Извлечение люмикана из амниотической мембраны и определение температуры ее хранения

Резюме

Настоящий протокол описывает извлечение люмиканов из амниотической мембраны (AM) и условия их хранения в виде экстракта AM (AME) при -20 °C, 4 °C и комнатной температуре (RT) в течение 6, 12, 20 и 32 дней для количественной оценки его белков и концентрации люмиканов.

Аннотация

Люмикан представляет собой небольшой богатый лейцином протеогликан в амниотической мембране человека (АМ), который способствует эпителизации роговицы и организации коллагеновых волокон, поддерживая прозрачность роговицы. В настоящей работе предложен способ экстракции белка из АМ для получения люмикана. Кроме того, оценивается стабильность люмикана в экстракте AM (AME), хранящемся при различных температурах и периодах времени. 100 мг АМ размораживали и механически деэпителизировали. Деэпителиализованный АМ замораживали и измельчали до получения мелкого порошка, который солюбилизировали 2,5 мл физиологического буфера с ингибиторами протеазы и центрифугировали для экстракции белка. Супернатант собирали и хранили при -20 °C, 4 °C и комнатной температуре (RT) в течение 6, 12, 20 и 32 дней. После этого люмикан был количественно определен в каждом AME. Этот метод позволяет создать доступный и доступный протокол для извлечения люмиканов из AM. На концентрацию люмикана влияли время хранения и температурные условия. Люмикан в АМЕ 12 дней хранился при -20 °C и 4 °C был значительно выше, чем в других AME. Эта экстракт люмикана может быть полезна для разработки методов лечения и фармацевтических решений. Необходимы дальнейшие исследования для определения использования люмикана AME в процессе реэпителизации и заживления ран.

Введение

Одним из наиболее часто используемых методов лечения поражений роговицы является трансплантация амниотической мембраны; однако в последние годы появились новые предложения по использованию различных компонентов амниотической ткани в качестве альтернативных и адъювантных методов лечения. К числу наиболее изученных компонентов АМ относятся те, которые получены из экстракта АМ (АМЕ)1,2,3,4,5,6,7. AM содержит множество растворимых факторов, т....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным наблюдательным советом (проект No CEI-2020/06/04). AM был получен из Банка АМТа Офтальмологии Валенсии (из деидентифицированных людей), который подготовлен, как описано Чавесом-Гарсией и ^др.17.

1. Приготовление экстракта амниотической мембраны

1. Получают 100 мг АМ из амнионного банка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно предыдущему отчету, 50 мг АМ секретирует в общей сложности 10 нг/мл люмикана¹⁴. Для получения более высокой концентрации люмикана используют 100 мг АМ, что эквивалентно общей площади 32^см2.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Результаты сообщаются как среднее значение ± стандартного отклонения (SD). Были проведены студенческие т-тесты и анализ дисперсии (ANOVA). P-значения < 0,05 были признаны статистически значимыми. Статистический анализ проводился с использованием статистического программного обесп?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В данном исследовании анализировалось наличие люмикана в АМЕ и его прямая корреляция с его стабильностью при различных условиях хранения. Интересно, что когда общая концентрация белка в АМЕ была количественно определена, концентрация белка увеличивалась после хранения. Данные свидет.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N H2SO4 stop solution	R&D Systems	DY994
100 μL micropipette	Eppendorf
1000 μL micropipette	Eppendorf
15 mm Petri dish	Symlaboratorios
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm)	BD Becton Dickinson	305211
2 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	Z606340
20 mL plastic syringe	BD Becton Dickinson	302562
20 μL micropipette	Eppendorf
20-200 μL micropipette	Eppendorf
5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	30119401
96-well microplate	SARSTEDT	821581
Aluminum foil	N/A	N/A
Amniotic membrane	Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank		100 mg
Balanced salt solution	Bausch + Lomb	BSS-403802
Beaker	N/A	N/A
BioRender	BioRender		figures design
Compact Rocker	BioRad	970822DD	Mod. 5202SD-BIO
complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11 873 580 001	Protease Inhibitor
Daiggner vortex Genie 2	A.Daigger & Co. , INC	22220A
Dispase II	Gibco	17105-041
ELISA plate spectrometer	Thermo Labsystems	35401106	Multiscan
Freezer
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	version 9	statistical analysis and graphic program
Human lumican DuoSet ELISA kit	R&D Systems	DY2846-05	includes human Lumican capture antibody
Incubator	Forma Scientific	3326 S/N 36481-7002
Inverted light Microscope	Olympus	6A13921	to confirm de-epithelialization  Mod.CK2
Laminar flow hood	Forma Scientific	14753-567	Mod.1184
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mortar	N/A	N/A
Multi-channel pipettor	Eppendorf
Nitrogen Tank	Thermo Scientific		Mod. Biocan 20
Paper towels	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline	R&D Systems	DY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23240
Plate sealers	R&D Systems	DY992
Reagent diluent	R&D Systems	DY995	1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered
Refrigerated centrifuge	centurion scientific Ltd	15877	Mod. K2015R
Rubber policeman cell scraper	NEST	710001	for mechanical de-epithelialization
Scalpel knife	Braun	BB521	No. 10 or 21
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated	R&D Systems	part 893975
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution	R&D Systems	DY999
Toothed tweezers	Invent Germany	6b	inox
Ultrapure water	PISA
Wash buffer	R&D Systems	WA126	0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4