兔子缺血和再灌注损伤模型

摘要

本研究展示了兔子急性局部心肌缺血和再灌注损伤的高度可重复动物模型，使用左侧微型开胸术治疗生存病例或中线胸骨切开术治疗非生存病例。

摘要

这里的方案提供了一种简单、高度可重复的方法，用于非生存和生存实验在兔子中诱导原 位 急性区域心肌缺血。新西兰白成年兔用阿托品、乙酰丙嗪、布托啡醇和异氟烷镇静。对动物进行插管并置于机械通气状态。将静脉导管插入边缘耳静脉以输注药物。用肝素、利多卡因和乳酸林格氏液预先给动物用药。进行颈动脉切断术以获得动脉管路以监测血压。通过连续实时分析监测和记录选定的生理和机械参数。

在动物镇静并完全麻醉的情况下，进行第四个肋间小左开胸术（存活）或中线胸骨切开术（非存活）。打开心包，找到左前降支 （LAD）。

聚丙烯缝合线绕过LAD动脉的第二或第三对角线分支，聚丙烯长丝穿过一个小乙烯基管，形成圈套。动物经受30分钟的局部缺血，通过收紧圈套来闭塞LAD。心肌缺血可通过心外膜局部发绀在视觉上确诊。局部缺血后，结扎松动，心脏重新灌注。

对于生存和非生存实验，都 可以通过 超声心动图 （ECHO） 测量缩短分数来评估心肌功能。对于非生存研究，可以使用植入缺血区域的三个数字压电超声探头和使用根尖插入的左心室 （LV） 导管的左心室发育压力 （LVDP） 收集的超声显微测量数据可以连续获取，分别用于评估区域和整体心肌功能。

对于生存研究，切口闭合，进行左针胸腔穿刺术以清除胸腔空气，并实现术后疼痛控制。

引言

心血管疾病是世界上的主要死亡原因，每年导致超过1800万人死亡^1,2,3。急性心肌梗死 （MI） 是一种常见的医疗急症，当血凝块或一块动脉粥样硬化斑块阻塞冠状动脉的血流时就会发生。这会导致动脉灌注区域的局部心肌缺血。

本研究描述了一种方案，该方案利用一种简单可靠的方法在兔模型中创建原位急性区域心肌缺血，用于非生存和生存实验。该方法的最初目标是评估线粒体移植对调节心肌坏死和增加缺血事件后缺血后心脏功能的影响。先前的研究表明，在缺血发作和氧气供应减少后，线粒体改变和高能磷酸盐水平迅速下降，导致心脏能量储存急剧下降⁴.研究人员试图使用药物干预和/或程序技术来改善缺血后功能并减轻心肌组织坏死，但这些技术提供的心脏保护有限，对线粒体损伤和功能障碍的影响最小 ^5,6,7。我们的团队和其他人之前已经表明，线粒体损伤主要发生在缺血期间，并且随着再灌注期间线粒体呼吸功能的保留，收缩恢复可以增强，心肌梗死面积减小 ^8,9,10。因此，我们假设线粒体从未受缺血影响的组织移植到再灌注前的缺血区域将提供一种减少心肌坏死和增强心肌功能的替代方法。在此，我们详细介绍了用于测试该理论的协议以及从我们的初步研究分析中获得的代表性结果。

此外，一些研究人员还关注了其他主题，这些主题对于确定心肌缺血再灌注损伤的影响和建立适当的治疗干预措施至关重要。其中一个研究领域是预处理。心肌缺血预处理是一种由短暂缺血应激激活的心脏保护机制，可在随后的长期缺血发作期间降低心肌细胞坏死率。这些机制可以通过缺氧或冠状动脉闭塞激活。Mandel 等人证明，缺氧-高氧预处理有助于维持一氧化氮代谢物的平衡，减少内皮素-1 的过度产生，并支持器官保护¹¹。此外，还探讨了远程缺血预处理的概念，这是一种单器官预处理提供全身保护的现象。Ali 等人发现，在接受择期开腹主动脉瘤修复术的患者中，通过间歇叉夹住髂总动脉作为刺激进行远程预处理可降低术后心肌损伤、心肌梗死和肾功能损害的发生率¹²。

与其他物种的模型相比，兔子模型具有潜在的优势，并且几十年来一直用于多种不同的场景，包括心律失常的诱导、全球和区域缺血模型以及心脏收缩研究等^13,14,15。虽然兔子的心脏比狗或猪的心脏小，但它足够大，可以以更低的成本轻松进行外科手术¹³.兔子心脏经常被使用，因为它与人类的心脏非常相似;事实上，它具有相似的代谢率，表达β-肌球蛋白重链，并且缺乏显着的心肌黄嘌呤氧化酶¹⁶。本文所描述的诱导局部心肌缺血的技术是简单、可重复且具有成本效益的。这种方法允许非生存和生存病例，因为仅诱导局部缺血而不是全局缺血，并且所需的材料是非特异性的。可以使用两种不同的手术方法（即胸骨切开术和微型开胸术），从而在研究设计方面为操作员和实验方案提供了更大的自由度。此外，该手术不需要使用体外循环。在这种情况下，冠状动脉旁路移植术的微创方法已成为需要多血管血运重建的患者的宝贵替代方案^17,18。该模型可用于研究这些方法之间的差异，并为外科实习生提供基于动物的学习工具。此外，利用该模型进行心导管插入术可能有助于生理学研究和/或外科训练。

我们的模型为诱导区域心肌缺血并随后测量梗死大小、心肌功能和细胞变化的应用提供了一种方法。通过该协议，我们已经能够通过检查细胞器的内化、耗氧量、高能磷酸盐合成以及细胞因子介质和蛋白质组学途径的诱导来评估细胞功能和对缺血的适应以及拟议的治疗干预（即线粒体移植）的几个标志物。这些结果对于保持心肌能量、细胞活力和心脏功能非常重要，并允许客观评估缺血再灌注损伤后的心脏保护技术。该模型可用于研究缺血后心肌病理学和恢复领域的类似生物学途径和替代方案。

该方案的目标是提供一种高度可重复的方法，以诱导兔子原位急性局部心肌缺血，用于非生存和生存实验。该模型提供了一种高生存率、低术中死亡率和最低发病率的方法¹⁹。已经使用放射性标记材料、造影剂、磁共振成像或计算机模拟描述了急性区域心肌缺血的其他模型^20,21,22。我们的方案提供了一种可靠且简单的方法，该方法具有成本效益，始终如一的可重复性，并且技术要求低，因此可以由没有手术专业知识的研究人员执行。该协议适用于使用左侧迷你开胸术的生存项目或使用中线胸骨切开术的非生存模型。

研究方案

这项调查是根据美国国立卫生研究院的动物护理和使用指南进行的，并得到了波士顿儿童医院动物护理和使用委员会的批准（协议 20-08-4247R）。所有动物均按照《实验动物护理和使用指南》的规定得到人道照顾。

1.动物种类、麻醉剂和镇痛剂

1. 动物种类:使用新西兰白兔（野生型品系;雌性;性成熟15-20周龄;体重3-4公斤）进行实验研究。
2. 麻醉和镇痛剂:
   1. 以 0.01 mg/kg 肌内 （IM） 的剂量使用阿托品
   2. 使用乙酰丙嗪，剂量为 0.5 mg/kg 肌注进行初始镇静，使用 0.5 mg/kg 静脉注射 （IV） 进行完全麻醉。
   3. 以 0.5 mg/kg 肌注的剂量使用布托啡诺。
   4. 通过精密汽化系统面罩以 3% 进行诱导，然后以 1%-2% 的速度进行插管，以 2 L/min 的速度以 100% 的速度使用氧气 （O2），以 1% 的速度进行全身麻醉以维持。
   5. 使用美托咪定，剂量为 0.25 mg/kg 肌注。
   6. 使用氯胺酮，剂量为 10 mg/kg IV。
   7. 在开胸部位使用布比卡因肋间阻滞，剂量不超过 3 mg/kg 肌注。
   8. 使用 1% 利多卡因，剂量为 1-1.5 mL/kg IV。
   9. 使用1-4μg/ kg芬太尼透皮贴剂72小时。

2. 程序步骤（图1）

1. 单次肌内注射阿托品、乙酰丙嗪和布托啡诺，镇静新西兰白兔成年兔。 通过 精密汽化系统面罩用3%异氟烷诱导动物。
2. 气管插管盲法前的准备工作（即，没有声门可视化）
   1. 用 1% 利多卡因喷洒喉部以防止喉痉挛。
   2. 预先测量兔子外侧从牙齿到预测隆突的气管插管 （ETT） 长度，并将兔子置于胸骨卧位，颈部伸展。
3. 在1%-2%的连续吸入麻醉剂和100%的O₂ 下以2L / min的连续吸入麻醉剂插管动物，用带袖带的儿科尺寸（3-0或3-5内径）ETT插管。
   1. 将 ETT 插入口腔，并将其穿过环面进入咽部。
   2. 推进 ETT，直到管尖接触声门或呼吸音消失，表明管尖已通过声门开口。
   3. 稍微抽出管子，直到呼吸声恢复，然后再次前进，并将管子固定到位。
4. 用机械支持给动物通气（潮气量:10 mL/kg，吸入 O 2 分数:40%，呼吸频率:30-40 次/分钟，呼气末正压:5-10 cmH₂O）。
   1. 根据耐受情况调整 FiO2，以达到 O₂ 饱和度大于 92% 的饱和度（通过脉搏血氧饱和度测量），以防止高氧，高氧会引起全身炎症反应。
5. 通过体格检查（即听诊）、临床体征（即观察气管插管末端的冷凝）和客观测量（即呼气末二氧化碳）来验证 ETT 的正确放置。
6. 大约 10 分钟后，向兔子肌内注射美托咪定，以同时提供麻醉和镇痛作用。
7. 在手术过程中用 1% 异氟烷维持全身麻醉。
8. 将 22 G IV 导管插入边缘耳静脉，并用胶带固定以获得外周静脉通路。
   注意:股静脉可用作静脉通路的替代部位。
   1. 用乙酰丙嗪静脉注射和氯胺酮静脉注射完全麻醉动物。
   2. 切开前，以 3 mg/kg IV 的剂量注射 1,000 U/mL 肝素。
      1. 初始剂量为 3 mg/kg 的 1,000 U/mL 肝素，每小时重新给药直至实验结束，以维持 >400 秒的活化凝血时间，符合当前的手术方案。
   3. 如果手术期间发生心室颤动，则根据需要给予 1% 利多卡因静脉注射和/或心外膜异步除颤。心室颤动通常在服用一剂或两剂利多卡因后停止。
   4. 以 10 mL/kg/h 的速度连续灌注乳酸林格氏溶液。
      注意:鉴于施用的液体量小且手术时间短，本研究中的动物在拔管前或恢复期间不需要利尿。如果动物出现肺部状态恶化（即增加呼吸机设置、听诊肺水肿的证据等），建议利尿。
9. 进行颈动脉切除术，并放置 4 或 5 法式动脉管，以方便术中动脉血压 （BP） 的监测。
   注意:股动脉可用作动脉通路的替代部位。
10. 通过连续实时分析监测和记录所有生理和机械变量。
    1. 用颈动脉管监测动脉血压，并通过放置在剃光爪上的传感器使用脉搏血氧饱和度记录 O₂ 饱和度。
    2. 使用心电图 （ECG） 进行监测，其中包含三个肢体导联:I、II 和 III，以及三个计算增强导联:aVL、aVR 和 aVF。
       1. 在缺血前基线、缺血期间、再灌注期间以及恢复的第 7-28 天（如果进行生存研究）连续记录心电图示踪。
    3. 通过持续监测血压和心率 （HR） 来监测镇静水平。
    4. 用直肠探头监测温度。
    5. 使用左侧胸骨旁和根尖视图的 2D ECHO 来评估生存和非生存病例在所需时间点的心肌功能。
       1. 通过测量左心室舒张末期距离 （LVEDD） 和左心室收缩末期距离 （LVESD） 并使用以下公式，使用缩短分数 （FS） 评估心肌功能:
          FS = （LVEDD − LVESD）/LVEDD × 100
11. 在手术过程中，将动物放在循环热水毯上，以保持稳定的核心体温。
12. 以无菌方式准备和覆盖动物:
    1. 剃掉手术部位，并用甜菜碱和 70% 异丙醇准备，每份一式三份。用无菌纱布垫拍干该区域，并用无菌毛巾覆盖整个动物。
13. 左侧小开胸术（生存研究）
    1. 使用布比卡因肌内注射在预定的开胸部位进行肋间阻滞。
    2. 切口前通过耳静脉注射 1% 利多卡因。
    3. 通过沿第五肋骨上部的第四肋间进行左侧微型开胸手术，以避开平行于每根肋骨下表面的神经肌肉束。
       1. 进行前外侧开胸手术，以获得心脏前外侧表面的最佳可视化（即 LAD 对角分支的解剖位置）。
       2. 使用枕头或豆袋将兔子左侧抬高约 30°。
       3. 将兔子的同侧腿固定在头顶上方，为手术区域和肋骨间隙腾出空间。
       4. 用毡尖标记笔触诊并勾勒出骨性标志，包括肋骨、胸骨和肩胛骨。使用 #10 刀片切开覆盖在第五根肋骨上的皮肤。确保切口与肋骨平行。
       5. 使用电烙术将胸大肌和前锯肌分开。用电烙术将第五肋骨正上方的海岸间肌肉分开，以保留神经血管束。
       6. 小心地通过第四肋间隙进入胸膜腔，进行尖锐或钝性夹层。通过尖锐或钝性解剖将初始胸膜切口平行于肋骨的两个方向延伸，直到可以插入肋骨扩张器或胸骨牵开器。
    4. 在肋骨间隙内放置肋骨扩张器或胸骨牵开器，并扩大以提供心脏和心包囊的充分可视化。用 DeBakey 镊子提起心包，并用 Metzenbaum 剪刀打开心包。
    5. LAD动脉隔离
       1. 用锥形针上的聚丙烯缝合线 （3-0） 包围 LAD 动脉的第二或第三对角线分支。取下针头，将聚丙烯长丝的两端穿过一根小乙烯基管，形成一个圈套。
       2. 在圈套和冠状动脉之间放置一个垫子，以避免结扎损伤冠状动脉和/或引起血管痉挛。
          1. 使用 DeBakey 镊子，拿起一个矩形 PTFE 毛毡（约 7 毫米 x 3 毫米）。将 pledget 放在两根聚丙烯长丝之间，以便在圈套收紧时将其夹在隔离的 LAD 动脉和乙烯基管之间。
14. 胸骨中线切开术（非生存研究）
    注意:中线胸骨切开术方法非常适合非生存病例，对于这些病例，可以使用 LVDP 和超声显微测量法进行更具侵入性的监测。
    1. 使用弯曲的梅奥剪刀进行中线胸骨切开术。放置胸骨牵开器，并将其加宽，以提供心脏和心包囊的充分可视化。
    2. 用 DeBakey 镊子提起心包，并用 Metzenbaum 剪刀打开心包。
    3. 放置三个压电超声显微晶体:
       1. 在左心室的心外膜上做三个 1 毫米的小切口，形成一个三角形的角。将压电超声显微晶体置于心外膜切口内。
       2. 用 5-0 聚丙烯 U 型缝线将电线固定到心脏表面。使用超声显微测定法记录时，暂停机械通气，以便准确记录两到三次心跳。
          注意:如果心脏纤维化，1% 利多卡因无效，并且需要心外膜除颤，请关闭超声显微计，并将其与数据采集系统断开，以保护两者免受电输入的影响。
    4. LAD动脉隔离:
       1. 用锥形针上的聚丙烯缝合线 （3-0） 包围 LAD 动脉的第二或第三对角线分支。
       2. 取下针头，将聚丙烯长丝的两端穿过一根小乙烯基管，形成一个圈套。
       3. 在圈套和冠状动脉之间放置一个垫子，以避免结扎损伤冠状动脉和/或引起血管痉挛。
       4. 使用 DeBakey 镊子，拿起一个矩形 PTFE 毛毡（约 7 毫米 x 3 毫米）。将 pledget 放在两根聚丙烯长丝之间，以便在圈套收紧时将其夹在隔离的 LAD 动脉和乙烯基管之间。
    5. LVDP的测量:
       1. 在左心室顶点放置一个 5-0 聚丙烯 U 形缝线，用 11 刀片在左心室顶点做一个 1 毫米的小切口。
       2. 将 3 法式球囊导管插入左心室腔。通过将导管绑在 5-0 聚丙烯 U 型缝合线上，将导管固定到 LV。
       3. 将导管连接到连接到监视器的换能器以记录 LVDP。使用数据采集系统记录LVDP（如下所述）。将导管归零以记录血流动力学变量，方法是将三通旋塞阀打开到空气中并在监视器上归零。
    6. 数据采集系统
       1. 在正在使用的计算机/笔记本电脑上启动数据采集系统（参见 材料表）。将电线从显示器连接到计算机/笔记本电脑。
       2. 在数据采集系统上选择 通道 1 ，并将其命名为 LVDP。使用监视器将换能器归零。
          注意: 如果将 BP 和 HR 连接到数据采集系统，请遵循相同的过程:将电线连接到笔记本电脑，选择 通道，如果测量 BP，则为零。
15. 通过向下按压乙烯基管同时拉起聚丙烯缝合线细丝来收紧圈套来闭塞冠状动脉。用蚊子夹保持所需的密封性，方法是直接夹住管子并将其固定到位。
16. 通过心外膜的区域紫绀目视确认心肌缺血。区域缺血也可以在心电图上确认，伴有 ST 段和 T 波改变。
17. 目视确认后，在麻醉下诱导区域缺血30分钟。
    1. 在区域缺血期间的 0 分钟、10 分钟、20 分钟和 30 分钟，通过 2D ECHO 评估生存和非生存病例的 FS。
    2. 对于非生存病例，在缺血前时间、心肌缺血时间和缺血后时间连续评估 LVDP 和超声显微测量。
    3. 如果需要，用留在原位的聚丙烯缝合线再次结扎动脉来勾勒出有风险的区域。交叉夹住主动脉，并使用心肌麻痹针通过主动脉注射 98%（在 PBS 中以 1:5 稀释）的 Monastral Blue 色素。心肌的灌注区域将染成蓝色，而有风险的区域将保持未染色。
    4. 持续监测和记录 HR、BP 和 O₂ 饱和度。
    5. 让动物恢复2小时（非存活）或28天（存活）。
       注意:心电图可用于确认再灌注。虽然在本研究进行的实验中未见，但低钾血症通常可在再灌注期间发生，可以通过钾控制或适当的输注来纠正。
18. 程序结束
    1. 生存案例
       1. 在生存情况下，修剪用于军鼓的 3-0 聚丙烯线，将末端松散地绑在一起，然后将其留在原位。通过 3-0 聚丙烯线确定有风险的区域和梗塞区域。
       2. 手术完成后，将切口分三层闭合。
          1. 通过在肋骨周围绑上两根 2-0 polyglactin 910 八字形缝线来关闭第一层。
          2. 用 3-0 聚二恶烷酮缝合线以跑步方式闭合肌肉层和皮下层。
          3. 使用 5-0 单丝缝合线以皮下方式闭合皮肤。使用埋藏式缝合线，以尽量减少动物感受到的刺激。
       3. 通过针刺胸腔穿刺术排空胸膜空气。
       4. 使用芬太尼透皮贴剂 72 小时，以促进术后疼痛管理。
       5. 在术后 1 周和 2 周的时间点进行经胸超声心动图，以评估 FS 的趋势。
       6. 在预定的恢复期之后，如上所述对动物进行镇静、插管和麻醉。进行正中胸骨切开术。暴露并打开心包囊。在深度麻醉下对兔子实施安乐死，将心脏 整体切除，让动物通过放血而死亡。
    2. 非生存病例
       1. 实验后，确保深度麻醉，完全暴露心脏，并将其 整体 取出进行生化和组织分析。动物因放血而死亡。

结果

按照方案（图1），通过心外膜紫绀的直接可视化立即确认心肌缺血。

在缺血前、缺血期间和再灌注时连续记录标准心电图（三根肢体导联:I、II 和 III，以及三根计算增强导联:aVL、aVR 和 aVF）（图 2）。心电图显示心动过速、心律失常（即心室颤动）、传导系统缺陷（即束支传导阻滞）、梗死相关 Q 波的发展和 ST 段偏差

讨论

我们的方案展示了一种在兔子中进行急性局部心肌缺血的可靠方法。左侧微型开胸手术方法非常适合生存病例，必须尽量减少切口和相关疼痛。重要的是，拔管前不需要利尿剂治疗，非生存组术中或术后 4 周时没有死亡率。当方案的设计需要非生存病例时，或者当需要更详细地监测整体和区域心肌功能时，可以使用中线胸骨切开术（图 1）。

该方案最关...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 blade	Bard Parker	371210
#11 blade	Fisher Scientific	B3L
22 G PIV needle	BD Insyte	381423
Acepromazine	VETONE	NDC 13985-587-50	0.5 mg/kg IM and IV
Aline pressure bag	Infu-Stat	2139
Angiocath	Becton Dickinson	382512
Arterial Catheter	Teleflex	MC-004912
Atropine	Hikma Pharmaceuticals	NDC 0641-6006-01	0.01 mg/kg IM
Betadine and 70% isopropyl alcohol	McKesson	NDC 68599-2302-6
Blood gas machine	Siemens	MRK0025
Bovie	Valleylab	E6008
Bulldog clamps	World Precision Instruments	14119
Bupivacaine	Auromedics	NDC 55150-249-50	3 mg/kg IM
Butorphanol	Roxane	NDC 2054-3090-36	0.5 mg/kg IM
Clear acetate sheet	Oxford Instruments	ID 51-1625-0213
Clipers	Andis	AGC2
DeBakey forceps	Integra	P6280
Echocardiography machine	Philips	IE33 F1
Electrocardiography machine	Meditech	MD908B
Endotracheal tube	Medline	#922774
Fentanyl	West-Ward	NDC 0641-6030-01	1–4 µg/kg transdermal patch
Formaldehyde solution 10%	Epredia	94001
Glass plates	United Scientific	B01MUHX6MR
Heparin Sodium	Sagent	NDC 69-0058-02	1000U in 1 mL 3 mg/kg
Hot water blanket	3M	55577
Isoflurane	Penn Veterinary Supply, INC	NDC 50989-606-15	1%–3%
Ketamine	Dechra	NDC 42023-138-10	10 mg/kg IV
Lab Chart 7 Acquisition Software	Adinstruments
Lactated Ringer's solution	ICUmedical	NDC 0990-7953-09	10 mL/kg/h
Laryngoscope	Welch Allyn	68044
Left ventricule lumen catheter 3Fr	McKesson	385764-EA
Lidocaine (1%)	Pfizer	4276-01	1–1.5 mL/kg IV
LVDP transducer	Edward	PDP-ED
Marking pen	Viscot	1451SR-100 Unsterile
Mayo scissors	Mayo	S7-1098
Medetomidine	Entireoly Pets Pharmacy	NDC 015914-005-01	0.25 mg/kg IM
Metzenbaum scissors	Cole-Parmer	UX-10821-05
Monastra. Blue pigment 98%	Chemsavers	MBTR1100G
Monocryl 5-0	Ethicon	Y463G
Mosquito clamp	Shioda	802N
PDS 3-0	Ethicon	42312201
Piezoelectric sonomicrometry crystals	Sonometrics	Small 2mm round
Plegets	DeRoyal	32-363
Povuine Iodine Prep Solutions	Medline	MDS093940
Precision vaporized system face mask	Yuwell	B07PNH69BF
Prolene 3-0	Ethicon	8665G
Proline 5-0	Ethicon	8661G
Pulse oximetry probe	Masimo	9216-U
Rib spreader	Medline	MDS5621025
S12 Pediatric Sector Probe	Phillips	21380A
Sonomicrometer	Sonometrics	BZ10123724
Sterile gauze	Medline	3.00802E+13
Sterile towels	McKesson	MON 277860EA
Sternal retractor	Medline	MDS5610321
Sutures for closure	J&J Dental	8698G
Telemetriy monitor	Meditech	MD908B
Temperature probe	Omega	KHSS-116G-RSC-12
Triphenyl tetrazolium chloride (1%)	Millipore	MFCD00011963
Ventilator	MedGroup	MSLGA 11
Vicryl 2-0	Ethicon	V635H
Vinyl tubing	ABE	DISW 3001