2%-3%异氟醚维持麻醉。
2. 在整个过程中监测受试者的生命体征。
   1. 使用呼吸机以 16-19 次呼吸/分钟的速度进行机械通气。
3. 将受试者放在MRI台上，为MRI扫描做准备。
4. 将受试者置于俯卧位置，头部朝向MRI孔。
5. 将标准 MRI 四通道柔性线圈放在头架上。
6. 用头部支架稳定受试者的头部。
7. 用毛巾和泡沫垫抬高躯干。目标是头部略微向下，颈部弯曲，鼻子几乎接触桌子。这将有助于确保立体定向框架和输液插管适合MRI扫描仪的孔内。将 MRI 头架别针固定在双侧颧骨上，以保持头部固定在 MRI 台上。
8. 检查颅骨顶部是否向扫描仪后部倾斜，颈部弯曲。这个位置使外科医生能够在受试者进入MRI时进入头皮顶部。
9. 设置后，MRI工作台被移动到扫描仪的孔中，直到受试者的头部到达孔的末端。

2. 通过 MRI 辅助可视化引导计划手术插入

1. 以无菌方式准备该区域，注意避免准备好的材料进入受试者的眼睛。将无菌毛巾放在手术区域周围。将无菌窗帘放在颅骨顶部，外科医生可以接触到。
2. 通过将网格的粘合剂侧固定在患者的头部上，以毛刺孔的位置为中心，将基准计划网格放在受试者的头皮上。
3. 撕下网格的顶部充满液体的层，同时将下层牢固地固定到位。
4. 在网格设置到位的情况下执行 MRI 侦察扫描。扫描通常需要静脉给予 MR 造影剂以显示脉管系统:使用 1 mmol/mL 浓度的造影剂钆造影剂，输注量为 2.5 mL。
   注意:侦察扫描是在确定性成像研究之前拍摄的初步图像。目的是让外科医生确保成像在感兴趣区域附近进行，并定义成像边界。根据制造商的说法，造影剂在 1 mmol/mL 浓度下的推荐剂量为动物称重的每公斤 0.1 mL。
5. 在 MR 引导软件中选择用于插入套管的精确大脑位置。
6. 确保软件允许根据所选目标可视化外科医生计划的套管放置轨迹。确保软件输出轨迹可视化和相应的入口点。
   注意:在这项研究中，选择额叶皮层中的一个位点来靶向白质。这是许多人类胶质瘤出现和生长的地方²².它也是沿白质束传播的首选地点²³.
   注意:考虑外科医生对入口点、目标和所需轨迹的决定，以尽量减少皮亚尔和脑沟违规并避免血管。
7. 通过在软件中手动拖动投影的入口点和目标点来调整建议的轨迹，包括所需的入口点和目标点，以避免血管并最大限度地减少皮亚尔和脑沟违规。轨迹可以更改并在三维空间中查看。
8. 根据外科医生的偏好确定所需的轨迹后，运行MR引导软件以找到网格上的入口点。
   1. 滚动浏览扫描的计划轨迹以找到头皮上的入口点。该软件根据网格上计划轨迹的投影指定网格坐标。

3.固定立体定向框架，通过软件投影迭代调整对齐方式

1. 首先用六个骨锚螺钉和四个偏置螺钉固定底座，围绕网格上所需的入口点坐标组装立体定向框架。
2. 将六个骨锚螺钉固定在网格上的头骨上，穿过头皮。六个锚固螺钉用于稳定立体定向框架并避免钻孔过程中的任何移动。
3. 通过固定在头骨上的皮肤固定位于塔底部的四个偏置螺钉。它们通过将框架底座提升到中心螺钉来作为反作用力来拧紧中心骨螺钉，并稳定底座。
4. 立体定向框架底座固定后，继续框架组装。
5. 执行高分辨率 T1 加权 MPRAGE MRI 扫描，这是 MRI 软件中的一个选项，并设置框架以捕获帧基准点并确认轨迹。
6. 使用软件确认所需的投影套管插入轨迹，可视化MRI扫描和计划轨迹。
   1. 随后进行2D涡轮自旋回波MRI扫描，以确认框架与主体的对齐，一旦框架就位。如果当前帧位置与所需轨迹之间存在未对准，软件将输出调整参数。
      注意: 软件计算立体定向帧当前位置的投影与定义的目标点之间的径向差。该误差用于计算投影误差，而投影误差又用于计算帧所需的调整以使其最小化。
7. 通过转动拇指轮执行俯仰滚动和 X-Y 调整，如软件中的输出调整参数所示。
8. 重复支持软件的轨迹MRI可视化，并根据需要对目标套管进行旋转和平移调整（使用拇指轮）。
9. 使用MR引导软件，在所需轨迹处测量头骨的厚度以及到大脑的总距离。
   注意:软件会计算从框架顶部（拧到头骨上）到目标点的距离，以估计总长度。

4.钻孔和插入套管进行输液

1. 在进行切口之前使用碘磨砂膏以防止感染。
2. 在立体定向框架下使用手术刀在头皮上做一个3厘米的切口。
3. 通过在创建检修孔之前执行调整来设置钻孔插入框架。
   1. 拆下并更换中心导向管，更换为适合钻孔的 3.4 mm 钻头的导向管。
4. 确保助手在场以将框架固定到位，同时外科医生使用手动钻头进行钻头，以增加框架的额外稳定性。
5. 让外科医生用手动麻花钻钻，以创建一个直径为 3.4 毫米的毛刺孔。
6. 为第二个钻头插入设置框架，以加宽毛刺孔并避免可能改变轨迹的骨碰撞。
   1. 用 4.5 毫米钻头设置钻头;将中心导向管更换为适合此更大钻头的导向管。
   2. 创建一个 4.5 mm 的毛刺孔。
7. 执行MRI扫描以确保目标套管已恢复到计划的轨迹，因为钻穿框架有时会移动套管。
8. 用锋利的探针刺穿硬脑膜。
9. 插入预先灌注的框架兼容输液插管。确保套管具有一致的中性或正背压，以限制气泡的引入。
   注意:软件为计划目标提供指定的深度。
10. 测量立体定向框架兼容输液插管的深度，并使用与套管相关的深度停止。这种深度停止可确保套管到达所需位置并且不会超出该位置。还有一个带有附加螺钉的锁和底座组件，以确保套管保持在所需的深度。

5.通过重复MRI扫描监测输液

1. 进行MRI扫描以评估套管插入大脑中正确的目标位置。
2. 开始输注所需药物，与钆造影剂共同输注。
   注意:在本实验中，使用了1 mM浓度的钆基造影剂，但这可能需要根据应用进行调整。以10μL/分钟的速率总共施用300μL输注体积，尽管这也可以变化。
3. 定期进行MRI扫描，以监测脑中插管剂的输注和分布量，这可以由于钆的共同输注而推断。
   注意:套管尖端周围的高信号区域表明存在钆基造影剂。
4. 输注结束后，停止泵。
   注意:本研究中使用的输注速率为30μL / min，直到完全注入300μL体积的细胞悬液。
5. 在移除套管之前，让套管在输注终止后在大脑中停留 5 分钟。
   注意:输液插管通常在输液终止后留在原位 5 分钟以减少回流^21，24。
6. 通过框架手动取出套管。
7. 通过以与构建方式相反的顺序拆卸框架，将其从头部卸下。
8. 用运行 3-0 或 4-0 单烯缝合线关闭切口。
9. 关闭异氟醚以准备恢复。
10. 拔管受试者，让受试者在兽医团队的观察下恢复。

结果

MRI扫描仪中的猪位置为外科医生提供了最佳的操作通道，并为立体定向框架和输液插管提供了间隙（图1）。受试者的躯干用毛巾和泡沫垫抬起。这使得头部在MR孔的末端略微向下下降，因此确保了立体定向框架和输液插管插入位置对外科医生来说是最佳的。

MRI引导的可视化允许精确规划和插入大脑套管（图2）。MR引导软件提供插入点以实现所需的轨迹。

在软件中扫描立体定向框架，并对其进行调整以有效地到达所需位置（图3）。在这个演示中，选择了额叶皮层中的一个位置。设置框架后，使用软件估计猪头骨的厚度，到框架底部到所需位置的距离，以及框架参数调整以达到所需位置。在这种情况下，对于选择的位置和插入角度，套管将穿过的头骨厚度为4.7毫米，从颅骨内表面到大脑表面的厚度为4.4毫米（图3A）。

最后，套管输注后的反复术间MRI扫描显示了输注如何输送到脑组织（图4）。这些扫描还提供了套管投影（蓝色矩形）和投影套管轨迹（黄色矩形）的比较，这表明该技术在到达所需位置方面的有效性。MR扫描以4-6分钟的固定间隔进行，并以10和30分钟的扫描完成。在这些扫描中，钆增强输注是可处理的，这提供了药物分布体积的实时可视化。

图 1:MRI 表上的受试者位置。 躯干抬起，颈部弯曲，头部向下倾斜。（A）在进入MR孔之前。（B）通过MR孔定位的受试者，以最佳方式进入颅骨顶部。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:MR 引导的立体定位 可视化。 （A）计划轨迹的可视化。软件输出网格中放置在头皮上的入口点位置。（B） 头皮上的入口点位置。 请点击此处查看此图的大图。

图3:框架固定在头骨上的干预轨迹 。 （A）测量骨深度和到大脑的距离。（B）颅骨上的立体定向框架，用手钻创建一个毛刺孔。（C）软件上的立体定向框架和三维重建投影。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:钆增强输注剂的延时。 套管尖端周围的高信号区域表明存在钆。随时间推移进行重复的MR扫描，以跟踪输注过程中药物的分布体积:（A）t = 0，（B）t = 4分钟，（C）t = 8分钟，（D）t = 12分钟，（E）t = 20分钟，（F）t = 26分钟;输注结束后:（G）t = 36分钟，（H）t = 60分钟。共输注剂的可视化发生在 4 分钟后。蓝色矩形是测量的套管位置，而黄色矩形显示投影的套管轨迹。 请点击此处查看此图的大图。

讨论

该协议呈现了MR引导的立体定向到3T MR机器内的猪脑的性能，具有亚毫米靶向精度的可能性，如以前的研究¹，^4，17，^18，25所实现的那样。先前使用MR引导立体定向的尸体实验显示径向误差为0.2±0.1mm¹。在这份报告中，由于外科医生对轨迹的在线评估和调整，相对于计划轨迹的最终深度误差为 1.4 毫米。最终深度误差与在人体中临床实施iMRI立体定向手术的径向误差发现（小于2毫米）相当²⁶。

在这里，我们演示了受试者在MRI工作台上的位置，其躯干抬起，使头部可以略微向下下降，并向外指向MR孔的末端。这种头部位置对于为外科医生提供执行手术的空间至关重要。立体定向框架允许精确和受控地注入猪脑模型。此外，实时MR成像可以准确确定分布体积。猪作为在MRI中实时跟踪输液的大型动物模型，为研究药物输送到大脑，细胞递送和其他具有翻译价值的试剂提供了可能性。

与人类或非人类灵长类动物相比，猪具有明显的解剖学差异需要考虑。随着猪的成长，MR孔中身体的大小成为一个挑战。头部和躯干的形状与人类不同，这证明很难适应外科医生的最佳大脑通道，无论是外科手术还是套管插入MR孔外的空间。因此，以外科医生可以从MR孔末端进入头部的方式定位受试者至关重要。

猪和人类头骨厚度的差异是一个需要考虑的因素。在该协议中，iMRI可视化允许精确估计颅骨厚度，以实现有效的毛刺孔程序。鉴于使用这些微创神经外科工具，动物恢复是平静的。

MR 引导的可视化为进入猪脑、插入套管和监测输液剂提供实时指导。据报道，钻孔过程、组织变形和/或白质束的破坏会导致药物递送到大脑的困难²⁵。计划期间的迭代 MR 扫描和套管插入提供了小调整的能力。此外，输注参数（如输注速率或套管插入的准确性）可以根据术内成像的指示实时更改或暂停。最后，必须选择钆基共输注物的适当平衡，以获得对药剂分布体积的清晰评估。

钆造影剂的过度浓缩可能掩盖了其在MRI扫描^{中的分布27}，在套管尖端周围显示一个黑点，周围是一个高信号区域，显示输注量的外部限制。由于在外科医生工作区域周围有限的MRI空间中拍摄的限制，手术的可用镜头受到限制。术中视频片段用于指导方案描述。

在猪和其他大型动物模型中通过MR引导的立体定向 输 注剂已经产生了准确，可预测和安全的程序。在猪中展示iMRI立体定向为研究治疗的可扩展性提供了基础，这些研究治疗对人类具有很高的转化价值。与其他物种相比，猪模型与人类反应相似，因此已被广泛用于研究免疫反应²⁸。输送到大脑的治疗药物可以在精确靶向输注的背景下进行研究，并具有输注位置的实时MRI可视化，必要的调整以及术中评估其在组织中的分布的额外好处。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 Tesla Siemens MAGNETOM Vida	Siemens Healthineers		70 cm wide-bore 3 Tesla whole body MRI scanner
Four channel flex coil	Siemens Healthineers		Placed ventrally to allow access to the skull
MR Neuro Patient Drape	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-PD-05	MR Neuro Patient Drape, Marker Pen, Track Ball Cover, Cable Cover
MR Neuro Procedure Drape Tapered - Long	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-PD-02-L	MR Neuro Procedure Drape Tapered, Marker Pen, Track Ball Cover
MR Neuro Procedure Drape Tapered w/Extension - Long	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-PD-03-L	MR Neuro Procedure Drape Tapered w/Extension, Marker Pen, Track Ball Cover
MR Neuro Scanner Bore Drape w/Extension	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-PD-04	MR Neuro Scanner Bore Drape w/Extension
Scalp Mount Base	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-SM-01	Scalp Mount Base and centering too
Skull Mount Base	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-SK-01	Skull Mount Base
SMARTFrame Accessory Kit	ClearPoint Neuro, Inc	NGS -AK-01-11	Stylet, Lancet, Peel-Away Sheath (2), Ruler, Depth Stop (2)
SMARTFrame Guide Tubes	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-GT-01	15 GA Guide Tube, 18 GA Guide Tube and 16GA Guide Tube
SMARTFrame Guide Tubes .052” / 18 ga	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-GT-02	.052” Guide Tubes that fit 18 ga devices (5)
SMARTFrame Guide Tubes .060” / 17 ga	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-GT-03	.060” Guide Tubes that fit 17 ga devices (5)
SMARTFrame Guide Tubes .064” / CP Stylet	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-GT-04	.064” Guide Tubes that fit ClearPoint Stylets (5)
SMARTFrame Guide Tubes .068” / 16 ga	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-GT-05	.068” Guide Tubes that fit 16 ga devices (5)
SMARTFrame Guide Tubes .074” / 15 ga	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-GT-06	.074” Guide Tubes that fit 15 ga devices (5)
SMARTFrame MR Fiducial	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-BM-05	MR Fiducials (5)
SMARTFrame Scalp Mount Rescue Screw – Long	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-RS-02	Short Scalp Mount Rescue Bone Screws (3)
SMARTFrame Scalp Mount Rescue Screw – Short	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-RS-03	Long Scalp Mount Rescue Bone Screws (3)
SMARTFrame Skull Mount Rescue Screw	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-RS-01	Skull Mount Rescue Bone Screws (3)
SMARTFrame Thumb Wheel Extension Set.	ClearPoint Neuro, Inc	NGS -TE-01	Light Hand Controller
SmartFrame XG Device Guide, 2.5 mm	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-XG-03	2.5-mm Device Guide
SmartFrame XG Device Guide, 3.2 mm	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-XG-04	3.2-mm Device Guide
SMARTFrame XG Drill Guide, 4.5 mm	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-XG-02	4.5-mm Drill Guide
SMARTFrame XG Drill Guide, 6.0 mm	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-XG-05	6.0-mm Drill Guide
SMARTFrame XG Exchangeable Device Guides	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-XG-01	Device Guide, 3.4-mm, Device Guide, 14 GA
SMARTFrame XG MRI-Guided Trajectory Frame	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-SF-02-11	Stereotactic Frame, Skull Mount Base, Centering Ring, Dock, Standard Device Lock, Large Device Lock, Screwdriver, Roll Lock Screw w/washer
SMARTFrame XG MRI-Guided Trajectory Frame, 5 Fr	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-SF-02-11-5	Stereotactic Frame, Centering Ring, Dock, 5 Fr Device Lock, Large Device Lock, Screwdriver, Roll Lock Screw w/washer
SMARTFrame XG MRI-Guided Trajectory Frame, 7 Fr	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-SF-02-11-7	Stereotactic Frame, Centering Ring, Dock, 7 Fr Device Lock, Large Device Lock, Screwdriver, Roll Lock Screw w/washer
SMARTGrid MR Planning Grid	ClearPoint Neuro, Inc	NGS -SG-01-11	Marking Grid and Marking Tool
SMARTTip MR Drill Kit, 4.5-mm	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-DB-45	4.5-mm Drill Bit, 3.2-mm Drill Bit, Lancet, Depth Stop, Ruler
SMARTTwist MR Hand Drill	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-HD-01	Hand Drill
VentiPAC	SurgiVet	V727000	Mechanical ventilator
Wharen Centering Guide	ClearPoint Neuro, Inc	NGS-CG-01	Wharen Centering Guide