评估豚鼠听觉的瞳孔测量法

摘要

瞳孔测量是一种简单且非侵入性的技术，被提出作为确定正常听力动物和各种听觉病理的动物模型中的噪声听觉阈值的方法。

摘要

噪音暴露是感音神经性听力损失的主要原因。噪声引起的听力损失的动物模型已经对听力损失的潜在解剖学和生理病理学产生了机制见解。然而，将听力损失人类中观察到的行为缺陷与动物模型中的行为缺陷联系起来仍然具有挑战性。在这里，瞳孔测量法被提出作为一种能够直接比较动物和人类行为数据的方法。该方法基于一种改进的古怪范式 - 使受试者习惯于刺激的重复呈现，并间歇性地呈现与重复刺激以某种参数方式变化的偏差刺激。基本前提是，如果受试者检测到重复刺激和偏差刺激之间的变化，它将触发比重复刺激引起的更大的瞳孔扩张反应。这种方法在豚鼠中使用发声分类任务进行了演示，豚鼠是一种广泛用于听觉研究（包括听力损失研究）的动物模型。通过将一个发声类别的发声呈现为标准刺激，将另一个类别的发声呈现为嵌入不同信噪比的噪声中的古怪刺激，证明了响应古怪类别的瞳孔扩张幅度随信噪比单调变化。然后可以使用生长曲线分析来表征这些瞳孔扩张反应的时间过程和统计学意义。在该协议中，描述了使豚鼠适应设置，进行瞳孔测量和评估/分析数据的详细程序。尽管该技术在本协议中在正常听力的豚鼠中得到了证明，但该方法可用于评估每个受试者内各种形式的听力损失的感觉影响。然后，这些影响可能与同时进行的电生理测量和事后解剖观察相关联。

引言

瞳孔直径（PD）可能受到多种因素的影响，随时间变化的PD测量称为瞳孔测量法。PD由虹膜括约肌（参与收缩）和虹膜扩张肌（参与扩张）控制。收缩肌由副交感神经系统支配并涉及胆碱能投射，而虹膜扩张肌由涉及去甲肾上腺素能和胆碱能投射的交感神经系统支配1，^2，3。诱导PD变化的最着名的刺激是亮度收缩，瞳孔的扩张反应可以通过环境光强度的变化产生²。PD也随焦距²而变化。然而，几十年来，人们已经知道PD也显示出与亮度无关的波动⁴，⁵，^6，7。例如，内部精神状态的变化可以引起短暂的PD变化。瞳孔因情绪刺激而扩张，或随着唤醒而增加⁴，⁵，^8，9。瞳孔扩张也可能与其他认知机制有关，例如增加脑力劳动或注意力¹⁰，¹¹，^12，13。由于瞳孔大小变化与精神状态之间的这种关系，PD变化已被探索为临床疾病的标志，例如精神分裂症14，15，焦虑^症16，17，18，帕金森病^19，20和阿尔茨海默病²¹等。在动物中，PD变化跟踪内部行为状态，并与皮质区域的神经元活动水平相关²²，²³，^24，25。瞳孔直径也被证明是小鼠睡眠状态的可靠指标²⁶。这些与唤醒和内部状态相关的PD变化通常发生在几十秒量级的长时间尺度上。

在听力研究领域，在正常听力和听力受损的受试者中，已经使用瞳孔测量法评估了听力努力和听觉感知。这些研究通常涉及训练有素的研究对象²⁷，^28，29，30，他们执行各种检测或识别任务。由于上述唤醒和PD之间的关系，增加的任务参与度和倾听努力已被证明与瞳孔扩张反应增加相关³⁰，^31，32，^33，34，35。因此，瞳孔测量法已被用于证明增加的听力努力用于识别正常听力听众的频谱退化语音^29，36。在听力受损的听众中，例如与年龄相关的听力损失²⁷，30^，37，38，³⁹，^40，41和人工耳蜗使用者^{42，43，瞳}孔反应也随着语音清晰度的降低而增加;然而，与正常听力受试者相比，听力受损的听众在更容易的听力条件下表现出更大的瞳孔扩张27，30^，37，³⁸，³⁹，⁴⁰，⁴¹，^42，43。但是，要求听众执行识别任务的实验并不总是可能的 - 例如，在婴儿或某些动物模型中。因此，在这些情况下，由声学刺激引起的非亮度相关瞳孔反应可能是评估听觉检测的可行替代方法^44，45。早期的研究表明，短暂和刺激相关的瞳孔扩张是定向反射的一部分⁴⁶。后来的研究表明，使用刺激相关的瞳孔扩张来推导出猫头鹰的频率敏感性曲线^47，48。最近，这些方法已被应用于评估人类婴儿瞳孔扩张反应的敏感性⁴⁸。瞳孔测量已被证明是一种可靠且非侵入性的方法，通过使用各种简单（音调）和复杂（GP发声）刺激来估计被动聆听豚鼠（GP）的听觉检测和辨别阈值⁴⁹。这些与刺激相关的PD变化通常发生在几秒钟的较快时间尺度上，并与刺激时间有关。本文提出了刺激相关PD变化的瞳孔测量法，作为研究动物模型中各种听力障碍行为影响的方法。特别是，描述了用于GPs的瞳孔测量方案，一种各种类型的听觉病理学^50，51，^52，53，54，^55，56的成熟动物模型（另见参考文献⁵⁷以获得详尽的综述）。

虽然这种技术在正常听力全科医生中得到了证明，但这些方法可以很容易地适应其他动物模型和各种听觉病理的动物模型。重要的是，瞳孔测量法可以与其他非侵入性测量（如脑电图）以及侵入性电生理记录相结合，以研究可能的声音检测和感知缺陷的机制。最后，这种方法也可用于建立人类和动物模型之间的广泛相似性。

研究方案

对于所有实验程序，请获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并遵守NIH关于实验动物护理和使用指南。在美利坚合众国，全科医生还受美国农业部 （USDA） 法规的约束。该协议中的所有程序均已获得匹兹堡大学IACUC的批准，并遵守NIH关于实验动物护理和使用指南。在本实验中，使用了三个雄性野生型，色素沉着的GPs，年龄在4至10个月之间，体重~600-1，000克。

1. 外科手术

1. 在清醒、头部固定和被动聆听色素 GP 中进行所有瞳孔测量实验。 使用咔嗒声和纯音听脑干反应 （ABR） 记录验证实验对象的正常听力⁵⁸.
   注意:尽管瞳孔测量数据采集本身是非侵入性的，但本协议中使用侵入性头部植入后手术在手术过程中固定动物的头部。"讨论"部分提供了替代方案。
2. 首先，将所有实验动物植入不锈钢头柱，以便在异氟醚麻醉下进行头部固定。使用无菌手术技术将头柱固定在颅骨上，采用骨螺钉和牙科丙烯酸的组合⁵⁸。
3. 为动物提供术后护理，包括全身和局部镇痛药的给药。经过2周的恢复期后，逐渐使动物适应实验设置。
   注意:外科手术基于GPs⁵⁸以及其他物种⁵⁹，⁶⁰中先前发表的方法^，不是本协议的重点。

2. 动物适应实验装置

注意:实验通常在隔音室或隔间中进行（见 材料表）。使动物熟悉设置所需的时间因主题而异。典型的适应时间如下。适应良好的动物将以最小的身体运动耐受头部固定，并导致更好的瞳孔直径测量。

1. 经过2周的恢复期后，首先让动物熟悉处理和运输（2-3天）。这种适应对于减轻压力和焦虑至关重要。为了使动物熟悉处理，请将动物放入其运输容器中增加时间（10-30分钟），并增加处理动物的时间（10-30分钟）。
2. 接下来，通过将动物置于围栏中10-45分钟，使动物适应实验设置（2-3天）（图1A）。围栏必须允许小的姿势变化，以使动物在实验过程中感到舒适。在实验过程中，允许小的姿势变化，以使动物感到舒适。然而，已知瞳孔扩张先于运动⁴⁹。因此，测量动物的运动并在数据分析中考虑这种运动（图1C）。
3. 作为这种适应的一部分，手动处理植入的头部柱，就好像动物将被头部固定一样。保持头柱增加持续时间（10-60 秒）。
4. 手动适应后，根据动物的行为，尝试使用植入物支架将动物头部固定在刚性框架上。
5. 慢慢增加头部固定持续时间（10-45分钟），直到动物在头部固定时平静且相对静止（2-3天）。
6. 使动物适应相机，红外光源和白光源的存在（1-2天）。打开白灯，逐渐增加持续时间（10分钟至30分钟）。
7. 通过在不同声级（1-2天，与步骤2.6同时进行）播放各种声音（例如，纯音，咔嗒声，发声），使动物习惯于声学刺激。为了尽量减少对实验刺激的习惯，请使用与此步骤中瞳孔测量实验计划的声音不同的声音。

3. 瞳孔相机校准

注意:用于瞳孔测量的相机 通过USB将 视频输出到瞳孔测量软件套件。从该视频中，瞳孔测量软件套件使用椭圆拟合和用户可调的阈值提取瞳孔直径（参见 材料表）。然后，软件与数模卡连接。该卡输出与瞳孔直径成比例的模拟电压值。需要校准以将该电压值转换回以长度单位的瞳孔直径。

1. 将一张包含已知直径的黑色圆盘图像的纸放在全科医生眼睛在瞳孔测量期间所在的同一位置。对于GP，PD在4毫米范围内。因此，请使用 3 mm、4 mm 和 5 mm 圆盘进行校准。
2. 将瞳孔测量相机（见 材料表）放置在将进行实验的相同距离（25厘米）处。调整相机光圈和对焦，直到获得已知直径的圆盘的清晰聚焦图像。
3. 在瞳孔采集软件（见 材料表）中，调整阈值，使椭圆的轮廓与成像盘紧密匹配，并记下模拟输出电压值和缩放比例。
4. 对 3 毫米、4 毫米和 5 毫米光盘重复此过程。然后，将对应于模拟输出电压值的实际直径值（以毫米为单位）制成表格。

4. 瞳孔测量数据采集

1. 在隔音室或室内进行所有实验，内壁覆盖有消声泡沫。
2. 对于自由场刺激传递，将校准的扬声器安装在消音室壁上，高度与放置动物的位置相同。
   注意:扬声器的选择取决于所研究的物种和计划的刺激。对于 GP 发声，请使用在 0.5-3 kHz 发声频率范围内具有相对平坦 （±3 dB） 频率响应的全频驱动器扬声器（图 1A）。
3. 将动物放在围栏内，确保无法进行大的身体运动（图1A）。如步骤2中所述将动物的头部固定在刚性框架上（图1A）。
4. 在外壳下方放置一个压电传感器，以检测和记录动物运动（图 1A）。
5. 要设置气吹器，请使用连接到桌面的支架将移液器吸头放在动物鼻子前方 ~15 厘米处。将硅管（~3 mm直径）连接到移液器吸头，并将管连接到调节气缸。
6. 将气缸气压保持在 20 到 25 psi 之间。使用计算机控制的继电器将管子穿过夹管阀以控制气吹的时间和持续时间。
7. 用放置在~10厘米距离处的红外LED阵列照亮眼睛。使用强度为 ~2，000 cd/m² 的白色 LED 照明来照亮成像的眼睛，并使基线 PD 达到 ~3.5 mm。在整个实验过程中保持实验室的恒定照明条件。
   注意:在正常的实验室照明（~500 cd / m²）中，GP瞳孔相当散大，并且不允许观察进一步的刺激相关扩张。通过使用额外的照明，瞳孔被带到~3.5毫米的基线直径，允许足够的动态范围来观察刺激相关的扩张。这也确保了跨会话和主题的一致基线。
8. 打开瞳孔采集软件，使用带有 16 mm 镜头（空间分辨率为 0.15° 视角）和红外 （IR） 滤光片的相机采集瞳孔的视频（90 fps），该镜头放置在距离成像眼睛 25 cm 的距离处。确保眼睛在成像区域中居中。
9. 调节相机的光圈和焦点，以及红外电平，直到成像瞳孔的轮廓清晰对焦。
10. 在瞳孔采集软件中，通过使用鼠标选择一个矩形区域来定义包含瞳孔的感兴趣区域。
11. 使用瞳孔采集软件控制面板调整采集视频的亮度和对比度。将扫描密度设置为 5 并调整阈值，使椭圆拟合与视频中瞳孔的轮廓紧密匹配。
12. 使用神经接口处理器软件，从PD迹线采集并保存模拟信号，从记录运动的压电传感器采集并保存电压迹线，刺激传递时间和空气吹传递时间。

5. 使用改进的古怪范式的呼入噪声检测和分类判别

注意:瞳孔测量实验的刺激包括记录在动物群体中的GP发声⁵⁸。可以在以下存储库中找到发声示例:https://github.com/vatsunlab/CaviaVOX。特别是，使用呜呜声和呜呜声来引发代表性结果中显示的学生反应。从每个类别中，选择长度大致相等的发声。要解释发声的记录振幅和时间包络的差异，如果需要，请按发声的均方根 （r.m.s.） 振幅对发声进行归一化。

1. 使用 MATLAB 以适当的采样率呈现听觉刺激。对于GP，它们是低频听力动物，100 kHz的采样率就足够了。
2. 从两种不同类别的发声（例如，呜呜叫声和呜呜声）中选择八个不同长度的 GP 发声示例。一类（八个示例）将作为标准刺激，另一类（八个示例）将作为古怪或偏差刺激（图2A）。
3. 要生成嵌入在不同信噪比（SNR）水平下的噪声中的1 s长标准和偏差激励，请在呼叫中添加等长的白噪声（门控噪声）。本实验中采样的信噪比范围在-24 dB SNR和+40 dB SNR之间。
4. 使用模块设计，在每个实验会话（~12分钟持续时间）中，获取对应于单个SNR水平的数据。在每个会话中，使用特定SNR下一个发声类别的八个示例作为标准刺激，并使用相同SNR水平的另一个发声类别的八个示例作为偏差刺激。
   注意:典型的实验块持续~12分钟。根据动物的行为和对瞳孔反应的习惯，每天可以获取3-4个块（~45-60分钟）的数据。在整个过程中，通过瞳孔视频、运动轨迹以及直接在块之间密切监控动物。
5. 对于每个会话，准备一个伪随机刺激演示序列，其中包含标准刺激>90%的时间。确保在偏差刺激之间，至少有20个标准刺激的试验（图2B）。
   注意:根据实验的不同，刺激呈现序列中偏差刺激的顺序可以采用拉丁方格设计，以确保每个唯一的偏差刺激在每个会话中占据唯一的顺序位置。因此，对所有会话求平均值可以最小化整个刺激序列中偏差刺激位置的影响。
6. 对所有刺激呈现使用固定的刺激强度（例如，85 dB SPL）。
   注意:使用适当的数模转换器生成音频信号，使用可编程衰减器将其衰减到所需的声级，对信号进行功率放大并使用校准的扬声器（例如，硬件，请参阅 材料表）传输信号。
7. 以高时间规律性呈现刺激（1 s刺激，然后3 s沉默，如代表性结果所示）。
   注意:瞳孔扩张反应缓慢，通常在刺激发作后约1秒达到峰值，大约需要5秒才能恢复到基线⁴⁹。刺激计划呈现率必须足够低，以应对这些缓慢的时间尺度。时间规律性很重要，因为中断时序模式本身可能是一种偏差刺激。
8. 为了保持动物与刺激的接触并尽量减少习惯，可以选择在异常刺激后进行短暂的吹气（100 毫秒）。确保气吹的开始与刺激持续时间（刺激开始后 2.5 秒）充分分离，以便刺激诱发的瞳孔扩张反应在吹气诱导的眨眼伪影之前达到峰值。
   注意:在经典的古怪范式中，不使用正强化或负强化。由于气吹在这里用作轻度厌恶增强以保持动物与听觉刺激的接触，因此该范式被称为改进的古怪范式。

6. 分析与统计

注意:所有分析均使用用 MATLAB 编写的自定义代码（可在 https://github.com/vatsunlab/GP_Pupil 获得）执行。描述了两种主要的分析方法，分别解决了学生反应的可靠性和时间过程。一种或两种方法的选择将由实验设计决定。

1. 移动侦测和试验排除
   1. 使用代码 pupil_avg_JOVE.m，为每个会话执行运动检测和试用排除。为此，请运行代码并从弹出对话框中的单个会话中选择数据文件。
   2. 线性地去趋势PD迹线，并使用前面得出的校准表将单位从电压转换为千分尺（参见步骤3）。此外，在整个录制会话（~12 分钟）中线性去趋势跟踪。
   3. 通过在会话持续时间（~12分钟）内绘制瞳孔迹线（图1B - 顶行）和线性去趋势运动迹线（图1B-底行）来检查会话数据，并叠加在试验标记上。
   4. 测量运动轨迹的标准偏差 （SD）。使用 MATLAB 中的查找峰值函数获取运动跟踪峰值的时间。考虑超过5个SD阈值的峰值，并且与其他峰值相隔至少1 s作为运动事件⁴⁹（图1B - 底部）。
   5. 放弃在运动事件后 7 秒内发生的任何瞳孔散大试验（标准和偏差）。如果由于运动相关的瞳孔散大而放弃了一半以上的异常试验，则放弃整个会话并重复。
2. 数据预处理和可视化
   1. 使用代码 pupil_avg_JOVE.m 消除眨眼伪影，预处理数据，并获得跨会话的每个刺激的平均瞳孔扩张。为此，请运行代码并在弹出对话框中选择要分析的所有数据文件。
   2. 检测眼眨眼（PD 变化超过 400 μm/ms），并通过在以检测到的闪烁时间为中心的 200 ms 时间窗口中线性插值 PD 迹线来消除它们。如果超过一半的异常试验在刺激发作和吹气发作之间包含眨眼，则丢弃会话数据。
   3. 从 1，000 Hz 的采集采样率到 10 Hz 对 PD 数据进行下采样。
   4. 在刺激开始前 1 秒开始并在刺激偏移后持续 5 秒的窗口中提取 PD 迹线。计算刺激开始前 500 毫秒窗口内每个刺激的平均基线 PD。从这些迹线中减去基线PD，以获得刺激引起的PD变化。
   5. 平均每个动物内每个刺激条件的刺激诱发PD变化，然后在动物之间生成对每个刺激条件的平均瞳孔扩张反应（例如， 图3A）。
3. 生长曲线分析（GCA），用于量化PD变化的时间过程
   注意:该分析方法确定瞳孔扩张反应的大小和时间过程，并已用于人类受试者²⁷，^36，40以及豚鼠⁴⁹的瞳孔测量研究。
   1. 垂直连接所有会话、动物、信噪比和衰减的 pupil_avg_JOVE.m 的所有输出，以构建包含以下列的矩阵:动物 ID、信噪比、声级和瞳孔 （1-50） 直径值。使用代码 pupil_LME_JOVE.m，执行增长曲线分析 （GCA）²⁷，³⁶，^40，49。
   2. 拟合线性混合效应模型，将主体级截距作为随机效应，将最多 2 阶的正交时间多项式作为固定效应，每个偏差 SNR 被视为一个单独的组，到瞳孔直径迹线的上升阶段（刺激开始后 0.1 至 2.1 秒）。
   3. 使用以下公式^36，49 对瞳孔迹线的上升阶段进行建模:
      瞳孔扩张 = （截距 + 条件） + 时间 1 * （β 时间 1 + β 时间 1: 条件） + 时间 2* （β 时间 ₂+ β_{时间 2}: 条件） + r（主体级截距）
      其中， time1 和 time2 对应于正交线性和二次时间多项式， βs 对应于权重。
   4. 使用 MATLAB 中的 fitlme 函数估计平均权重 （βs） 及其标准误差。使用 coeftest 函数估计权重的统计显著性。
   5. 对于每个SNR，绘制对应于截距，线性和二次项的权重以可视化结果（图3B，C）。
4. 显示瞳孔扩张有统计学意义的试验分析
   注意:该分析方法确定了观察到具有统计学意义的瞳孔扩张反应的偏差试验的比例，并且对应于瞳孔扩张反应的可靠性。
   1. 选择以瞳孔反应峰值为中心的适当分析窗口（0.5-1 s）（通常在刺激发作后~1.5 s）。在此分析窗口中计算所有标准和偏差试验的平均PD。
   2. 确定每个偏差试验的平均PD是否大于标准试验的平均PD值合并分布的2.33标准误。将超过此阈值的偏差试验计为显示显着瞳孔扩张的试验。
   3. 将显示显着瞳孔扩张的偏差试验数量除以偏差试验总数（针对每种情况），以量化与标准刺激试验相比，显示PD在统计学上显着增加的试验比例。
   4. 将所有具有显着瞳孔变化的试验的会话百分比放入细胞阵列的每个细胞中，其中细胞从低到高SNR排列。使用代码 pupil_threshold_estimate_JOVE.m，估计呼叫噪声分类阈值。
   5. 绘制显示PD作为SNR函数的统计学显着增加的试验比例（图3D）。对于这些数据，请使用fitnlm MATLAB函数（在统计工具箱中）来拟合形式⁶¹的心理测量函数:
      Ψ（x; α， β， λ） = （1 -λ） * F（x; α， β）
      其中，F 是威布尔函数，定义为
      F（x; α， β） = ，α是移位参数，β是斜率参数，λ 是失效率。

结果

在三个男性色素GP中进行瞳孔测定，在实验过程中重量~600-1，000g。如该协议所述，为了估计呼叫噪声分类阈值，使用了一种奇怪的范式来表示刺激。在古怪的范式中，属于给定SNR下嵌入白噪声中的一类呼叫（呜呜声）被用作标准刺激（图2A），而来自同一SNR嵌入白噪声中的另一类（wheeks）的呼叫（图2A）作为偏差刺激。标准和偏差刺激从每个类别的八个...

讨论

该协议展示了使用瞳孔测量法作为非侵入性和可靠的方法来估计被动聆听动物的听觉阈值。按照此处描述的协议，估计正常听力GP中的呼叫噪声分类阈值。发现使用瞳孔测量法估计的阈值与使用操作性训练获得的阈值一致⁶²。然而，与操作性训练相比，瞳孔测量方案相对简单，可以快速设置和获取数据。每次数据采集会话（每个SNR水平）持续约12分钟，导致每只动物每天1-2小时的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analog output board	Measurement Computing Corporation, Norton, MA	PCI-DDA02/12
Anechoic foam	Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN
Condenser microphone	Behringer, Willich, Germany	C-2
Free-field microphone	Bruel & Kjaer, Denmark)	Type 4940
Matlab	Mathworks, Inc., Natick, MA		2018a version
Monocular remote camera and illuminator system	Arrington Research, Scottsdale, AZ	MCU902	Infrared LED array + camera with infrared filter
Multifunction I/O Device	National Instruments, Austin, TX	PCI-6229
Neural interface processor	Ripple Neuro, Salt Lake City, UT	SCOUT
Piezoelectric motion sensor	SparkFun Electronics, Niwot, CO	SEN-10293
Pinch valve	Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL	EW98302-02
Programmable attenuator	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL	PA5
Silicon Tubing	Cole-Parmer		~3 mm
Sound attenuating chamber	IAC Acoustics
Speaker full-range driver	Tang Band Speaker, Taipei, Taiwan	W4-1879
Stereo Amplifier	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL	SA1
Tabletop - CleanTop Optical	TMC vibration control / Ametek, Peabody, MA
Viewpoint software	ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ