אישונים להערכת תחושה שמיעתית בשרקנים

Summary

פיפילומטריה, טכניקה פשוטה ולא פולשנית, מוצעת כשיטה לקביעת ספי שמיעה ברעש בבעלי חיים שומעים רגילים ובמודלים של בעלי חיים של פתולוגיות שמיעתיות שונות.

Abstract

חשיפה לרעש היא גורם מוביל לאובדן שמיעה תחושתי-עצבי. מודלים של בעלי חיים של ליקוי שמיעה כתוצאה מרעש יצרו תובנה מכניסטית לגבי הפתולוגיות האנטומיות והפיזיולוגיות הבסיסיות של אובדן שמיעה. עם זאת, הקשר בין ליקויים התנהגותיים שנצפו בבני אדם עם ליקוי שמיעה לבין ליקויים התנהגותיים במודלים של בעלי חיים נותר מאתגר. כאן, אישונים מוצע כשיטה שתאפשר השוואה ישירה של נתוני התנהגות של בעלי חיים ובני אדם. השיטה מבוססת על פרדיגמת מוזרות שונה - הרגלת הנושא להצגה חוזרת ונשנית של גירוי והצגה לסירוגין של גירוי סוטה השונה באופן פרמטרי כלשהו מהגירוי החוזר. הנחת היסוד היא שאם השינוי בין הגירוי החוזר לסוטה מזוהה על ידי הנבדק, הוא יעורר תגובת התרחבות אישונים גדולה יותר מזו שמעורר הגירוי החוזר. גישה זו מודגמת באמצעות מטלת סיווג קול בשרקנים, מודל בעל חיים הנמצא בשימוש נרחב במחקר שמיעתי, כולל במחקרי ליקוי שמיעה. על ידי הצגת קולות מקטגוריית קול אחת כגירויים סטנדרטיים וקטגוריה שנייה כגירויים אי-זוגיים המוטבעים ברעש ביחסי אות לרעש שונים, הוכח כי גודל התרחבות האישונים בתגובה לקטגוריית ה-oddball משתנה באופן מונוטוני עם יחס האות לרעש. לאחר מכן ניתן להשתמש בניתוחי עקומות גדילה כדי לאפיין את מהלך הזמן ואת המובהקות הסטטיסטית של תגובות התרחבות האישונים הללו. בפרוטוקול זה מתוארים נהלים מפורטים להסתגלות שרקנים להתקנה, ביצוע אישונים והערכה/ניתוח נתונים. למרות שטכניקה זו מודגמת בשרקנים בעלי שמיעה תקינה בפרוטוקול זה, ניתן להשתמש בשיטה כדי להעריך את ההשפעות החושיות של צורות שונות של ליקוי שמיעה בכל נבדק. השפעות אלה עשויות להיות מתואמות עם אמצעים אלקטרופיזיולוגיים במקביל ותצפיות אנטומיות פוסט-הוק.

Introduction

קוטר האישון (PD) יכול להיות מושפע ממספר רב של גורמים, והמדידה של PD המשתנה עם הזמן ידועה בשם אישונים. מחלת פרקינסון נשלטת על ידי שריר הסוגר הקשתית (המעורב בהתכווצות) ושריר מרחיב הקשתית (המעורב בהתרחבות). שריר ההתכווצות עצבני על ידי המערכת הפאראסימפתטית וכולל הקרנות כולינרגיות, בעוד שמרחיב הקשתית עצבני על ידי המערכת הסימפתטית הכוללת הקרנות נוראדרנרגיות וכולינרגיות ^1,2,3. הגירוי הידוע ביותר לגרימת שינויים בפרקינסון הוא התכווצות הארה ותגובות התרחבות של האישון יכולות להיווצר על ידי שינויים בעוצמת האור הסביבתי². PD משתנה גם כפונקציה של מרחק מוקד². עם זאת, ידוע מזה עשרות שנים כי PD מראה גם תנודות שאינן קשורות להארה 4,5,6,7. לדוגמה, שינויים במצבים מנטליים פנימיים יכולים לעורר שינויים חולפים בפרקינסון. האישון מתרחב בתגובה לגירויים טעונים רגשית או עולה עם עוררות 4,5,8,9. הרחבת אישונים יכולה להיות קשורה גם למנגנונים קוגניטיביים אחרים, כגון מאמץ מנטלי מוגבר או תשומת לב^10,11,12,13. בגלל הקשר הזה בין שינויים בגודל האישונים לבין מצבים נפשיים, שינויים בפרקינסון נחקרו כסמן להפרעות קליניות כגון סכיזופרניה 14,15, חרדה 16,17,18, מחלת פרקינסון ^19,20 ואלצהיימר ²¹ בין היתר., אצל בעלי חיים, שינויים בפרקינסון עוקבים אחר מצבים התנהגותיים פנימיים ומתואמים עם רמות הפעילות העצבית באזורים בקליפת המוח^22,23,24,25. קוטר האישון הוכח גם כאינדיקטור אמין למצב השינה בעכברים²⁶. שינויים אלה הקשורים לעוררות ולמצב הפנימי מתרחשים בדרך כלל בסקאלות זמן ארוכות בסדר גודל של כמה עשרות שניות.

בתחום חקר השמיעה, בשמיעה תקינה כמו גם בנבדקים לקויי שמיעה, מאמץ ההאזנה והתפיסה השמיעתית הוערכו באמצעות אישונים. מחקרים אלה כוללים בדרך כלל נבדקי מחקר מאומנים^27,28,29,30 המבצעים סוגים שונים של משימות זיהוי או זיהוי. בגלל הקשר הנ"ל בין עוררות ופרקינסון, מעורבות מוגברת במשימות ומאמץ הקשבה נמצאו בקורלציה עם תגובות מוגברות להרחבת אישונים 30,31,32,33,34,35. לפיכך, נעשה שימוש באישונים כדי להראות כי מאמץ האזנה מוגבר מושקע כדי לזהות דיבור פגום ספקטרלית אצל מאזינים בעלי שמיעה רגילה^29,36. בקרב מאזינים לקויי שמיעה, כגון בני אדם עם ליקוי שמיעה הקשור לגיל 27,30,37,38,39,40,41 ומשתמשי שתל שבלול ^42,43, תגובות האישונים גדלו גם הן עם ירידה בהבנת הדיבור; עם זאת, מאזינים לקויי שמיעה הראו התרחבות אישונים גדולה יותר בתנאי האזנה קלים יותר בהשוואה לנבדקי שמיעה רגילים 27,30,37,38,39,40,41,42,43. אבל ניסויים הדורשים מהמאזין לבצע משימת זיהוי אינם תמיד אפשריים - למשל, אצל תינוקות, או בכמה מודלים של בעלי חיים. לפיכך, תגובות אישונים שאינן קשורות להארה המתעוררות על ידי גירויים אקוסטיים יכולות להיות שיטה חלופית בת קיימא להערכת זיהוי שמיעתי במקרים אלה^44,45. מחקרים קודמים הדגימו הרחבת אישון חולפת וקשורה לגירוי כחלק מרפלקס הכיוון⁴⁶. מחקרים מאוחרים יותר הדגימו שימוש בהתרחבות אישונים הקשורה לגירוי כדי לגזור עקומות רגישות לתדר אצל ינשופים^47,48. לאחרונה הותאמו שיטות אלה להערכת רגישות תגובת הרחבת האישונים בתינוקות אנושיים⁴⁸. בדיקת אישונים הוכחה כגישה אמינה ולא פולשנית להערכת ספי זיהוי והבחנה שמיעתיים בשפני ניסיונות (GPs) בהאזנה פסיבית באמצעות מגוון רחב של גירויים פשוטים (צלילים) ומורכבים (קולות GP)⁴⁹. שינויים אלה הקשורים לגירוי PD מתרחשים בדרך כלל בסקאלות זמן מהירות יותר בסדר גודל של מספר שניות וקשורים לתזמון הגירוי. כאן, אישונים של שינויים הקשורים לגירוי PD מוצע כשיטה לחקר השפעות התנהגותיות של סוגים שונים של ליקויי שמיעה במודלים של בעלי חיים. בפרט, פרוטוקולים pupillometry לשימוש GPs, מודל מבוסס היטב של בעלי חיים של סוגים שונים של פתולוגיות שמיעתיות 50,51,52,53,54,55,56 (ראה גם הפניה ⁵⁷ לסקירה מקיפה) מתואר.

למרות שטכניקה זו מודגמת אצל רופאי משפחה בעלי שמיעה רגילה, ניתן להתאים שיטות אלה בקלות למודלים אחרים של בעלי חיים ולמודלים של בעלי חיים של פתולוגיות שמיעתיות שונות. חשוב לציין, ניתן לשלב אישונים עם מדידות לא פולשניות אחרות כגון EEG, כמו גם עם רישומים אלקטרופיזיולוגיים פולשניים על מנת לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס זיהוי קול אפשרי וליקויים בתפיסה. לבסוף, גישה זו יכולה לשמש גם כדי ליצור קווי דמיון רחבים בין מודלים של בני אדם ובעלי חיים.

Protocol

עבור כל הליכי הניסוי, יש לקבל אישור מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ולדבוק בהנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. בארצות הברית של אמריקה, רופאי משפחה כפופים בנוסף לתקנות משרד החקלאות של ארצות הברית (USDA). כל הנהלים בפרוטוקול זה אושרו על ידי IACUC של אוניברסיטת פיטסבורג ועמדו בהנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. לניסוי זה נעשה שימוש בשלושה רופאי משפחה זכרים בעלי פיגמנטציה בגילאי 4 עד 10 חודשים, במשקל ~600-1,000 גרם.

1. הליך כירורגי

1. בצע את כל ניסויי האישונים ברופאי משפחה ערניים, קבועי ראש ומקשיבים פסיבית. אמת שמיעה תקינה בנבדקים ניסיוניים באמצעות הקלטות תגובה שמיעתית בגזע המוח (ABR) בקליקים וצלילים טהורים⁵⁸.
   הערה: למרות שרכישת נתוני אישונים כשלעצמה אינה פולשנית, ניתוח פולשני לאחר השתלת ראש משמש בפרוטוקול זה לשיתוק ראשו של בעל החיים במהלך ההליך. החלופות מוצגות בחלק הדיון.
2. ראשית, השתילו את כל חיות הניסוי בעמוד ראש מפלדת אל-חלד לקיבוע הרדמה איזופלורנית. השתמש בטכניקות כירורגיות אספטיות כדי לעגן את עמוד הראש לגולגולת באמצעות שילוב של ברגי עצם ואקריליק דנטלי⁵⁸.
3. לספק לבעלי החיים טיפול לאחר הניתוח, כולל ניהול משככי כאבים מערכתיים ומקומיים. לאחר תקופת החלמה של שבועיים, התאקלמו בהדרגה בעלי חיים למערך הניסוי.
   הערה: ההליך הכירורגי מבוסס על שיטות שפורסמו בעבר ב- GPs⁵⁸ וכן במינים אחרים^59,60, ואינו המוקד של פרוטוקול זה.

2. הסתגלות בעלי חיים למערך הניסוי

הערה: ניסויים מתבצעים בדרך כלל בתא או תא עם קול מוחלש (ראה טבלת חומרים). הזמן הנדרש להכרת בעל חיים למערך משתנה מנושא לנושא. זמני התאקלמות אופייניים מצוינים להלן. בעל חיים מאוקלם היטב יסבול קיבוע ראש עם תנועת גוף מינימלית, ויביא למדידות טובות יותר של קוטר האישונים.

1. לאחר תקופת החלמה של שבועיים, יש להכיר תחילה את בעלי החיים לטיפול ולהובלה (2-3 ימים). הסתגלות זו חיונית להפחתת מתח וחרדה. כדי להכיר את בעל החיים לטיפול, הניחו את בעל החיים במיכל ההובלה שלו לפרקי זמן הולכים וגדלים (10-30 דקות), וטפלו בבעל החיים לפרקי זמן הולכים וגדלים (10-30 דקות).
2. לאחר מכן, הרגילו את החיה למערך הניסוי (2-3 ימים) על-ידי הצבת החיה במתחם למשך 10-45 דקות (איור 1A). המתחם חייב לאפשר שינויי יציבה קטנים לנוחות החיה במהלך הניסוי. אפשרו שינויי יציבה קטנים לנוחות החיה במהלך הניסוי. עם זאת, ידוע כי התרחבות האישונים קודמת לתנועה⁴⁹. לכן, מדדו את התנועה של החיה וקחו בחשבון את התנועה הזו בניתוח הנתונים (איור 1C).
3. כחלק מההתאקלמות הזו, טפלו ידנית בעמוד הראש המושתל, כאילו החיה עומדת להיות מקובעת בראש. החזק את עמוד הראש לפרקי זמן הולכים וגדלים (10-60 שניות).
4. לאחר התאקלמות ידנית ובהתאם להתנהגות בעלי החיים, נסו לקבע את הראש למסגרת קשיחה באמצעות מחזיק השתל.
5. הגדילו לאט את משך קיבוע הראש (10-45 דקות) עד שבעל החיים רגוע ודומם יחסית בזמן שהוא מקובע עם הראש (2-3 ימים).
6. הרגילו את בעל החיים לנוכחות המצלמה, מקור אור IR ומקור אור לבן (1-2 ימים). הפעל את האור הלבן, בהדרגה להגדיל את משך (10 דקות עד 30 דקות).
7. הרגילו את בעל החיים לגירוי אקוסטי על ידי השמעת מגוון צלילים (למשל, צלילים טהורים, קליקים, קולות) ברמות צליל שונות (1-2 ימים, במקביל לשלב 2.6). כדי למזער את ההתרגלות לגירויים ניסיוניים, השתמשו בצלילים שונים מאלה המתוכננים לניסויי האישונים בשלב זה.

3. כיול מצלמת האישון

הערה: המצלמה המשמשת לבדיקת אישונים מפיקה וידאו באמצעות USB לחבילת תוכנות האישונים. מסרטון זה, קוטר האישון מופק באמצעות התאמת אליפסה וערך סף מתכוונן על-ידי חבילת תוכנות האישונים (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן התוכנה מתממשקת עם כרטיס דיגיטלי לאנלוגי. הכרטיס מפיק ערך מתח אנלוגי פרופורציונלי לקוטר האישון. יש צורך בכיול כדי להמיר ערך מתח זה בחזרה לקוטר האישון ביחידות אורך.

1. הניחו דף נייר המכיל תמונות של דיסקים שחורים בקוטר ידוע באותו מקום שבו העין של רופא המשפחה תהיה ממוקמת במהלך האישונים. עבור רופאי משפחה, PD הוא בטווח של 4 מ"מ. לכן, בצע כיול באמצעות דיסקים של 3 מ"מ, 4 מ"מ ו- 5 מ"מ.
2. מקמו את מצלמת האישונים (ראו טבלת חומרים) באותו מרחק (25 ס"מ) שבו יבוצעו הניסויים. כוונן את מפתח הצמצם והמיקוד של המצלמה עד לקבלת תמונה ממוקדת בחדות של דיסק בקוטר ידוע.
3. בתוכנה לרכישת אישונים (ראה טבלת חומרים), כוונן את הסף כך שקווי המתאר של האליפסה יתאימו באופן הדוק לדיסק המצולם, ורשום את ערך מתח היציאה האנלוגי ואת קנה המידה.
4. חזור על הליך זה עבור דיסקים בגודל 3 מ"מ, 4 מ"מ ו- 5 מ"מ. לאחר מכן, ערוך טבלה של ערכי הקוטר בפועל (במ"מ) המתאימים לערכי מתח היציאה האנלוגיים.

4. רכישת נתוני אישונים

1. בצע את כל הניסויים בתא או תא מוחלש קול, כאשר הקירות הפנימיים מכוסים בקצף הדהוד.
2. להעברת גירוי בשדה חופשי, הרכיבו רמקול מכויל על קיר התא מוחלש הקול, בגובה שווה למיקום שבו תוצב החיה.
   הערה: בחירת הרמקול תלויה במינים הנחקרים ובגירויים המתוכננים. עבור קולות GP, השתמש ברמקול דרייבר לטווח מלא בעל תגובת תדרים שטוחה יחסית (±3 dB) בתחום תדרי הקול של 0.5-3 קילוהרץ (איור 1A).
3. מקמו את החיה במתחם כדי לוודא שתנועות גוף גדולות אינן אפשריות (איור 1A). קבעו את ראש החיה למסגרת הקשיחה כפי שמתואר בשלב 2 (איור 1A).
4. הניחו חיישן פיאזואלקטרי מתחת למתחם כדי לזהות ולתעד תנועות של חיות (איור 1A).
5. כדי להגדיר את נשיפה האוויר, השתמש מחזיק מחובר לשולחן כדי להניח קצה פיפטה ב ~ 15 ס"מ לפני החוטם של החיה. חבר צינור סיליקון (~ 3 מ"מ קוטר) לקצה פיפטה וחבר את הצינור לגליל אוויר מוסדר.
6. שמור על לחץ האוויר של הצילינדר בין 20 ל -25 psi. העבר את הצינור דרך שסתום צביטה כדי לשלוט בתזמון ובמשך של נשיפה באוויר באמצעות ממסר הנשלט על ידי מחשב.
7. להאיר את העין עם מערך LED אינפרא אדום הממוקם במרחק ~ 10 ס"מ. השתמש בתאורת LED לבנה בעוצמה של ~2,000 cd/m² כדי להאיר את העין המצולמת ולהביא את PD קו הבסיס ל~3.5 מ"מ. שמור על תנאי תאורה קבועים בחדר הניסוי לאורך מפגשי הניסוי.
   הערה: בתאורת מעבדה רגילה (~ 500 cd/m²), אישון GP מורחב למדי, ואינו מאפשר תצפית של התרחבות נוספת הקשורה לגירוי. על ידי שימוש בתאורה נוספת, האישון מובא לקוטר בסיס של ~3.5 מ"מ, המאפשר טווח דינמי מספיק כדי לצפות בהתרחבות הקשורה לגירוי. זה גם מבטיח קווי בסיס עקביים בין הפעלות ונושאים.
8. פתח את תוכנת רכישת האישון וקבל את הווידאו (ב- 90 fps) של האישון באמצעות מצלמה עם עדשת 16 מ"מ (רזולוציה מרחבית של זווית ראייה של 0.15°) ומסנן אינפרא אדום (IR) הממוקם במרחק של 25 ס"מ מהעין המצולמת. ודא שהעין ממורכזת באזור התמונה.
9. לווסת את הצמצם והמיקוד של המצלמה, כמו גם את רמת האינפרא-אדום עד שקווי המתאר של האישון המצולם יהיו בפוקוס חד.
10. בתוכנה לרכישת אישון, הגדר את תחום העניין המכיל את האישון על ידי בחירת אזור מלבני עם העכבר.
11. השתמש בלוח הבקרה של תוכנת רכישת התלמידים כדי להתאים את הבהירות והניגודיות של הווידאו שנרכש. הגדר את צפיפות הסריקה ל- 5 וכוונן את הסף כך שהתאמת האליפסה תתאים באופן הדוק לקו המתאר של האישון בסרטון.
12. באמצעות תוכנת מעבד הממשק העצבי, רכוש ושמור את האות האנלוגי ממעקב PD, את עקבות המתח מתנועת הקלטת החיישן הפיזואלקטרי, את זמני אספקת הגירוי ואת זמני אספקת נשיפה האוויר.

5. זיהוי רעשי קריאה ואפליה קטגורית באמצעות פרדיגמת מוזרות שונה

הערה: הגירויים לניסויי אישונים כללו קולות GP שתועדו במושבת בעלי חיים⁵⁸. ניתן למצוא את דגימות הקול במאגר הבא: https://github.com/vatsunlab/CaviaVOX. בפרט, נעשה שימוש בקריאות יבבה ויבבה כדי לעורר את תגובות התלמידים המוצגות בתוצאות המייצגות. מכל קטגוריה, בחר קולות שאורכם שווה בקירוב. כדי להסביר את ההבדלים באמפליטודת ההקלטה ובמעטפות הטמפורליות של הקולות, נרמלו את הקולות לפי אמפליטודות הריבוע הממוצע השורשי שלהם (r.m.s.), במידת הצורך.

1. הציגו את הגירויים השמיעתיים באמצעות MATLAB בקצב דגימה מתאים. עבור רופאי משפחה, שהם בעלי חיים בעלי שמיעה בתדר נמוך, קצב דגימה של 100 קילוהרץ מספיק.
2. בחר שמונה דוגמאות שונות של קולות GP באורכים דומים משתי קטגוריות שונות של קולות (למשל, קריאות יבבה וקריאות יבבה). קטגוריה אחת (שמונה דוגמאות) תשמש כגירויים סטנדרטיים, והקטגוריה השנייה (שמונה דוגמאות) תשמש כגירויים מוזרים או סוטים (איור 2A).
3. כדי ליצור גירויים סטנדרטיים וחריגים באורך של 1 שניות המוטבעים ברעש ברמות שונות של יחס אות לרעש (SNR), הוסף רעש לבן באורך שווה לקריאות (רעש מגודר). טווח ה-SNR שנדגם בניסוי זה הוא בין -24 dB SNR ל-+40 dB SNR.
4. באמצעות עיצוב בלוקים, בכל סשן ניסוי (~ 12 דקות), לרכוש נתונים המתאימים לרמת SNR יחידה. בכל מפגש, השתמש בשמונה דוגמאות של קטגוריית קול אחת ב- SNR מסוים כגירויים סטנדרטיים, ובשמונה דוגמאות של קטגוריית הקול האחרת באותה רמת SNR כגירויים סוטים.
   הערה: בלוק ניסיוני טיפוסי נמשך ~ 12 דקות. בהתאם להתנהגות החיה והתרגלות תגובות התלמידים, ייתכן שניתן יהיה לרכוש נתונים עבור 3-4 בלוקים בכל יום (~ 45 - 60 דקות). במהלך תקופה זו, לפקח על החיה מקרוב באמצעות וידאו האישון, עקבות התנועה, כמו גם ישירות בין בלוקים.
5. עבור כל מפגש, הכינו רצף הצגת גירוי פסאודו-אקראי המכיל גירויים סטנדרטיים >90% מהזמן. ודאו שבין גירויים סוטים יש לפחות 20 ניסויים עם גירויים סטנדרטיים (איור 2B).
   הערה: בהתאם לניסוי, סדר הגירויים הסוטים בתוך רצף הצגת הגירוי יכול לאמץ עיצוב ריבועי לטיני כדי להבטיח שכל גירוי סוטה ייחודי יתפוס מיקום רציף ייחודי בכל מפגש. ממוצע על פני כל המפגשים יכול אפוא למזער את ההשפעה של מיקום הגירוי הסוטה בתוך רצף הגירוי הכולל.
6. השתמש בעוצמת גירוי קבועה (לדוגמה, 85 dB SPL) עבור כל הצגת גירוי.
   הערה: השתמש בממיר דיגיטלי-לאנלוגי מתאים כדי להפיק אות שמע, להחליש אותו לרמת הצליל הרצויה באמצעות מנחת הניתן לתכנות, להגביר את האות בעוצמה ולהעביר את האות באמצעות רמקול מכויל (לדוגמה, חומרה, ראה טבלת חומרים).
7. הצג את הגירויים עם סדירות טמפורלית גבוהה (גירוי של 1 שניות ואחריו 3 שניות של שתיקה כפי שמוצג בתוצאות המייצגות).
   הערה: תגובות התרחבות האישונים איטיות, בדרך כלל מגיעות לשיא של 1 שניות לאחר תחילת הגירוי ולוקח בערך 5 שניות לחזור לקו הבסיס⁴⁹. קצב הצגת התמריצים חייב להיות נמוך מספיק כדי להסביר את טווחי הזמן האיטיים האלה. סדירות הזמן חשובה מכיוון שייתכן שהפרעה לדפוס העיתוי יכולה לשמש עצמה כגירוי סוטה.
8. כדי לשמור על המעורבות של בעל החיים עם הגירויים ולמזער את ההרגלה, יש לספק נשיפה קצרה (100 מילישניות) לאחר הגירוי הסוטה. ודא שתחילת נשיפת האוויר מופרדת מספיק ממשך הגירוי (2.5 שניות מתחילת הגירוי), כך שתגובות התרחבות האישונים המעוררות גירוי יגיעו לשיא לפני שנשיפת האוויר גרמה למצמוץ.
   הערה: בפרדיגמת ה-oddball הקלאסית, לא נעשה שימוש בחיזוקים חיוביים או שליליים. מכיוון שנשיפה אווירית משמשת כאן כחיזוק מרתיע מעט כדי לשמור על המעורבות של החיה עם הגירויים השמיעתיים, הפרדיגמה מכונה פרדיגמת אי-זוגיות.

6. ניתוח וסטטיסטיקה

הערה: כל הניתוחים בוצעו באמצעות קוד מותאם אישית שנכתב ב-MATLAB (זמין ב-https://github.com/vatsunlab/GP_Pupil). מתוארות שתי שיטות ניתוח עיקריות, המתייחסות למהימנות ולמהלך הזמן של תגובות התלמידים, בהתאמה. הבחירה באחת השיטות או בשתיהן תוכתב על ידי תכנון ניסיוני.

1. זיהוי תנועה ואי-הכללת ניסיון
   1. באמצעות הקוד pupil_avg_JOVE.m, בצע זיהוי תנועה ואי הכללת ניסיון עבור כל הפעלה. לשם כך, הפעל את הקוד ובחר את קובץ הנתונים מהפעלה אחת בתיבת הדו-שיח הקופצת.
   2. בטל באופן ליניארי את המגמה של מעקב PD והמיר את היחידות ממתח למיקרומטר באמצעות טבלת הכיול שנגזרת קודם לכן (ראה שלב 3). כמו כן, בטל באופן ליניארי את מעקב התנועה לאורך כל סשן ההקלטה (~ 12 דקות).
   3. בדוק את נתוני ההפעלה על-ידי התוויית מעקב האישון (איור 1B - שורה עליונה) ומעקב התנועה הליניארי (איור 1B- שורה תחתונה) לאורך משך ההפעלה (~12 דקות), בשכבת-על על סמני ניסוי.
   4. מדוד את סטיית התקן (SD) של מעקב התנועה. השג את הזמנים של שיאי מעקב תנועה באמצעות הפונקציה findpeaks ב- MATLAB. חשבו על הפסגות שחצו סף של 5 SDs ונפרדות מפסגות אחרות בשנייה אחת לפחות כאירוע תנועה⁴⁹ (איור 1B - למטה).
   5. בטל כל ניסוי (סטנדרטי וחריג) של התרחבות אישונים המתרחשת בתוך 7 שניות מאירוע תנועתי. אם יותר ממחצית ממספר הניסויים הסוטים נמחק עקב התרחבות אישונים הקשורה לתנועה, השליכו את כל הפגישה וחזרו עליה.
2. עיבוד מקדים ותצוגה חזותית של נתונים
   1. השתמש בקוד pupil_avg_JOVE.m, כדי להסיר מצמוץ עיניים, לעבד מראש את הנתונים, ולקבל את הרחבת האישונים הממוצעת לכל גירוי על פני הפעלות. לשם כך, הפעל את הקוד ובחר את כל קבצי הנתונים לניתוח בתיבת הדו-שיח הקופצת.
   2. זהה מצמוצי עיניים (שינויי PD העולים על 400 מיקרומטר/שנייה) והסר אותם על-ידי אינטרפולציה ליניארית של מעקב PD בחלון זמן של 200 אלפיות השנייה הממורכז בזמן המצמוץ שזוהה. מחק את נתוני ההפעלה אם יותר ממחצית ממספר הניסויים הסוטים מכילים מצמוץ עיניים בין הופעת הגירוי להופעת נשיפה באוויר.
   3. דגימת הפחתה של נתוני PD מקצב דגימת רכישה של 1,000 הרץ עד 10 הרץ.
   4. חלץ עקבות PD בחלון המתחיל 1 שניות לפני תחילת הגירוי ונמשך 5 שניות לאחר קיזוז הגירוי. חשב את PD הבסיסי הממוצע עבור כל גירוי בחלון של 500 אלפיות השנייה ממש לפני תחילת הגירוי. הפחת את PD הבסיסי מהעקבות האלה כדי לקבל את השינוי המעורר גירוי בפרקינסון.
   5. ממוצע השינויים בפרקינסון המעוררים על ידי גירוי עבור כל תנאי גירוי בין מפגשים בתוך כל חיה, ולאחר מכן בין חיות כדי ליצור את תגובת התרחבות האישונים הממוצעת לכל תנאי גירוי (לדוגמה, איור 3A).
3. ניתוח עקומת גדילה (GCA) לכימות מהלך הזמן של שינויים בפרקינסון
   הערה: שיטת ניתוח זו קובעת את הגודל ואת מהלך הזמן של תגובות התרחבות האישונים ושימשה במחקרים אישונים בבני אדם 27,36,40 וכן בשרקנים ⁴⁹.
   1. שרשר אנכית את כל היציאות מ- pupil_avg_JOVE.m עבור כל ההפעלות, בעלי החיים, SNR והנחתות כדי לבנות מטריצה המכילה את העמודות הבאות: animalID, SNR, רמת קול וקוטר אישון (1-50). באמצעות הקוד pupil_LME_JOVE.m, בצע את ניתוח עקומת הצמיחה (GCA)27,36,40,49.
   2. התאם מודלים ליניאריים של אפקטים מעורבים עם יירוטים ברמת הנושא כאפקטים אקראיים, ופולינומי זמן אורתוגונליים מסדר שניים כאפקטים קבועים, כאשר כל SNR סוטה מטופל כקבוצה נפרדת, לשלב העולה של עקבת קוטר האישון (0.1 עד 2.1 שניות לאחר תחילת הגירוי).
   3. מודל השלב העולה של מעקב האישון באמצעות הנוסחה הבאה^36,49:
      התרחבות אישונים = (יירוט + תנאי) + זמן1 * (β זמן1 + זמן β 1: תנאי) + זמן2* (β _זמן2+_{β זמן2}: תנאי) + r (subjectlevelintercept)
      כאשר, time1 ו- time2 מתאימים לפולינומי זמן אורתוגונליים ליניאריים וריבועיים, ו - βs מתאימים למשקלים.
   4. הערך משקלים ממוצעים (βs) ואת שגיאות התקן שלהם באמצעות הפונקציה fitlme ב- MATLAB. להעריך את המובהקות הסטטיסטית של המשקולות באמצעות פונקציית coeftest.
   5. עבור כל SNR, התווה את המשקולות המתאימות למונחים היירוט, הליניארי והריבועי כדי להמחיש את התוצאות (איור 3B, C).
4. ניתוח ניסויים שהראו התרחבות אישונים מובהקת סטטיסטית
   הערה: שיטת ניתוח זו קובעת את שיעור הניסויים הסוטים שבהם נצפתה תגובת התרחבות אישונים מובהקת סטטיסטית ומתאימה לאמינות תגובות התרחבות האישונים.
   1. בחר חלון ניתוח מתאים (0.5-1 שניות) המרוכז סביב שיא תגובת האישון (בדרך כלל ~ 1.5 שניות לאחר תחילת הגירוי). חשב את ממוצע PD בחלון ניתוח זה עבור כל הניסויים הסטנדרטיים והחריגים.
   2. קבע אם ממוצע PD עבור כל אחד מהניסויים הסוטים גדול מ- 2.33 שגיאות תקן של ההתפלגות המאוגמת של ערכי PD ממוצעים עבור ניסויים סטנדרטיים. ספרו את הניסויים הסוטים החורגים מסף זה כניסויים המראים התרחבות אישונים משמעותית.
   3. חלק את מספר הניסויים הסוטים המראים התרחבות אישונים משמעותית במספר הכולל של ניסויים סוטים (עבור כל תנאי) כדי לכמת את שבריר הניסויים המראים עלייה מובהקת סטטיסטית במחלת פרקינסון בהשוואה לניסויי גירוי סטנדרטיים.
   4. שים את כל אחוז הניסויים מבחינת הפעלה עם שינויי אישונים משמעותיים בכל תא במערך תאים, שבו התאים מסודרים מ- SNR נמוך לגבוה יותר. באמצעות הקוד pupil_threshold_estimate_JOVE.m, הערך את סף סיווג ההתקשרות לרעש.
   5. שרטט את שבריר הניסויים שמראים עלייה מובהקת סטטיסטית בפרקינסון כפונקציה של SNR (איור 3D). לנתונים אלה, השתמש בפונקציה fitnlm MATLAB (בארגז הכלים לסטטיסטיקה) כדי להתאים לפונקציות פסיכומטריות של טופס⁶¹:
      Ψ(x; α, β, λ) = (1 -λ) * F(x; α, β)
      כאשר, F היא פונקציית Weibull, המוגדרת כ
      F(x; α, β) = , α הוא פרמטר ההזזה, β הוא פרמטר השיפוע ו- λ הוא קצב ההזזה.

תוצאות

בדיקת אישונים בוצעה בשלושה רופאי משפחה גברים בעלי פיגמנטציה, במשקל ~600-1,000 גרם במהלך הניסויים. כפי שמתואר בפרוטוקול זה, כדי להעריך את ספי סיווג הקריאות לרעש, נעשה שימוש בפרדיגמת oddball להצגת גירויים. בפרדיגמת ה-oddball, קריאות השייכות לקטגוריה אחת (יבבות) המשובצות ברעש לבן ב-SNR נתון שימשו כגירויים ...

Discussion

פרוטוקול זה מדגים את השימוש באישונים כשיטה לא פולשנית ואמינה להערכת ספי שמיעה בבעלי חיים המאזינים באופן פסיבי. בהתאם לפרוטוקול המתואר כאן, הוערכו ספי סיווג הקריאה לרעש אצל רופאי שמיעה תקינים. ערכי סף שהוערכו באמצעות אישונים נמצאו עקביים עם אלה שהתקבלו באמצעות אימון אופרנטי⁶²...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analog output board	Measurement Computing Corporation, Norton, MA	PCI-DDA02/12
Anechoic foam	Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN
Condenser microphone	Behringer, Willich, Germany	C-2
Free-field microphone	Bruel & Kjaer, Denmark)	Type 4940
Matlab	Mathworks, Inc., Natick, MA		2018a version
Monocular remote camera and illuminator system	Arrington Research, Scottsdale, AZ	MCU902	Infrared LED array + camera with infrared filter
Multifunction I/O Device	National Instruments, Austin, TX	PCI-6229
Neural interface processor	Ripple Neuro, Salt Lake City, UT	SCOUT
Piezoelectric motion sensor	SparkFun Electronics, Niwot, CO	SEN-10293
Pinch valve	Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL	EW98302-02
Programmable attenuator	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL	PA5
Silicon Tubing	Cole-Parmer		~3 mm
Sound attenuating chamber	IAC Acoustics
Speaker full-range driver	Tang Band Speaker, Taipei, Taiwan	W4-1879
Stereo Amplifier	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL	SA1
Tabletop - CleanTop Optical	TMC vibration control / Ametek, Peabody, MA
Viewpoint software	ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ