从羊膜中提取Lumican及其储存温度的测定

摘要

本协议描述了从羊膜（AM）中提取lumican及其储存条件作为AM提取物（AME）在-20°C，4°C和室温（RT）下6，12，20和32天以量化其蛋白质和lumican浓度。

摘要

Lumican是人羊膜（AM）中一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖，可促进角膜上皮化和胶原纤维的组织，保持角膜透明。本工作提出了一种从AM中提取蛋白质得到Lumican的方法。此外，还评估了在不同温度和时间段下储存的AM提取物（AME）中Lumican的稳定性。解冻100mgAM并机械去上皮化。将去上皮化的AM冷冻并粉碎，直至获得细粉，用2.5mL盐水缓冲液与蛋白酶抑制剂溶解并离心进行蛋白质提取。收集上清液并在-20°C、4°C和室温（RT）下保存6、12、20和32天。之后，在每个AME中量化Lumican。该技术允许从AM中提取lumican的可访问和可获取的方案。Lumican浓度受储存时间和温度条件的影响。Lumican在AME中在-20°C和4°C下储存12天明显高于其他AME。这种lumican提取可用于开发治疗方法和药物解决方案。需要进一步的研究来确定AME发光胶在再上皮化和伤口愈合过程中的用途。

引言

角膜影响最常用的治疗方法之一是羊膜移植;然而，近年来，出现了使用羊膜组织的各种成分作为替代和辅助治疗的新建议。在研究最多的AM成分中，是从AM提取物（AME^）中获得的成分1，²，^3，4，⁵，^6，7。AM含有多种可溶性因子，例如抗血管生成蛋白，白细胞介素（IL），金属蛋白酶（TIMP）的组织抑制剂，由TSG-6介导的抑制中性粒细胞细胞外陷阱的抗炎蛋白，生长因子:表皮生长因子（EGF），转化生长因子（TGF）（α和β），角质形成细胞生长因子（KGF），肝细胞生长因子（HGF）和Lumican，通过调节胶原纤维生成来维持角膜透明度1^，2，³，⁴，⁵，⁶，⁷，^8，9.

Lumican是一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖（SLRP），是角膜基质基质中间质胶原酶的主要细胞外成分之一，负责组织胶原纤维并保持角膜透明度⁴，^10，11。蛋白聚糖是细胞外基质（ECM）中的分子，是进行细胞信号传导和维持细胞内稳态的主要分子¹²。据报道，ECM蛋白在伤口愈合过程中驱动细胞增殖，分化和迁移过程¹¹。

证据表明Lumican可能参与角膜再上皮化过程。Saika 等人在一项研究中表明，角膜损伤后，可以在损伤后的前 8 小时至最多 3 天内在角膜角质细胞中检测到 lumican。在第二天和第三天呈现最高浓度的lumican，该蛋白聚糖随后在第七天无法检测到¹³。这些数据表明Lumican参与角膜再上皮化过程的激活。另一方面，在另一项研究中，据报道，没有发光胶会延迟再上皮化;有趣的是，添加Lumican可以加速再上皮化过程⁴，^11，13。同样，最近的一项研究报告说，Lumican可以调节角膜缘成纤维细胞¹⁴的炎症功能，这表明Lumican作为炎症，抗纤维化和再上皮化反应的调节剂发挥作用。同样，lumican可以通过与Fas-FasL等信号分子相互作用来调节角膜反应。此外，在敲除Lum-^/-小鼠模型中没有Lumican表明缺乏lumican信号传导会阻止充分的角膜修复¹⁵。

该方法主要旨在展示一种从AM中提取lumican的可行且平易近人的方法。与以前的研究相比，使用这种有利的lumican提取方法可以获得相似浓度的蛋白质，从而减少了处理时间，并使研究人员更方便¹⁶。此外，这种AME发光胶可用作角膜修复和再上皮化过程的佐剂。

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研究方案

所有实验程序均已获得机构审查委员会的批准（项目编号:CEI-2020/06/04）。AM是从瓦伦西亚孔德羊膜库（来自去识别的人类受试者）获得的，该数据库是按照Chávez-García等人的描述制备的¹⁷。

1.羊膜提取物的制备

1. 从羊膜库获取 100 毫克 AM。
   注意:根据之前的报告，50 毫克 AM 总共分泌 10 ng/mL 的卢米康¹⁴。为了获得更高浓度的lumican，请使用100mg的AM，相当于总面积为32cm²。
2. 如果AM被冷冻，请在室温下解冻。
   注意:在 II B 级层流罩下执行以下步骤。
3. 用10mL无菌平衡盐溶液（BSS，参见 材料表）在培养皿中洗涤AM2分钟。
   1. 将 BSS 倒入烧杯中。
   2. 重复步骤3并目视确认培养皿BSS中不存在甘油培养基。
      注:重复步骤 3。根据需要，直到培养皿BSS中不存在甘油培养基。
4. 将AM与10mL分散酶II（1.7IU / mL，参见 材料表）在37°C，5%CO₂ 下孵育30分钟。
   注意:分散酶II是一种中性蛋白酶，对上皮细胞具有温和的活性。该酶有效地将完整的表皮与真皮分离，并分离完整的上皮片¹⁸。
5. 分散酶孵育后，用橡胶警察进行机械去上皮化¹⁴ （见 材料表）。通过显微镜可视化确认去上皮化。
   注意:去上皮化过程在使用4x和20x物镜的倒置显微镜中得到证实。可视化组织以排除任何细胞层的存在。
6. 用10mL BSS在培养皿中洗涤AM2分钟。将 BSS 倒入烧杯中。
7. 将去上皮化的AM（dAM）放入2 mL微量离心管中。将dAM浸入液氮中40分钟。
8. 在-85°C的预冷砂浆中手动研磨冷冻dAM2-3分钟，直到获得细粉。
9. 在研钵中，用 2.5 mL 蛋白酶抑制剂溶液（含蛋白酶抑制剂的 BSS）溶解 dAM 粉末。
   注意:每片蛋白酶抑制剂由以下酶混合物组成:胰腺提取物（0.02mg / mL），热溶酶（金属蛋白酶）（0.0005mg / mL），胰凝乳蛋白酶（0.002mg / mL），胰蛋白酶（0.02mg / mL）和木瓜蛋白酶（0.33mg / mL）（参见 材料表）。
10. 用微量移液管收集混合物，并在手术刀的帮助下清洁砂浆壁。将混合物放入 5 mL 管中。
11. 与涡旋充分混合30秒。
12. 通过在4°C下以34×g离心20分钟，并立即在4°C下以3360×g离心20分钟，使组织混合物匀浆。
13. 收集的上清液是AME（图1）。将 0.7 mL 的每个 AME 储存在不同的 2 mL 微量离心管中，在 -20 °C、4 °C 和室温 （RT） 的不同温度条件下储存 6、12、20 和 33 天。

图1:AME制备和lumican浓度测量的过程 。 将100mgAM与分散酶II在37°C孵育30分钟并机械去上皮化。将去上皮化的AM洗涤并浸入液氮中40分钟，然后粉碎直至得到细粉，用2.5mL盐水缓冲液与蛋白酶抑制剂溶解并离心。收集上清液并在-20°C，4°C和室温下储存6，12，20和32天，直到总蛋白质和Lumican定量。 请点击此处查看此图的大图。

2. AME蛋白定量

注意:AME中总蛋白的定量必须在获得后立即进行。使用Lowry蛋白测定法定量蛋白质，并遵循制造商的说明（参见 材料表）。建议将所有标准品和样品一式三份测定。

1. 将 40 μL 每个 AME 样品移液到 96 孔微孔板中。
   1. 使用牛血清白蛋白（BSA）标准品制备到同一微孔板中的标准曲线，最终BSA浓度为0-1，500μg/ mL（0，1，5，25，250，500，750，1，000和1，500μg/ mL）。
2. 将 200 μL 改良的 Lowry 试剂移液到每个孔中。立即在平板搅拌机上混合30秒。
3. 用铝箔覆盖微孔板，并在室温下孵育10分钟。
4. 将 20 μL 1x Folin-Ciocalteu 试剂移液到每个孔中。立即在平板搅拌机上混合30秒。
   注意:要制备 1x Folin-Ciocalteu 试剂，请用超纯水 1:1 稀释 2x （2N） 试剂。在使用当天准备1x Folin-Ciocalteu试剂，因为稀释的试剂不稳定。
5. 用铝箔从光上覆盖微孔板，并在室温下孵育30分钟。
6. 在ELISA板光谱仪中测量660nm处样品的吸光度（参见 材料表）。
   注意:可以在 650 nm 和 750 nm 之间的波长下测量颜色。
7. 平均标准空白样品的660 nm吸光度值，并从标准和未知样品的其他660 nm值中减去该值。
   1. 用ELISA板光谱仪在端点模式下以低振荡10秒测量吸光度。
8. 使用标准曲线确定每个未知样品的蛋白质浓度。
9. 对于蛋白质的计算，使用Y轴上的吸光度值与每条标准BSA曲线X轴上的mg / mL浓度（以mg / mL为单位）从线性回归图中确定浓度。
   1. 得到线性回归方程和r值来计算蛋白质浓度。
      注意:结果表示为总蛋白质相对于mg AM 的标准化相对浓度值（μg/mL 蛋白质/mg AM 组织）。

3. AME中Lumican的定量

注意:必须在不同储存条件和时间段储存的AME中测量Lumican的浓度。使用三明治ELISA量化Lumican并遵循制造商的说明。建议将所有标准品和样品一式两份测定。

1. 将人lumican捕获抗体（参见 材料表）稀释至磷酸盐缓冲盐水（PBS）中采用的浓度。
   注意:捕获抗体瓶含有120μg抗体。用 0.5 mL PBS 复溶后，在 2 μg/mL 的工作溶液中稀释捕获抗体。
   1. 立即将每孔 100 μL 稀释的捕获抗体移液至 96 孔微孔板中。封闭板并在室温下孵育过夜。
2. 吸出每个孔，并使用多通道移液器用 300 μL 洗涤缓冲液:0.05% 聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯 20 在 PBS、pH 7.2-7.4（参见 材料表）中移液洗涤。重复三次。
   注意:最后一次洗涤后，将盘子翻出，然后轻轻拍打纸巾，以去除任何剩余的洗涤缓冲液。
3. 通过向每个孔中加入 300 μL 试剂稀释剂来封闭板:PBS 中的 1% BSA，pH 7.2-7.4，0.2 μm 过滤（参见 材料表）。在室温下孵育1小时。
4. 重复步骤 2。
5. 使用0-8，000 pg/mL的两倍连续稀释液将标准曲线制备到96孔微孔板中，最终浓度为125、250、500、1，000、2，000、4，000和8，000 pg/mL。ELISA夜光聚糖试剂盒包含75 ng的重组夜光聚糖标准品（见 材料表）。
6. 在捕获抗体包被的 96 孔微孔板中加入 100 μL 样品和标准曲线。
7. 盖上微孔板，在室温下在紧凑型摇臂中以低搅拌孵育2小时，保持速度在2-3rpm之间。
8. 重复步骤 2。
9. 向每个孔中加入 100 μL 生物素化检测抗体（参见 材料表）。从光中盖上，并在室温下在紧凑型摇臂中以低搅拌孵育2小时，保持速度在2-3rpm之间。
   注意:生物素化检测抗体瓶含有24μg抗体。用 1.0 mL 试剂稀释剂复溶后，在 400 ng/mL 的工作溶液中稀释生物素化检测抗体。
10. 重复步骤 2。
11. 向每个孔中加入 100 μL 链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP，参见 材料表）的工作稀释液。从光上覆盖微孔板并在室温下孵育20分钟。
    注意:反应性链霉亲和素 HRP 的浓度为 40 倍。工作溶液1x链霉亲和素-HRP用试剂稀释剂制成。
    注意:避免将板放在直射光下。
12. 重复步骤 2。
13. 最后，向每个孔中加入 100 μL 底物四甲基联苯胺（TMB，参见 材料表）溶液。
    注意:用试剂盒中提供的等体积的稳定过氧化氢30%溶液制备TMB溶液。
    注意:使用前立即准备溶液并将其保持在室温下。
14. 在室温下在黑暗的地方孵育30分钟。
    注意:避免将板放在直射光下。不要吸出TMB溶液，因为不需要进一步洗涤。
15. 加入 50 μL 1N H₂SO₄ 终止液以停止比色反应。轻轻敲击盘子以确保充分混合。
16. 立即使用ELISA板光谱仪中设置为450nm的酶标仪确定每个孔的吸光度。
17. 用ELISA板光谱仪在端点模式下以低振荡10秒测量吸光度。
18. 平均标准空白样品的450 nm吸光度值，并从标准和未知样品的其他450 nm值中减去它。
19. 使用标准曲线确定每个未知样品的lumican浓度。
20. 为了计算Lumican浓度，使用Y轴上的吸光度值与每条标准lumican曲线X轴上的pg/mL浓度进行线性回归图。
    1. 得到线性回归方程和r值来计算发光胶浓度。
       注意:卢米康的浓度相对于提取的组织毫克标准化。结果表示为lumican与mg AM（ng / mL lumican/mg AM组织）的标准化相对浓度值。

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结果

结果报告为标准偏差 （SD） ±平均值。进行学生的 t检验和方差分析（方差分析）。 < 0.05 的 P 值被认为具有统计学意义。使用统计软件进行统计分析（见 材料表）。

AME中的总蛋白质量受时间和储存条件的影响。所有AME的基础蛋白浓度相似;总蛋白的范围为2.7±0.3μg/mL，评估的样品之间没有显着差异。然而，当样品储存12、20和32天时，观察到蛋白质浓?...

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讨论

本研究分析了AME中Lumican的存在及其在不同储存条件下的稳定性的直接相关性。有趣的是，当AME中的总蛋白质浓度被量化时，储存后蛋白质浓度增加。有证据表明，有三种机制可以改变冷冻储存中的蛋白质浓度:冷变性、溶质的冷冻浓度和冰诱导的蛋白质结构部分展开¹⁹。由于样品中液相的结晶，冷冻过程可能会影响储存样品上的蛋白质浓度。结果表明，这可能是冷冻浓度的过程，...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N H2SO4 stop solution	R&D Systems	DY994
100 μL micropipette	Eppendorf
1000 μL micropipette	Eppendorf
15 mm Petri dish	Symlaboratorios
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm)	BD Becton Dickinson	305211
2 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	Z606340
20 mL plastic syringe	BD Becton Dickinson	302562
20 μL micropipette	Eppendorf
20-200 μL micropipette	Eppendorf
5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	30119401
96-well microplate	SARSTEDT	821581
Aluminum foil	N/A	N/A
Amniotic membrane	Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank		100 mg
Balanced salt solution	Bausch + Lomb	BSS-403802
Beaker	N/A	N/A
BioRender	BioRender		figures design
Compact Rocker	BioRad	970822DD	Mod. 5202SD-BIO
complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11 873 580 001	Protease Inhibitor
Daiggner vortex Genie 2	A.Daigger & Co. , INC	22220A
Dispase II	Gibco	17105-041
ELISA plate spectrometer	Thermo Labsystems	35401106	Multiscan
Freezer
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	version 9	statistical analysis and graphic program
Human lumican DuoSet ELISA kit	R&D Systems	DY2846-05	includes human Lumican capture antibody
Incubator	Forma Scientific	3326 S/N 36481-7002
Inverted light Microscope	Olympus	6A13921	to confirm de-epithelialization  Mod.CK2
Laminar flow hood	Forma Scientific	14753-567	Mod.1184
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mortar	N/A	N/A
Multi-channel pipettor	Eppendorf
Nitrogen Tank	Thermo Scientific		Mod. Biocan 20
Paper towels	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline	R&D Systems	DY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23240
Plate sealers	R&D Systems	DY992
Reagent diluent	R&D Systems	DY995	1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered
Refrigerated centrifuge	centurion scientific Ltd	15877	Mod. K2015R
Rubber policeman cell scraper	NEST	710001	for mechanical de-epithelialization
Scalpel knife	Braun	BB521	No. 10 or 21
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated	R&D Systems	part 893975
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution	R&D Systems	DY999
Toothed tweezers	Invent Germany	6b	inox
Ultrapure water	PISA
Wash buffer	R&D Systems	WA126	0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4