筛选精子以快速分离斑马鱼的种系编辑

摘要

CRISPR-Cas技术彻底改变了基因组编辑领域。然而，寻找和分离所需的种系编辑仍然是一个主要瓶颈。因此，该协议描述了一种使用标准PCR，限制性酶切和凝胶电泳技术快速筛选F0 CRISPR注射斑马鱼精子以进行种系编辑的稳健方法。

摘要

靶向CRISPR-Cas核酸酶技术的出现彻底改变了在已建立和新兴模型系统中进行精确基因组编辑的能力。CRISPR-Cas基因组编辑系统使用合成向导RNA（sgRNA）将CRISPR相关（Cas）核酸内切酶靶向特定的基因组DNA位点，其中Cas核酸内切酶产生双链断裂。通过固有的容易出错机制修复双链断裂会导致插入和/或删除，从而破坏位点。或者，在此过程中包含双链DNA供体或单链DNA寡核苷酸可以引发精确的基因组编辑，范围从单核苷酸多态性到小免疫标签甚至大荧光蛋白构建体。然而，这个过程的一个主要瓶颈可能是在种系中发现和分离所需的编辑。该协议概述了一种在 Danio rerio （斑马鱼）的特定位点筛选和分离种系突变的可靠方法;然而，这些原则可能适用于任何可以 体内精子收集 的模型。

引言

CRISPR（簇状规则间隔短回文重复序列）/Cas系统是在Danio rerio（斑马鱼）模型系统¹，^2，3，4中进行位点特异性诱变和精确基因组编辑的强大工具。Cas-核糖核蛋白 （RNP） 由两种主要成分组成:Cas核酸内切酶（通常为 Cas9 或 Cas12a）和位点特异性合成向导 RNA （sgRNA）⁵。Cas-RNP一起在所需的位点中产生双链断裂（DSB），可以通过两种内在修复机制之一进行修复。非同源端接 （NHEJ） 修复机制容易出错，并且通常会导致 DSB 周围的各种插入或缺失 （插入缺失）。如果这些插入缺失在所得蛋白质序列中引入移码突变或过早停止，则可能是有害的。或者，同源定向修复 （HDR） 机制使用供体模板，在 DSB 位点周围具有同源区域来修复损伤。研究人员可以利用HDR系统生成精确的基因组编辑。具体来说，他们可以共同注入双链DNA供体构建体，其中包含所需的编辑以及基因组中DSB位点两侧的同源区域。这些商业生产的CRISPR组件的规模经济的提高大大减少了筛选多个位点和为精确基因组编辑建立更大规模努力的障碍。然而，在有性繁殖动物模型中，一个主要瓶颈是种系稳定的突变动物的鉴定和分离。

斑马鱼模型系统表现出几个关键品质，可以增强其在反向遗传研究中的使用。它们很容易通过基本的水生住房设备大量饲养，雌性全年表现出很高的繁殖^力6。此外，它们的外部产卵和受精使它们适合显微注射CRISPR / Cas成分。Cas-RNP通常被注射到单细胞阶段斑马鱼胚胎中以产生DSB/修复，理论上，DSBs由所有子细胞遗传。然而，二倍体基因组需要两个DSB/修复事件来诱变两个同源染色体。此外，尽管Cas-RNP是在单细胞阶段注射的，但DSB/修复可能要到发育的后期才会发生。这些因素共同促成了注入F0的鱼的马赛克性质。一种常见的做法是杂交F0注入的鱼，并筛选F1后代的插入/特定编辑。然而，由于并非所有注射F0的鱼都具有种系突变，这种做法会导致许多非生产性杂交，无法产生所需的编辑。筛选F0种系而不是F1体细胞组织增加了分离所需种系编辑的可能性，并减少了该过程所需的动物数量。

精子可以很容易地从注射F0的斑马鱼中收集，而无需安乐死。此功能允许冷冻保存和再衍生冷冻精子原种⁷ ，但也可用于快速筛选，鉴定和分离所需基因组突变的种系携带者^8，9。Brocal等人（2016）之前描述了一种基于测序的方法，用于筛选注射F0的雄性斑马鱼¹⁰的种系编辑。虽然这种方法可用于鉴定种系中存在的突变等位基因，但在高通量下可能会变得昂贵，并且可能不适用于所有实验室。相比之下，目前的协议提供了一种平易近人且具有成本效益的基于电泳的策略来鉴定种系编辑。具体来说，该协议概述了使用高分辨率琼脂糖凝胶电泳筛选和分离特定位点种系突变的稳健方法。此外，该协议描述了一种类似的策略，用于识别包含特定编辑的供体构建体的成功整合。与往常一样，如果需要特定的编辑，可以与下面描述的协议一起执行基于测序的策略。尽管该协议特定于斑马鱼模型系统，但这些原则应适用于任何将精子收集作为常规程序的模型。总之，这些策略将允许鉴定具有种系插入缺失/编辑的F0注射雄性，这些插入缺失/编辑可以在标准聚合酶链反应（PCR）和/或限制性酶切后在凝胶上解决。

研究方案

这项研究是根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的指南进行的。该协议已获得德克萨斯大学奥斯汀分校动物护理和使用委员会 （AUP-2021-00254） 的批准。

1. 设计用于CRISPR诱变的sgRNA

1. 获取包含目标位点的外显子序列。
2. 设计具有原间隔邻基序 （PAM） 位点的合成向导 RNA（sgRNA），该位点特定于 Cas 核酸内切酶。
   1. 如果共注射供体构建体，请将sgRNA设计为具有尽可能接近所需编辑的预测切割位点。
      注意:APE是一款免费软件，带有查找Cas9 sgRNA位点的工具¹¹。或者，可以使用诸如CHOPCHOP之类的工具，它为设计sgRNA提供了一个在线界面，该界面考虑了Cas9和其他Cas 内切酶¹²的不同PAM位点。
3. 设计正向和反向引物，以扩增设计的CRISPR/Cas切割位点周围的区域。PCR产物的长度应约为200-400个碱基对（bp），以便能够在方案后期分离凝胶上的小插入缺失。
   注意:CHOPCHOP¹¹ 自动为其输出的每个 sgRNA 设计引物。
4. 可选:设计具有所需编辑的DNA供体构建体。
   1. 获得包含所需突变位点的外显子的基因组序列。
      注意:内含子序列可能因个体而异，因此最好避免在供体构建体中包含内含子序列，因为这可能会干扰同源依赖性修复途径。
   2. 如果需要特定的氨基酸变化，请相应地改变特定的密码子。
      注意:进行这些更改时，请注意密码子频率。如果可能，请选择使用率高的密码子。
   3. 为了防止CRISPR / Cas消化供体构建体，进行额外的同义突变，（i）破坏PAM和/或（ii）破坏sgRNA序列，更倾向于使非同 义 变化更接近PAM位点。
   4. 使用限制性内切位点查找器（APE¹¹ 也具有此功能）在野生型序列的预测 PCR 产物中查找独特的限制性位点（仅出现一次的位点）。
      1. 对预测的PCR产物重复此过程，以反映供体构建体的成功整合。
      2. 比较野生型序列和供体整合序列之间的限制性位点列表，以找到 仅 存在于编辑序列中的限制性位点。
      3. 如果没有找到唯一的限制性位点，请继续在供体构建体中进行同义更改，直到实现为止。
         注意:如果可能，继续进行同义突变，这些突变会破坏sgRNA与供体构建体的结合。
   5. 如果可能的话，将供体序列修剪到可管理的大小（50-100 bp），在预测的CRISPR / Cas切割位点周围至少有20 bp的同源性并进行编辑。
5. 获取设计的 sgRNA 和/或 DNA 供体寡核苷酸，以及基因分型所需的任何引物。
   注意:为了防止核酸酶消化DNA供体寡核苷酸，建议用硫代磷酸酯修饰DNA寡核苷酸5'和3'端的前三个磷酸键。
6. 将1nL注射混合物注射到单细胞阶段胚胎中。通常，标准注射混合物包含以下内容:
   1 μL 25 μM 位点特异性 sgRNA
   1 μL 25 μM Cas9 核酸内切酶
   可选:1 μL 3 μM DNA 供体构建体
   1. 使用不含 0.1 M RNase 的 KCl 使总体积达到 5 μL。
7. 让注射F0的个体发育成性成熟的成年人。其余方案侧重于筛选F0注射的雄性以进行种系编辑。

2. 设置育种池

1. 通过在F0雄性和雌性之间设置带有分隔器的繁殖池来主要F0雄配。
   1. 为了尽量减少所需的繁殖池数量，在每个水箱中设置三只雄性，对面有两只雌性。
      1. 在精子采集后，尽可能多地设置可以有效筛选和安置的F0男性。雌性的基因型并不重要，因为在此过程中不会收集它们的配子。
   2. 在雌性对面设置一个野生型雄性的繁殖池。野生型精子将作为手术后期解释结果的对照。
2. 将准备好的繁殖池孵育过夜。

3. 准备精子采集程序的材料

1. 准备足够的麻醉溶液（0.016%三卡因-HCl鱼水溶液）以装满一个小玻璃碗。
2. 将 40 μL 的 50 mM NaOH 分配到 0.2 mL PCR 管中。为将要收集的每个精子样本准备一根管。存放在冰上。
3. 为将在手术过程中取样的每条鱼准备单独的 0.8 升水箱。这些水箱将容纳采样的鱼，直到基因分型完成。
   注意:这是限制本协议中可以有效筛选的鱼类数量的主要因素。确保有足够的空间容纳采样的个体，直到基因分型完成。
4. 在鱼水中弄湿 1 英寸 x 1 英寸的海绵（用浅椭圆形凹槽切割，以在手术过程中将雄性斑马鱼腹侧朝上）并挤出多余的液体。
   1. 将海绵以低放大倍率放置在体视显微镜的视野中（图1A）。
   2. 放置倾斜的头顶照明以获得最佳观看效果。

4.麻醉雄鱼并收集精子

1. 准备一个干净的毛细管。
   1. 轻轻摇动管容器以释放单个毛细管。
   2. 将毛细管放入提供的灯泡中，并将其放在一边。
2. 将雄鱼转移到制备的麻醉溶液中（鱼水中0.016%三卡因-HCl）。
   1. 用漏勺轻轻搅拌溶液以加快麻醉过程。
   2. 一旦盖膜（鳃）运动减慢（约1-2分钟），继续进行精子收集。
3. 使用漏勺将鱼转移到一叠干净的纸巾上。
   1. 用漏勺轻轻滚动鱼以去除多余的水分。
   2. 用干净的折叠薄纸轻轻吸干鱼，以去除任何残留的水。
4. 使用漏勺将鱼转移到准备好的海绵上（图1B）。
   1. 将鱼的腹侧朝上，头部最靠近执行手术的人的惯用手。
   2. 用干净的折叠薄纸轻轻擦拭臀鳍周围的区域。
5. 收集精子。
   1. 使用毛细管的末端，轻轻地将骨盆鳍横向移离中线以露出泄殖腔（图1C）。
   2. 将毛细管的末端靠近泄殖腔。
   3. 使用镊子轻轻挤压鱼的侧面，从鳃下方开始，到泄殖腔结束（图1C'）。
   4. 通过毛细管作用将精子收集到毛细管中。大约 1 μL 足以完成此过程（图 1D）。
      注意:一些实验室报告使用p10移液管吸头而不是毛细管进行精子收集。
   5. 如果精子没有以温和的压力释放，请将鱼放回系统水中。
      1. 监测麻醉恢复情况。
      2. 不要用力挤压鱼以排出精子，因为这会伤害鱼。
      3. 让鱼休息 2 周，然后再尝试再次收集精子。
   6. 收集后，将鱼放入带有系统水的干净隔离池中，用于个人住房。
      1. 监测鱼从麻醉中恢复的情况。
      2. 让鱼休息 2 周，然后再尝试再次收集精子。
   7. 将带有收集的精子的毛细管放入制备的PCR管（40μL的50mM NaOH）中。
   8. 挤压橡胶球以排出收集的样品。
   9. 将用过的毛细管丢弃到批准的玻璃废物容器中。
   10. 将样品在冰上孵育，直到所有雄性都被挤压。
6. 对每个雄性重复步骤4.1-4.5。
7. 标记分离罐和精子样本，以便最终的精子基因分型结果可以追溯到具有假定突变的相应个体。
8. 监控所有人员，并确保他们直立并探索他们的坦克，然后再将坦克放回系统上。
9. 将用于启动的雌性放回系统上各自的水箱中。
10. 如果任何鱼在 10 分钟后没有从麻醉中恢复，请按照与实验室相关的机构批准的安乐死程序进行操作。
    1. 示例:在冰浴中用2-4°C的鱼水快速冷却个体。
    2. 根据与实验室相关的机构批准的程序，将安乐死的鱼丢弃在适当的动物尸体废物容器中。

5. 从精子样本中提取DNA

1. 在微型离心机中短暂旋转所有精子样品，并将PCR管放入热循环仪中。
2. 合上热循环仪的盖子。
3. 在热循环仪中运行以下设置:
   1. 将样品在95°C下加热40分钟。
   2. 将样品冷却至25°C。
4. 从热循环仪中取出样品。
5. 使用干净的移液器吸头对每个样品进行中和，加入 10 μL 的 1 M Tris-HCl（缓冲至 pH 8）来中和 pH。
6. 通过上下移液充分混合。
7. 在小型离心机中短暂旋转样品。
8. 基因组DNA样品可以在4°C下储存数天或在-20°C下放置长达6个月。

6. 所需基因座的PCR扩增（和/或限制性酶切）

1. 使用标准PCR方案扩增所需的位点。
   1. 在下面的PCR反应中将热循环仪预热至初始变性温度。
   2. 为PCR管中的每个精子样品制备25μL反应混合物:
      12.5 μL 2x Taq 聚合酶预混液
      1.5 μL 10 μM 正向引物
      1.5 μL 10 μM 反向引物
      4.5 μL 无核酸酶水
      5 μL 中和精子 DNA 样品
   3. 通过上下移液充分混合。
   4. 在小型离心机中短暂旋转样品。
   5. 使用以下设置将样品放入预热的热循环仪中:
      初始变性:95°C3分钟
      35个变性循环（95°C持续30秒），退火（55°C持续30秒）和延伸（72°C持续30秒）
      最终延伸:72°C5分钟
      注意:可能需要根据特定的Taq聚合酶和PCR扩增产物的预期长度调整延伸温度和/或时间。
   6. 从热循环仪中取出PCR样品。
2. 可选:对少量PCR产物进行供体特异性限制性酶切，留下至少5-10 μL未消化的PCR产物用于凝胶电泳。
   1. 在 0.2 mL PCR 管中制备 30 μL 反应:
      10 μL 未纯化的 PCR 产物
      15 μL 无核酸酶水
      3 μL 10x 限制性内切酶缓冲液
      2 μL 限制性内切酶（BstNI 用于分析 dnah10 敲入等位基因的代表性结果）
      注意:许多限制性内切酶在典型的PCR反应缓冲液中仍然有效;然而，添加限制性酶切缓冲液有助于改善结果。如果出现任何问题，请参阅特定制造商的说明以进行故障排除。
   2. 通过上下移液充分混合。
   3. 在小型离心机中短暂旋转样品。
   4. 将样品放入具有以下设置的热循环仪中:
      1. 在60°C下切割PCR扩增子1小时。
         注意:可能需要根据所使用的特定限制性内切酶调整切割温度和孵育时间。
      2. 如果制造商指示，则以所需的温度和孵育时间灭活限制性内切酶。
         注意:BstNI酶不需要热灭活。

7. 进行凝胶电泳以分离不同大小的PCR扩增子

1. 准备 500 mL 的 0.5x TBE 电泳缓冲液:将 50 mL 的 10x TBE 缓冲液浓缩物加入 450 mL 去离子水中。
2. 在 0.5x TBE 电泳缓冲液中制备 100 mL 4% 琼脂糖凝胶:将 4 g 琼脂糖和 10 μL 10，000x 凝胶染色剂加入 100 mL 0.5x TBE 电泳缓冲液中。微波直至琼脂糖粉末完全溶解。
   1. 将凝胶溶液倒入适当大小的凝胶灌制框架中，然后将梳子插入凝胶的一侧。
      注意:较大的凝胶尺寸（推荐:15 cm x 15 cm）对于此过程是有利的，因为它为扩增子提供了更多的空间来分离凝胶。
      1. 如果要分析限制性酶切产物，最好将其与PCR产物在同一凝胶上运行，以便比较结果。根据需要调整梳孔尺寸，以将所有样品放在凝胶上。
   2. 将凝胶保持在室温下直至凝固。小心地取下梳子。小心地从浇注架上取出凝胶。
3. 设置凝胶电泳台。
   1. 将凝胶放置在电泳台中，使孔最靠近负极。将0.5x TBE电泳缓冲液倒入电泳台中，直到孔完全浸没。
4. 加载凝胶。
   1. 将 5 μL DNA 分子量标准品加载到第一个孔中（选择包含与 PCR 扩增子大小相似的 DNA 片段的 DNA 分子量标准）。
   2. 对每个样品（包括野生型对照样品）使用新的移液器吸头，将 5-10 μL PCR 产物加载到剩余孔中。
   3. 可选:如果要分析限制性酶切产物，请将这些样品也加载到凝胶上。
      注意:最好在PCR和限制性酶切产物之间加载等量的DNA。例如，在 30 μL 限制性酶切反应混合物中，加入 10 μL PCR 产物。因此，15 μL 消化产物的 DNA 浓度与 5 μL 未纯化的 PCR 产物相当。
5. 运行凝胶。
   1. 将电极连接到凝胶电泳台，并施加150 V至少1小时以确保扩增子的充分分离。
   2. 对凝胶进行成像以查看DNA条带。
      注意:强诱变的CRISPR靶向位点将以多个条带大小运行，代表插入/缺失等位基因与野生型扩增子的组合。
      1. 如果凝胶条带在1小时后未分离，则每隔150分钟向凝胶施加150 V，直到条带在凝胶上充分分离。
      2. 可选:如果筛选精确编辑（如 SNP、表位标签或荧光标签）的插入，请使用特定于所需编辑的 PCR 方法筛选精子 DNA。例如，在鉴定供体特异性限制性位点时，与精子样本的PCR产物相比，限制性酶切产物中将存在额外的条带。

8. 分离种系稳定等位基因

1. 从精子挤压过程中休息 2 周后，超越精子基因组 DNA 包含所需编辑的 F0 个体。
   注意:斑马鱼中单个精原体克隆的精子生成可能是周期性的;因此，所需的等位基因在异交时可能不会产生精子。出于这个原因，可能必须进行多次额外的杂交，以分离与初始筛选有关的等位基因。
2. 一旦F1杂交鱼性成熟，使用在精子基因组DNA筛选期间执行的相同PCR和凝胶电泳方案进行标准基因分型方法（例如，鳍夹DNA）。
   1. Sanger对PCR产物进行测序，以鉴定具有相同所需编辑的F1个体。
   2. 可选:如果所需的编辑引入或中断限制性站点，请使用适当的限制摘要协议进行筛选。
3. 具有相同所需编辑的杂交 F1 杂合子。
4. 筛选 F2 后代的预期表型和/或基因组编辑。

结果

该协议中描述的实验方法允许通过专注于分析来自F0注射的男性精子收集的数千个基因组来更快速地识别基因组编辑或假定的有害等位基因。 图 2 重点介绍了如何解释使用此协议获得的结果。

为了在p2ry12位点中产生突变，向单细胞阶段斑马鱼胚胎注射Cas9核酸内切酶和p2ry12特异性sgRNA（图2B，灰色突出显示）。将注射F0?...

讨论

该协议描述了一种通过聚焦分析F0男性精子基因组，使用CRISPR-Cas技术快速表征假定基因组编辑或靶向突变的方法。该协议应适用于其他动物模型，其中精子很容易采样而无需安乐死。这种方法将提高筛选所需编辑的吞吐量，对于识别罕见的 HDR 介导的敲入事件特别有用。这种方法还有助于减少用于寻找稳定种系编辑的实验动物的数量，通过促进从推定的F0载体中快速筛选一个精子样本中潜在的数千...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose powder	Fisher BioReagents	BP1356-100
Breeding tanks	Carolina Biological	161937
BstNI Restriction Enzyme	NEB	R0168S
Cas9 Endonuclease	IDT	1081060
DNA Ladder, 100 bp	Thermo Scientific	FERSM0241
dnah10 donor construct	Sigma-Aldrich	DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3')
dnah10 forward primer	Sigma-Aldrich	DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')
dnah10 reverse primer	Sigma-Aldrich	DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3')
dnah10 synthetic sgRNA	Synthego	Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'
Electrophoresis power supply	Thermo Scientific	105ECA-115
Filter forceps	Millipore	XX6200006P
Fish (system) water	Generic	n/a
Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber)	Thermo Scientific	B2
Gel imaging light box	Azure Biosystems	AZI200-01
Gel stain, 10000X	Invitrogen	S33102
Glass bowl, 250 mL	Generic	n/a
Isolation tanks, 0.8 L	Aquaneering	ZT080
Microcap capillary tube with bulb, 20 µL	Drummond	1-000-0020/CA
Minicentrifuge	Bio-Rad	12011919EDU
Micropipettes, various with appropriate tips	Generic	n/a
Microwave	Generic	n/a
Nuclease free water	Promega	P119-C
Paper towels	Generic	n/a
PCR tubes, 0.2 mL	Bioexpress	T-3196-1
Plastic spoon, with drilled holes/slots	Generic	n/a
KCl solution, 0.2 M RNAse Free	Sigma-Aldrich	P9333
p2ry12 forward primer	Sigma-Aldrich	DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3')
p2ry12 reverse primer	Sigma-Aldrich	DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3')
p2ry12 synthetic sgRNA	Synthego	Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'
Restriction Enzyme 10X Buffer	NEB	B6003SVIAL
NaOH solution, 50 mM	Thermo Scientific	S318; 424330010
Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot	Generic	n/a
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 508
Taq polymerase master mix, 2X	Promega	M7122
TBE Buffer Concentrate, 10X	VWR	E442
Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
Tissue paper	Fisher Scientific	06-666
Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2)	Syndel	200-266
Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0)	Promega	H5131