从单个骨骼肌中分离静止干细胞群

摘要

该协议描述了从小鼠的单个骨骼肌中分离肌肉干细胞和纤维脂肪祖细胞。该方案涉及单肌肉解剖、通过荧光活化细胞分选分离干细胞、通过免疫荧光染色进行纯度评估以及通过 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入测定法定量测量 S 期进入。

摘要

骨骼肌含有不同的成体干细胞群，有助于组织的稳态和修复。骨骼肌干细胞（MuSCs）具有制造新肌肉的能力，而纤维脂肪祖细胞（FAPs）有助于基质支持组织并具有制造成纤维细胞和脂肪细胞的能力。MuSC和FAP都处于延长的可逆细胞周期退出状态，称为静止。静止状态是其功能的关键。静止干细胞通常从单个样品中汇集在一起的多个肌肉组织中纯化。然而，最近的研究表明，从不同肌肉分离的MuSCs的分子谱和静止深度存在明显差异。本协议描述了从单个骨骼肌中分离和研究MuSC和FAP，并提出了进行干细胞活化分子分析的策略。它详细介绍了如何分离和消化不同发育起源、厚度和功能的肌肉，例如横膈膜、三头肌、腹股细肌、前胫骨 （TA）、腓肠肌 （GA）、比目鱼肌、指长伸肌 （EDL） 和咬肌。MuSC 和 FAP 通过荧光激活细胞分选 （FACS） 纯化，并通过免疫荧光染色和 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 （EdU） 掺入测定进行分析。

引言

由于肌肉干细胞（MuSCs）的存在，骨骼肌具有很高的再生能力。MuSC位于肌纤维上，基底层下方，并且处于延长的可逆细胞周期出口¹，²，^3，4的静止状态。损伤后，MuSCs激活并进入细胞周期，产生扩增的祖细胞，这些祖细胞可以分化和融合形成新的肌纤维^2，5。先前的工作表明，MuSCs对于肌肉再生是绝对必要的⁶，^7，8。此外，单个MuSC可以移植并产生新的干细胞和新的肌纤维⁹。骨骼肌还含有一组间充质基质细胞，称为纤维脂肪祖细胞（FAP），它们在肌肉再生期间支持MuSC功能中起着至关重要的作用⁶，^10，11，12。

由于它们具有协调肌肉再生的潜力，人们对了解MuSC和FAPs如何工作产生了极大的兴趣。静态MuSC由转录因子Pax7和Sprouty1以及细胞表面蛋白降钙素受体的表达标记，而静止的FAP由细胞表面蛋白血小板衍生生长因子受体α（PDGFRa）¹⁰，¹²，^13，14，15标记.先前的研究表明，可以使用细胞表面标志物和荧光激活细胞分选（FACS）从骨骼肌中纯化MuSCs和FAPs9，15，^16，17，¹⁸，¹⁹，^20，21。虽然这些协议极大地提高了研究MuSC和FAP的能力，但一个缺点是大多数这些协议需要从不同肌肉组织的池中分离MuSC。我们和其他人最近的工作揭示了从不同组织分离的MuSC之间的细胞表型和基因表达水平的差异^22，23。来自横膈膜、三头肌和腹股细肌的 MuSC 比来自下后肢肌肉的 MuSC 活化更快²²，而来自眼外肌的 MuSC 比来自横膈膜和下后肢肌肉的 MuSC 分化更快²³。

该协议描述了从单个骨骼肌中分离MuSC和FAP（图1）。这包括横膈肌、三头肌、腹股细肌、胫骨前肌 （TA）、比目鱼肌、长指伸肌 （EDL）、腓肠肌 （GA） 和咬肌的解剖。随后使用胶原酶II（一种特异性靶向胶原蛋白中Pro-X-Gly-Pro氨基序列的蛋白酶，能够降解结缔组织和组织解离²⁴）和分散酶（一种切割纤连蛋白和胶原蛋白IV的蛋白酶，能够进一步解离细胞²⁵）通过酶消化解离解剖肌肉).MuSC和FAP通过FACS从单细胞悬浮液中分离出来。作为细胞分析下游测定的示例，通过测定5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入来确定干细胞活化，而细胞纯度通过细胞类型特异性标记物Pax7和PDGFRa的免疫荧光染色来确定。

研究方案

本协议是根据奥胡斯大学的动物护理指南和当地道德法规执行的。

注意:确保遵守当地动物实验和死后啮齿动物样本处理伦理委员会的规定。小鼠是过敏原的潜在来源;如果可用，请打开排气通风并将其放置在工作区上方，以避免过度接触过敏原。或者，如果定期进行实验，请戴上口罩。该协议涉及使用锐器，建议研究人员熟悉在割伤情况下进行急救的程序和后勤工作。

1. 准备（1-2小时;解剖前一天）

注意:除非另有说明，否则溶液，板和培养基在无菌条件下制备，并在使用前过滤（0.45μm）。制备分散酶（PBS中的11U / mL）和胶原酶II（PBS中的1.000 U / mL）的储备溶液，并将其储存在-20°C（表1）。在步骤4.2.6中解冻并用于二次消化。

1. 96孔半面积板的胶原蛋白涂层
   1. 准备酸性水。在 2 L 烧杯中将 5.15 mL 冰醋酸加入 895 mL 高压灭菌水中。
   2. 使用 0.45 μm、500 mL 过滤单元过滤溶液。将 800 mL 过滤后的酸性水转移到 1 L 瓶中。
   3. 向瓶中加入 40 mL 无菌胶原蛋白储备溶液。通过旋转轻轻混合溶液并储存在4°C，避光，直到使用。
   4. 用胶原蛋白涂覆一个或多个 96 孔半面积板。向每个孔中加入50μL胶原蛋白涂层溶液，并在4°C下将板涂覆过夜（ON）。
   5. 第二天使用基于真空的吸液器吸出胶原蛋白溶液，并通过加入 100 μL 高压灭菌水并吸吸来洗涤板 2 倍。
   6. 倾斜板盖，让板在罩中干燥20-30分钟。
   7. 当板完全干燥时，将其包裹在铝箔中，并在4°C下储存直至使用。涂层板可保存长达 4 周。
      注意:胶原蛋白涂层使细胞粘附。洗掉游离胶原蛋白很重要，因为它可能会干扰细胞功能和信号传导（例如，胶原蛋白V与MuSC上的降钙素受体结合）²⁶。

2.准备（0.5小时;解剖当天）:

1. 准备其他解决方案和工作空间
   1. 通过将 50 mL 马血清和 5 mL 笔/链球菌加入 445 mL 的 HAM F10 培养基中来制备无菌洗涤培养基。在层流罩中工作以防止污染。
   2. 计算并称量制备解离缓冲液所需的适量的胶原酶II。（对于每只小鼠，使用26，000单位胶原酶II在650U / mL胶原酶II下制备40mL解离缓冲液）。将称量的粉末加入 50 mL 锥形管中，并将其储存在冰上。
   3. 准备两个 10 厘米的菜肴以隔离肌肉。将3mL洗涤培养基（表1）倒入每个培养皿中。将 10 厘米的培养皿放在层流罩外以备后用。
   4. 准备肌肉消化的材料。根据样品数量，标记适当数量的 50 mL 锥形管（每只小鼠八个，每块肌肉一个），并将它们放在工作台上。用70%乙醇（每只小鼠8个，每块肌肉一个）喷洒针头，10 mL注射器和40μm细胞过滤器，并将它们带入层流罩内。将针头连接到注射器上。
   5. 准备要分类的材料。根据样品数量标记带有细胞过滤器盖的 5 mL 圆底管。用铝箔覆盖管子，并将它们留在层流罩中。
   6. 根据要分选的样品和群体的数量，用500 μL洗涤培养基制备1.5 mL微量离心管用于细胞收集（每只小鼠16个，每个肌肉组织每个细胞群一个管）。将这些试管存放在冰上。

3. 肌肉解剖（20-30分钟）

注意:协议的这一部分是在非无菌环境中进行的。该过程可以使用一只或几只小鼠进行。但是，一只鼠标足以准备样品以进行分类和控制，以设置补偿和FACS门。

1. 开始肌肉隔离
   1. 准备非无菌工作区以进行解剖和肌肉隔离。用70%乙醇消毒工作站。在工作站上放置无菌保护一次性垫。
   2. 使用永久性记号笔，在培养皿盖上为每块肌肉画一个盒子，以便稍后放置分离的肌肉。
   3. 用70%乙醇喷洒手术器械。
   4. 通过吸入CO₂ 和/或颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
   5. 隔离单个肌肉（如果使用多只小鼠，则一次从一只鼠标中分离出来）。用70%乙醇喷洒小鼠以润湿皮毛并对皮肤进行消毒。将鼠标放在垫子上，腹部朝上。所有八块肌肉及其各自解剖位置的概述如图 2A所示。
2. 隔离腹股细肌
   1. 用一把剪刀在腹部皮肤上做一个0.5厘米的水平切口。
   2. 去除皮肤:用双手，用拇指和食指抓住切口的上部和下部。拉动切口的每一侧，撕裂并分开躯干和下肢的皮肤。拉下下肢的皮肤，露出双后肢（从臀部到脚趾向下）。同样，向上拉以露出躯干。
   3. 找到腹股细肌（大腿内侧）。使用弯曲的镊子，抓住腹股沟并稍微抬起肌肉（图2B）。用剪刀做一个0.5厘米的切口（图2C），从中切出细小肌并完全隔离（图2D）。对另一条腿重复此操作以隔离第二股细肌。
3. 隔离 TA 和 EDL 肌肉（下后肢、腹侧）
   1. 使用手术刀，沿着胫骨外侧（最厚的下后肢骨）切开 0.5 厘米的切口来切开筋膜。使用弯曲的镊子抓住筋膜并拉动以将其移除。
      注意:当筋膜完全切除后，后腿远端的肌腱可见，可以分离。
   2. 使用带有超细尖端的直镊子进入TA的远端肌腱（胫骨外侧）和EDL（TA下方）（图2E-G）。
      注意:根据经验，可以使用手术刀刀片的钝端代替直镊子。
   3. 将镊子滑向肌肉的近端以分离肌肉。
   4. 将直镊子放回远端。切断远端肌腱。
   5. 用弯曲的镊子轻轻抓住肌肉的远端肌腱。将肌肉向上抬起并越过其近端附着点，并小心地将近端肌腱切得尽可能靠近其附着点。切开另一端并将TA转移到培养皿中。
   6. 使用带有超细尖端的直镊子进入EDL远端肌腱下方。
   7. 将镊子滑向肌肉的近端以分离肌肉。
   8. 将直镊子放回远端。在不损伤肌肉的情况下切断远端肌腱。
   9. 用弯曲的镊子轻轻抓住EDL的远端肌腱。将肌肉向上抬起并越过其近端附着点，并小心地将近端肌腱切得尽可能靠近其附着点。切开另一端并将EDL转移到培养皿中。对另一个后肢重复此操作以隔离第二块 TA 和 EDL 肌肉。
4. 隔离GA和比目鱼肌（下后肢，背侧）
   1. 使用带有超细尖端的直镊子进入跟腱和下后肢骨之间。
   2. 将镊子滑向肌肉的近端以分离肌肉。
   3. 将直镊子放回远端。切断远端肌腱。
      注意:为了避免损坏位于GA下方的比目鱼肌，请尽可能靠近其远端跟腱附着物，留下一大块肌腱附着在GA上（图2H）。
   4. 为了显示和隔离比目鱼肌，将GA向上拉到腓骨（下后肢两块骨中最薄的骨头）上。
      注意:比目鱼肌的特征是相对于GA的特征性深红色（图2I）。
   5. 找到比目鱼肌腱近端。用直镊子，放在比目鱼饼和GA之间。
   6. 将镊子移向肌肉的远端，以将比目鱼卵管与GA分开。
   7. 首先分离比目鱼。切开它的近端肌腱，用弯曲的镊子抓住肌腱，然后小心地抬起比目鱼肌以进入其远端肌腱。切开远端肌腱以将比目鱼肌与GA隔离。 将比目鱼肌放入带有洗涤介质的培养皿中（图2J）
   8. 切下GA并将其放入培养皿中。对另一条腿重复此操作以隔离第二比目鱼肌和GA肌肉。
5. 隔离三头肌（上前肢、背侧）
   1. 使用带有超细尖端的直镊子进入三头肌和肱骨（大前腿的主要骨）之间（图2K-M）。
   2. 将镊子滑向肌肉的近端以分离肌肉。切开肌肉的近端。
   3. 用弯曲的镊子抓住三头肌的近端，将其向上拉过肘部以进入远端肌腱。切开三头肌的远端肌腱，将肌肉转移到培养皿中，然后对另一前肢重复该过程。
6. 隔离咬肌
   1. 去除下巴上的皮毛和皮肤。用剪刀做一个0.5厘米的水平切口。用双手，用拇指和食指捏住切口的每一侧。向上和向下拉动去除皮肤。
   2. 找到咬肌的主要肌腱（尾部，眼睛下方）。将扁平手术刀刀片插入骨骼和肌肉之间（图2N）。切断肌腱。
   3. 用弯曲的镊子抓住主要的咬肌腱。用手术刀刀片或剪刀沿嘴部方向切割它，将咬肌与颌骨分开（图2O，P）。将分离的咬肌放入培养皿中。对第二块咬肌重复该过程。
7. 隔离横膈肌
   注意:隔离横膈肌时，请务必小心切割以避免切入内部器官和肠道，因为这是污染源。
   1. 使用剪刀在胸骨中间（位于胸部中间的长扁骨，连接肋骨）进行开胸术（肋骨之间的切口）并切开胸骨（图2Q）。
   2. 通过切开胸腔 360° 来暴露隔膜。
   3. 将上半身与下半身/腹部分开。用一把剪刀剪开气管、食道、腔静脉和腹主动脉。
   4. 将隔膜与下半身分开。使用剪刀在胸骨下方1厘米处进行剖腹手术（腹腔手术切口），并进行360°切口（图2R）。
   5. 将闭合的剪刀放在胸腔和腹部器官之间，然后向下按压。轻轻拉动胸腔，将其与腹部器官分开（图2S）。
   6. 将隔膜与肋骨分开。用两根手指松散地握住横膈膜，用剪刀剪开胸腔。使用剪刀在 360° 切割中尽可能靠近肋骨的隔膜。将分离的隔膜放入培养皿中。
      注意:在颈椎脱位期间，横膈膜可能会破裂并塌陷在胸腔上，使其难以定位。肌肉仍然可以被隔离。识别塌陷的肌肉，将其夹在两根手指之间，然后沿着胸腔切开 360°。

4.肌肉消化至单细胞悬液（~1小时35分钟）

注意:以下步骤包括非无菌（步骤4.1-4.2）和无菌工作环境（步骤4.3）。

1. 机械消解
   1. 将孤立的肌肉放在10厘米培养皿的盖子中。
   2. 使用弯曲的镊子，一个接一个地抓住孤立的肌肉。对于比目鱼肌和GA，去除跟腱的剩余部分。
   3. 用剪刀将孤立的肌肉切成大约 1 毫米³ 块，将它们一一切碎。
2. 酶消化
   1. 通过在称重的胶原酶II粉末中加入40 mL冷洗培养基（胶原酶II:洗涤介质中的650 U / mL）来制备肌肉解离缓冲液。
      注意:使用新鲜制备的肌肉解离缓冲液以确保最佳的酶活性。
   2. 将切碎的肌肉转移到含有 5 mL 解离缓冲液的 15 mL 锥形管中。
   3. 将管在37°C振荡水浴中以60rpm孵育35分钟。
   4. 孵育后，加入洗涤培养基至总体积为 15 mL。在4°C下以1，600× g 旋转管5分钟。
   5. 使用基于真空的吸液器将上清液吸出至 4 mL 体积。为避免干扰沉淀，请从顶部缓慢吸出，并去除任何漂浮的脂肪。
   6. 解冻分散酶和胶原酶II的等分试样。向剩余的 4 mL 样品中加入 500 μL 胶原酶 II 溶液（1，000 U/mL 储备液，-20 °C）。接下来，加入 500 μL 分散酶溶液（11 U/mL 储备液，-20 °C）。
      注意:分散酶会产生沉淀物。如果发生这种情况，请在使用前1分钟以10，000× g旋转分散酶储备溶液。将现在透明的上清液转移到细胞悬液中，而不会干扰沉淀。
   7. 短暂涡旋样品以溶解沉淀。
   8. 将样品在37°C振荡水浴中以60rpm孵育20分钟。
      注意:消化大量肌肉样本非常耗时。对于步骤4.3.1-4.3.6，估计每个样品需要2-5分钟。当由两个或多个研究人员并行执行时，此步骤会更快。
3. 样品均质化
   1. 均质化细胞悬液。将悬浮液从 15 mL 管转移到 50 mL 管中。使用带有 20G 针头的 10 mL 注射器，通过将样品上下拉动针头 5 次来重悬样品。
      注意:如果未消化的肌肉块堵塞了针头，请用纸巾擦拭。
   2. 将 40 μm 细胞过滤器放在新的 50 mL 锥形管上。
   3. 在注射器中取出完整的细胞悬液，并将样品过滤到一个新的 50 mL 锥形管中，顶部有一个细胞过滤器。通过将总体积直接分配到过滤器上来过滤样品。
   4. 要检索所有单核细胞，将 20 mL 洗涤介质添加到空锥形管中，并通过细胞过滤器将其倒入包含过滤样品的 50 mL 锥形管中。用p1000移液器取出细胞过滤器下的剩余体积。
   5. 丢弃细胞过滤器并在4°C下以1，600× g 旋转样品5分钟。
   6. 通过用p1000移液器移液，在不干扰沉淀的情况下吸出上清液。
   7. 通过使用 p1000 移液器移液，将隔膜沉淀重悬于 500 μL 洗涤介质中，并将其他肌肉样品分别重悬于 300 μL 洗涤介质中。
      注意:隔膜是干细胞含量最高的最大肌肉，因此可用于对照染色。

5. 染色和分选（~40 分钟 + 30 分钟分选/样品）

注意:在冰上无菌环境中工作以下步骤。

1. 将 50 μL 等分试样隔膜细胞悬液转移到四个新的 2 mL 微量离心管中，用于对照染色（每个 50 μL）。向每个对照管中加入 250 μL 洗涤介质，最终体积为 300 μL。
2. 向三个对照染色管中加入3μL（1:100）荧光负一抗体（FMO对照），并留下一个没有抗体的试管（未染色对照）（见 表2）。
3. 向剩余的肌肉单细胞悬浮液（包括剩余的隔膜样品）中加入 3 μL （1:100） 抗体（VCAM1-PECy7、CD45-FITC、CD31-FITC 和 SCA1-PacificBlue）。
4. 将细胞悬液在4°C下在头顶摇床中孵育15分钟。
   注意:对照染色对于确定背景荧光水平和设置流式细胞术的门是必要的。可以使用不同的抗体，但每种抗体都有特定的工作浓度和孵育时间，需要进行测试。如果使用来自不同供应商的抗体，则浓度和稀释度可能会有所不同。可以将细胞活力染料添加到染色混合物中，以消除分选过程中的任何死细胞或垂死细胞。
5. 在4°C下以1，600× g 旋转样品5分钟。 弃去上清液而不通过移液干扰沉淀。
6. 通过使用p1000移液器移液，将每个样品重悬于800μL洗涤介质中。
7. 使用带有细胞过滤器帽（40μm）的FACS管过滤样品，以去除任何剩余的细胞团块（或聚集体）。
8. 通过添加额外的 800 μL 洗涤介质来洗涤细胞过滤器。
9. 将样品用铝箔覆盖在冰上直至分析。
   注意:如果此时细胞悬液由于细胞浓度高而显得浑浊/致密，请额外添加 800 μL 洗涤培养基以降低细胞密度。
10. 用 70 μm 喷嘴启动 FACS。
11. 使用未染色和 FMO 对照设置门控策略:MuSC 对 CD45-FITC、CD31-FITC 和 SCA1-PacBlue 呈阴性，对 VCAM1-PECy7 呈阳性;FAPs对CD45-FITC，CD31-FITC，VCAM1-PECy7呈阴性，对SCA1-PacBlue呈阳性。
12. 使用双向分选对染色的单细胞悬浮液进行分选，并将MuSC和FAP收集到含有500μL洗涤介质的单独收集管中。
    注意:使用带有四个激光器的FACS（配置:70μm喷嘴，405nm，488nm，561nm，633nm），所选的荧光团组合不需要补偿荧光信号。但是，如果使用不同的流式细胞仪或不同的荧光团组合，建议使用额外的单染色对照样品进行补偿。从较小的肌肉（EDL，比目鱼肌，TA）中，预计产量为3，000个MuSC和5，000个FAP。对于其他较大的肌肉，预计产量为20，000个MuSC和FAP。FACS软件列出的事件计数可能与收集管中活细胞的实际数量有所不同。细胞数量可以通过使用血细胞计数器进行细胞计数来确认。
13. 在4°C下以1，600× g 旋转分选的细胞5分钟。 通过移液，在不干扰细胞沉淀的情况下吸出上清液。
14. 向每个样品中加入 100 μL 洗涤介质，并小心地重悬细胞，不要产生气泡。将 100 μL 重悬样品转移到涂有胶原蛋白的半区 96 孔板中。每孔板1，000-3，000个细胞。
    注意:如果细胞没有正确重悬，细胞可能会粘在一起，混淆以后的显微镜分析。
15. 在显微镜下检查细胞并注意它们的分布、形状和大小。
16. 将板在37°C，5%CO₂下孵育。细胞将在2小时内粘附。
    注意:建议通过流式细胞术分析（通过在分选机上加载分选样品的等分试样并记录少量事件）或通过对接种细胞进行抗体染色然后进行显微镜检查（Pax7是小鼠MuSCs的定义标记，PDGFRa是小鼠FAP的定义标记物）来确认收集的细胞群的纯度。从下面的第7节开始，是Pax7和PDGFRa蛋白水平的细胞染色方案。

6. EdU掺入测定

注意:在无菌条件下工作，并在处理多聚甲醛（PFA）时使用化学通风橱进行以下步骤。EdU是一种核苷酸类似物，当细胞经历细胞周期的S期时，掺入DNA中。它在高浓度下具有诱变性。处理 EdU 时始终戴手套。查看当地处理教育废物的指南。

1. 教育脉搏（第 1 天）
   1. 在新鲜洗涤介质中制备2x EdU的工作溶液。
   2. 将带有细胞的96孔板取出培养箱。在显微镜下检查细胞以监测汇合度。移入层流罩。
   3. 通过移液从板中取出 50 μL 培养基。加入 50 μL 2x EdU 工作溶液，使孔中的最终体积为 100 μL。
   4. 在EdU存在下在37°C，5%CO₂下培养细胞预定的时间段。
      注意:EdU脉冲的时间和持续时间可能会有所不同。平均而言，静态MuSC需要2天才能完全激活并完成其第一次细胞分裂¹⁹。EdU可以在电镀后立即添加到分选的细胞中。
2. 固定（第2天）
   注意:PFA是一种致癌物质。始终小心处理PFA。熟悉当地处理PFA和处理废物的法规。
   1. 将带有细胞的96孔板取出培养箱。在显微镜下检查细胞并将板移入通风橱。
   2. 通过移液，通过向每个孔中加入 50 μL 4% PFA 来去除培养基并固定细胞。将板在室温（RT）下在化学通风橱中孵育10分钟。
   3. 用移液管取出PFA，然后将其丢弃到适当的废物容器中。
   4. 通过向所有孔中加入 100 μL PBS 来洗涤细胞。通过移液，吸出PBS并重复洗涤。将细胞保存在 100 μL PBS 中。
      注意:为避免洗掉任何细胞，请缓慢移液将PBS分配到孔的一侧。
3. 教育标签
   1. 在 EdU 检测之前，通过去除 PBS 并在 PBS 中加入 100 μL 0.5% Triton X-100 来透化细胞。将板在4°C孵育5分钟。
      注意:Triton X-100 是一种表面活性剂，会引起皮肤刺激。小心处理并始终使用手套。
   2. 5 分钟后，吸出 Triton X-100 并加入 100 μL PBS。
   3. 根据制造商的方案制备 EdU 点击化学反应混合物。
   4. 吸出 PBS 并加入 33 μL 的 EdU 点击化学反应混合物。将板在室温下孵育30分钟。
   5. 吸出 EdU 点击化学反应混合物，并用 100 μL PBS 洗涤细胞。
   6. 吸出 PBS，用 Hoechst （1:2，000） 加入 100 μL PBS，并在室温下避光孵育 10 分钟。
   7. 吸出 Hoechst 并通过加入 100 μL PBS 洗涤两次。将细胞储存在100μL的PBS中，在4°C的黑暗中。
   8. 在倒置显微镜上对细胞进行成像。只要孔不干涸，细胞就可以在黑暗中储存数月。
      注意:可以将细胞与抗体共染色。在这种情况下，继续进行封闭步骤，然后与一抗一起孵育。选择具有偶联荧光团的二抗，其发射光谱与用于检测EdU的荧光团的发射光谱不重叠。确保不要使用荧光团与Hoechst光谱范围重叠的二抗。

7. 免疫荧光染色

注意:协议的这一部分可以独立于第 6 节执行。跳过第 6 节时，请执行步骤 6.3.1 和 6.3.2 以启用细胞透化，然后再继续下面的步骤 7.2。

1. 取出含有EdU标记细胞的板。
2. 通过将 2 mL 驴血清加入 18 mL PBS 中来制备 20 mL 封闭缓冲液。
3. 为防止非特异性抗体结合，从每个孔中取出 100 μL PBS，并用 p200 移液管加入 50 μL 封闭缓冲液。将板在室温下孵育30分钟，避光并用铝箔覆盖，以防止荧光团标记的EdU的光漂白。
   注意:细胞固定在孔底部，但如果移液时施加太大的力，细胞可能会脱落。
4. 在封闭样品的同时，准备一抗混合物。将 8.0 μL （1:100） 小鼠抗 Pax7 和兔抗 PDGFRa 加入 800 μL 封闭缓冲液中，对 16 孔（8 个组织，2 种细胞类型）进行染色。
5. 封闭后，取出驴血清，向每个孔中加入 50 μL 一抗混合物。将板在4°C孵育过夜，用铝箔覆盖。
6. 孵育后，去除一抗并向每个孔中加入 50 μL Triton（PBS 中的 0.5%）。将板在室温下避光孵育5分钟，以洗去未结合的抗体。重复洗涤三次。
7. 通过将 1.0 μL （1:1，000） 驴抗小鼠 Alexa647 和驴抗兔 Alexa555 添加到含有 1，000 μL 封闭缓冲液的微量离心管中来制备二抗预混液。
8. 向每个孔中加入 33 μL 二抗预混液。将板在室温避光下孵育60分钟。
9. 通过移液去除多余的二抗，加入 50 μL Triton（PBS 中的 0.1%），并在室温避光下孵育 5 分钟。重复洗涤三次。
10. 最后，加入 100 μL PBS。决定是使用带有冷却CCD相机的倒置荧光显微镜立即对板进行成像，还是将板储存在4°C，直到以后分析，方法是用封口膜密封板边缘并将密封板包裹在铝箔中。

结果

按照个体骨骼肌分离方案（图2），从三只已从当地育种计划中停止的瑞士雄性远交小鼠中分离出腹股细肌，TA，EDL，GA，比目鱼肌，三头肌，咬肌和横膈肌（图2）。在组织解离和抗体染色后，通过FACS纯化来自单个肌肉的MuSC和FAP（图3）。用未染色的样品获得初始设门，以鉴定细胞并将单体与双峰分离（图3A?...

讨论

执行该协议的几个步骤是实现良好产量的关键。与散装隔离方案中使用的肌肉量相比，单个肌肉的体积较小。这会导致解剖过程中肌肉干燥的风险，从而降低产量。为了防止这种情况，重要的是在解剖后立即向肌肉添加介质。此外，如果解剖需要更长的时间，可以一次从一条肢体上去除皮肤，以减少肌肉暴露在空气中的时间。较小的体积也会导致过度消化的风险增加。为了解决这个问题，与块肌?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile )	Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S	72.706.700	1.5 mL tube
15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)	Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S	62.554.502	15 mL tube
5 mL polystyrene round-bottom tube	Falcon, Fisher Scientific	352054	FACS tube without strainer cap
5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap	Falcon, Fisher Scientific	352235	FACS tube with strainer cap
5 mL tube (PP, non sterile autoclavable)	VWR collection	525.0946	5 mL tube
50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)	Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S	62.547.254	50 mL tube
Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen, Thermo Fisher	Lot: 2387458 (Cat # A31572)
Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L)	Invitrogen, Thermo Fisher	Lot: 2420713 (Cat#A31571)
ARIA 3	BD		FACS, Core facility Aarhus University
Centrifuge 5810	eppendorf	EP022628188	Centrifuge
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye	Invitrogen, Thermo Fisher	Lot: 2387287 (Cat# C10337)	Cell Proliferation Kit
Collagen from calf-skin	Bioreagent, Sigma Aldrich	Source: SLCK6209 (Cat# C8919)
Collagenase type II	Worthington, Fisher Scientific	Lot: 40H20248 (cat# L5004177 )	Collagenase
Dispase	Gibco, Fisher Scientific	Lot: 2309415 (cat# 17105-041 )	Dispase
Donkey serum (non-sterile)	Sigma Aldrich, Merck	Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)
Dumont nr. 5, 110 mm	Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S	1606.327	Straight forceps with fine tips
Dumont nr. 7, 115 mm	Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S	1606.335	Curved forceps
F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine	Gibco, Fisher Scientific	Lot. 2453614 (cat# 31550-023)
FITC anti-mouse CD31	BioLegend, NordicBioSite	MEC13.3 (Cat # 102506)
FITC Anti-mouse CD45	BioLegend, NordicBioSite	30-F11 (Cat# 103108)
Glacial acetic acid (100%)	EMSURE, Merck	K44104563 9Cat # 1000631000)
Head over head mini-tube rotator	Fisher Scientific	15534080 (Model no. 88861052)	Head over head mini-tube rotator
Horse serum	Gibco, Fisher Scientific	Lot. 2482639 (cat# 10368902 )
Isotemp SWB 15	FisherBrand, Fisher Scientific	15325887	Shaking water bath
MS2 mini-shaker	IKA		Vortex unit
Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm)	BD microlance, Fisher Scientific	304827	20G needle
Neutral formalin buffer 10%	CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S	Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)
Non-pyrogenic cell strainer (40 µM)	Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S	83.3945.040	Cell strainer
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)	BioLegend, NordicBioSite	D7 (Cat# 108120)
Pax7 primary antibody	DSHB	Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)
PBS 10x powder concentrate	Fisher BioReagents, Fisher Scientific	BP665-1
PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)	BioLegend, NordicBioSite	429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)
Pen/strep	Gibco, Fisher Scientific	Lot. 163589 (cat# 11548876 )
Pipette tips p10	Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific	2140-05	Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p1000	Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific	2279-05	Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p20	Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific	2149P-05	Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p200	Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific	2069-05	Low retention, pre-sterilized, filter tips
Protective underpad	Abena	ACTC-7712	60 x 40cm, 8 layers
Rainin, pipet-lite XLS	Mettler Toledo, Thermo Scientific	2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05	Pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Recombinant anti-PDGFR-alpha	RabMAb, abcam	AB134123
Scalpel (shaft no. 3)	Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S	1902.502	Scalpel
Scalpel blade no. 11	Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S	1902.0911	Scalpel
Scanlaf mars	Labogene	class 2 cabinet: Mars	Flow bench
ScanR	Olympus		Microscope, Core facility Aarhus University
Scissors	FST	14568-09
Series 8000 DH	Thermo Scientific	3540-MAR	Incubator
Serological pipette 10 mL	VWR	612-3700	Sterile, non-pyrogenic
Serological pipette 5 mL	VWR, Avantor delivered by VWR	612-3702	Sterile, non-pyrogenic
Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile	BD Emerald, Fisher Scientific	307731	Syringe
TC Dish 100, standard	Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S	83.3902	Petri dish
Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20	Corning, Sigma Aldrich	3764	96-well Half bottom plate
Triton X-100	Sigma Aldrich, Merck	Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)