Modell der Ischämie und Reperfusionsschädigung bei Kaninchen

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie zeigt ein hochgradig reproduzierbares Tiermodell der akuten regionalen myokardialen Ischämie und Reperfusionsschädigung bei Kaninchen unter Verwendung einer linken Mini-Thorakotomie für Überlebensfälle oder einer Mittellinien-Sternotomie für Nicht-Überlebensfälle.

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll bietet eine einfache, hochgradig replizierbare Methodik zur Induktion einer akuten regionalen myokardialen In-situ-Ischämie beim Kaninchen für Nicht-Überlebens- und Überlebensexperimente. Das ausgewachsene neuseeländische weiße Kaninchen wird mit Atropin, Acepromazin, Butorphanol und Isofluran sediert. Das Tier wird intubiert und mechanisch beatmet. Für die Infusion von Medikamenten wird ein intravenöser Katheter in die marginale Ohrvene eingeführt. Das Tier wird mit Heparin, Lidocain und Ringer-Laktationslösung vorbehandelt. Es wird eine Verkleinerung der Halsschlagader durchgeführt, um einen arteriellen Zugang zur Blutdrucküberwachung zu erhalten. Ausgewählte physiologische und mechanische Parameter werden durch kontinuierliche Echtzeitanalyse überwacht und aufgezeichnet.

Wenn das Tier sediert und vollständig betäubt ist, wird entweder eine vierte Thorakotomie im kleinen linken Interkostalraum (Überleben) oder eine Sternotomie in der Mittellinie (Nicht-Überleben) durchgeführt. Der Herzbeutel wird eröffnet und die linke vordere absteigende Arterie (LAD) lokalisiert.

Ein Polypropylen-Nahtmaterial wird um den zweiten oder dritten diagonalen Ast der LAD-Arterie geführt, und das Polypropylen-Filament wird durch ein kleines Vinylrohr gefädelt, wodurch eine Schlinge entsteht. Das Tier wird einer 30-minütigen regionalen Ischämie ausgesetzt, die durch Verschluss der LAD durch Anziehen der Schlinge erreicht wird. Die myokardiale Ischämie wird visuell durch eine regionale Zyanose des Epikards bestätigt. Nach einer regionalen Ischämie wird die Ligatur gelockert und das Herz kann wieder durchblutet werden.

Sowohl für Überlebens- als auch für Nicht-Überlebensexperimente kann die Myokardfunktion über eine echokardiographische (ECHO) Messung der fraktionellen Verkürzung beurteilt werden. Für Nicht-Überlebensstudien können kontinuierlich Daten aus der Sonomikrometrie erfasst werden, die mit drei digitalen piezoelektrischen Ultraschallsonden gesammelt wurden, die in den ischämischen Bereich implantiert wurden, und der linke Ventrikel entwickelte Druck (LVDP) mit einem apikal eingeführten Katheter des linken Ventrikels (LV) zur Bewertung der regionalen bzw. globalen Myokardfunktion erfasst werden.

Für Überlebensstudien wird der Schnitt geschlossen, eine Thorakozentese der linken Nadel zur Evakuierung der Pleuraluft durchgeführt und eine postoperative Schmerzkontrolle erreicht.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache weltweit und tragen jedes Jahr zu über 18 Millionen Todesfällen bei ^1,2,3. Ein akuter Myokardinfarkt (MI) ist ein häufiger medizinischer Notfall, der entsteht, wenn ein Blutgerinnsel oder ein Stück atheromatöser Plaque den Blutfluss einer Koronararterie blockiert. Dies führt zu einer regionalen myokardialen Ischämie in dem Gebiet, das die Arterie durchblutet.

Die vorliegende Studie beschreibt ein Protokoll, das eine einfache und zuverlässige Methodik verwendet, um in situ eine akute regionale myokardiale Ischämie in einem Kaninchenmodell für Nicht-Überlebens- und Überlebensexperimente zu erzeugen. Das ursprüngliche Ziel dieser Methode war es, die Auswirkungen einer mitochondrialen Transplantation auf die Modulation der Myokardnekrose und die Erhöhung der postischämischen Herzfunktion nach einem ischämischen Ereignis zu untersuchen. Frühere Forschungen haben das Auftreten von mitochondrialen Veränderungen und einen raschen Abfall des energiereichen Phosphatspiegels nach dem Einsetzen einer Ischämie und einer Verringerung der Sauerstoffversorgung gezeigt, was zu einer drastischen Abnahme der kardialen Energiespeicher führt⁴. Die Forscher haben versucht, die postischämische Funktion zu verbessern und die Nekrose des Myokardgewebes durch pharmakologische Interventionen und/oder Verfahrenstechniken zu verringern, aber diese Techniken bieten eine begrenzte Kardioprotektion und haben nur minimale Auswirkungen auf mitochondriale Schäden und Funktionsstörungen ^5,6,7. Unser Team und andere haben bereits gezeigt, dass mitochondriale Schäden hauptsächlich während der Ischämie auftreten und dass die kontraktile Erholung verbessert und die Größe des Myokardinfarkts verringert werden kann, wenn die mitochondriale Atmungsfunktion während der Reperfusion erhalten bleibt ^8,9,10. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass eine mitochondriale Transplantation aus Geweben, die nicht von einer Ischämie betroffen sind, in den Bereich der Ischämie vor der Reperfusion einen alternativen Ansatz zur Verringerung der Myokardnekrose und zur Verbesserung der Myokardfunktion darstellen würde. Im Folgenden beschreiben wir das Protokoll, das zum Testen dieser Theorie verwendet wurde, und die repräsentativen Ergebnisse, die wir aus unserer ersten Studienanalyse erhalten haben.

Darüber hinaus haben sich mehrere Forscher auf andere Themen konzentriert, die für die Definition der Auswirkungen von Myokardischämie-Reperfusionsschäden und die Etablierung geeigneter therapeutischer Interventionen von wesentlicher Bedeutung sind. Ein solches Forschungsgebiet ist das der Präkonditionierung. Die myokardiale ischämische Präkonditionierung ist ein kardioprotektiver Mechanismus, der durch kurzen ischämischen Stress aktiviert wird und zu einer Verringerung der Rate der Herzzellnekrose während nachfolgender Episoden anhaltender Ischämie führt. Diese Mechanismen können entweder durch Hypoxie oder Koronarverschluss aktiviert werden. Mandel et al. zeigten, dass die hypoxisch-hyperoxische Vorkonditionierung dazu beitrug, das Gleichgewicht der Stickstoffmonoxid-Metaboliten aufrechtzuerhalten, die Endothelin-1-Überproduktion zu reduzieren und den Organschutz zu unterstützen¹¹. Darüber hinaus wurde das Konzept der fernischämischen Präkonditionierung untersucht, ein Phänomen, bei dem die Präkonditionierung eines einzelnen Organs einen systemischen Schutz bietet. Ali et al. fanden heraus, dass bei Patienten, die sich einer elektiven Reparatur eines offenen Bauchaortenaneurysmas unterzogen, eine Fernpräkonditionierung, die durch intermittierendes Kreuzklemmen der Arteria iliaca als Stimulus durchgeführt wurde, die Inzidenz von postoperativen Myokardverletzungen, Myokardinfarkten und Nierenfunktionsstörungen reduzierte¹².

Kaninchenmodelle bieten potenzielle Vorteile gegenüber Modellen mit anderen Spezies und werden seit Jahrzehnten in verschiedenen Szenarien eingesetzt, darunter die Induktion von Arrhythmien, globale und regionale ischämische Modelle und die Herzkontraktionsforschung, unter anderem^13,14,15. Obwohl das Kaninchenherz kleiner ist als das eines Hundes oder Schweins, ist es groß genug, um chirurgische Eingriffe zu viel geringeren Kosten durchzuführen¹³. Das Kaninchenherz wird oft verwendet, da es dem menschlichen Herzen sehr ähnlich ist. In der Tat hat es eine ähnliche Stoffwechselrate, exprimiert β-Myosin-Schwerkette und es fehlt eine signifikante myokardiale Xanthinoxidase¹⁶. Die hierin beschriebene Technik zur Induktion einer regionalen myokardialen Ischämie ist einfach, wiederholbar und kostengünstig. Diese Methode ermöglicht sowohl Nicht-Überlebens- als auch Überlebensfälle, da nur eine regionale Ischämie und keine globale Ischämie induziert wird und die benötigten Materialien nicht spezialisiert sind. Es können zwei verschiedene chirurgische Ansätze (Sternotomie und Mini-Thorakotomie) verwendet werden, wodurch der Operateur und die experimentellen Protokolle mehr Freiheit in Bezug auf das Studiendesign erhalten. Darüber hinaus erfordert das Verfahren keinen kardiopulmonalen Bypass. In diesem Zusammenhang sind minimalinvasive Ansätze zur Bypass-Transplantation von Koronararterien zu wertvollen Alternativen für Patienten geworden, die ein Multigefäß-Revarskularizaiton benötigen^17,18. Dieses Modell könnte verwendet werden, um die Unterschiede zwischen diesen Ansätzen zu untersuchen und ein tierbasiertes Lernwerkzeug für chirurgische Auszubildende bereitzustellen. Darüber hinaus kann die Durchführung einer Herzkatheteruntersuchung mit diesem Modell für die physiologische Forschung und/oder das chirurgische Training nützlich sein.

Unser Modell bietet eine Methodik für Anwendungen, bei denen die Induktion einer regionalen myokardialen Ischämie und die anschließende Messung der Infarktgröße, der Myokardfunktion und der zellulären Veränderungen von Bedeutung sind. Mit diesem Protokoll waren wir in der Lage, mehrere Marker der zellulären Funktion und Anpassung an Ischämie und die vorgeschlagene therapeutische Intervention (d.h. mitochondriale Transplantation) zu evaluieren, indem wir die Internalisierung von Organellen, den Sauerstoffverbrauch, die hochenergetische Phosphatsynthese und die Induktion von Zytokinmediatoren und Proteomwegen untersuchten. Diese Ergebnisse sind wichtig für die Erhaltung der myokardialen Energetik, der Zelllebensfähigkeit und der Herzfunktion und ermöglichen die objektive Bewertung kardioprotektiver Techniken nach Ischämie-Reperfusionsverletzungen. Dieses Modell könnte verwendet werden, um ähnliche biologische Signalwege und Alternativen im Bereich der postischämischen Myokardpathologie und Genesung zu untersuchen.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine hochgradig reproduzierbare Methodik zur Induktion einer akuten regionalen myokardialen Ischämie beim Kaninchen für Nicht-Überlebens- und Überlebensexperimente bereitzustellen. Dieses Modell bietet eine Methodik mit hohem Überleben, niedriger intraoperativer Mortalität und minimaler Morbidität¹⁹. Andere Modelle für akute regionale myokardiale Ischämie wurden mit radioaktiv markierten Materialien, Kontrastmitteln, Magnetresonanztomographie oder Computersimulationen beschrieben^20,21,22. Unser Protokoll bietet eine zuverlässige und einfache Methodik, die kostengünstig und konsistent reproduzierbar ist und einen geringen technischen Aufwand hat und daher von Untersuchern ohne chirurgische Expertise durchgeführt werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht entweder ein Überlebensprojekt mit einer linken Mini-Thorakotomie oder ein Nicht-Überlebensmodell mit einer Mittellinien-Sternotomie.

Protokoll

Diese Untersuchung wurde gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health zur Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee des Boston Children's Hospital genehmigt (Protokoll 20-08-4247R). Alle Tiere erhielten eine humane Pflege in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren.

1. Tierarten, Anästhetika und Analgetika

1. Tierarten: Verwenden Sie neuseeländische weiße Kaninchen (Wildtyp-Stamm; weibliches Geschlecht; geschlechtsreif 15-20 Wochen alt; 3-4 kg Körpergewicht) für experimentelle Studien.
2. Anästhetika und Analgetika:
   1. Verwenden Sie Atropin in einer Dosis von 0,01 mg/kg intramuskulär (IM)
   2. Verwenden Sie Acepromazin in einer Dosis von 0,5 mg/kg i.m. für die initiale Sedierung und 0,5 mg/kg intravenös (i.v.) für die Vollnarkose.
   3. Verwenden Sie Butorphanol in einer Dosis von 0,5 mg/kg i.m.
   4. Verwenden Sie Isofluran über eine präzisionsverdampfte Gesichtsmaske mit 3 % für die Induktion, gefolgt von einer Intubation mit 1 % bis 2 %, Sauerstoff (O2) mit 100 % bei 2 l/min und einer Vollnarkose mit 1 % zur Erhaltung.
   5. Verwenden Sie Medetomidin in einer Dosis von 0,25 mg/kg i.M.
   6. Verwenden Sie Ketamin in einer Dosis von 10 mg/kg i.v.
   7. Verwenden Sie einen Bupivacain-Interkostalblock an der Thorakotomiestelle in einer Dosis von nicht mehr als 3 mg/kg i.M.
   8. Verwenden Sie 1% Lidocain in einer Dosis von 1-1,5 ml/kg i.v.
   9. Verwenden Sie ein transdermales Fentanyl-Pflaster mit 1-4 μg/kg für 72 Stunden.

2. Verfahrensschritte (Abbildung 1)

1. Beruhigung von ausgewachsenen neuseeländischen weißen Kaninchen mit einer einzigen kombinierten IM-Injektion von Atropin, Acepromazin und Butorphanol. Induzieren Sie das Tier mit 3% Isofluran über eine präzisionsverdampfte System-Gesichtsmaske.
2. Vorbereitung vor der verblindeten endotrachealen Intubation (d.h. ohne Visualisierung der Stimmritze)
   1. Besprühen Sie den Kehlkopf mit 1% Lidocain, um Laryngospasmus zu verhindern.
   2. Messen Sie die Länge des Endotrachealtubus (ETT) an der Außenseite des Kaninchens von den Zähnen bis zur vorhergesagten Carina vor und bringen Sie das Kaninchen in eine sternale Liegeposition mit gestrecktem Hals.
3. Intubieren Sie das Tier mit einer pädiatrischen ETT mit Manschette (3-0 oder 3-5 Innendurchmesser) unter kontinuierlicher Inhalationsnarkose bei 1%-2% und_O2 bei 100% bei 2 l/min.
   1. Führen Sie das ETT in den Mund ein und führen Sie es am Torus vorbei in den Rachen.
   2. Schieben Sie das ETT vor, bis entweder die Spitze des Schlauchs die Stimmritze berührt oder die Atemgeräusche verloren gehen, was darauf hinweist, dass die Schlauchspitze durch die Glottusöffnung gegangen ist.
   3. Ziehen Sie den Schlauch leicht zurück, bis die Atemgeräusche wiederhergestellt sind, und rücken Sie dann wieder vor und befestigen Sie den Schlauch.
4. Beatmung des Tieres mit mechanischer Unterstützung (Tidalvolumen: 10 ml/kg, Anteil des eingeatmeten O 2: 40 %, Atemfrequenz: 30-40 Atemzüge/min, positiver endexspiratorischer Druck: 5-10 cmH₂O).
   1. Passen Sie das FiO2 nach Verträglichkeit an, um eine O2-Sättigung von mehr als₉₂ % zu erreichen, gemessen durch Pulsoximetrie, um Hyperoxie zu verhindern, die eine systemische Entzündungsreaktion hervorrufen kann.
5. Überprüfen Sie die korrekte Platzierung des ETT durch eine körperliche Untersuchung (z. B. Auskultation), klinische Symptome (z. B. Beobachtung von Kondensation am Ende des Endotrachealtubus) und objektive Messungen (z. B. Kohlendioxid am Ende).
6. Nach ca. 10 Minuten wird dem Kaninchen eine i.m. Injektion von Medetomidin verabreicht, um gleichzeitig eine anästhetische und analgetische Wirkung zu erzielen.
7. Halten Sie die Vollnarkose mit 1% Isofluran für die Dauer des chirurgischen Eingriffs aufrecht.
8. Führen Sie einen 22-G-IV-Katheter in die marginale Ohrvene ein und befestigen Sie ihn mit Klebeband, um einen peripheren IV-Zugang zu erhalten.
   HINWEIS: Die Vena femoralis kann als alternative Stelle für einen venösen Zugang verwendet werden.
   1. Betäuben Sie das Tier vollständig mit Acepromazin i.v. und Ketamin i.v.
   2. Injizieren Sie vor der Inzision 1.000 U/ml Heparin in einer Dosis von 3 mg/kg i.v.
      1. Verabreichen Sie zunächst 1.000 U/ml Heparin in einer Dosis von 3 mg/kg und wiederholen Sie die Dosis stündlich bis zum Ende des Experiments, um eine aktivierte Gerinnungszeit von >400 s gemäß dem aktuellen chirurgischen Protokoll aufrechtzuerhalten.
   3. Verabreichen Sie bei Bedarf 1% Lidocain i.v. und/oder epikardiale asynchrone Defibrillation, wenn während der Operation Kammerflimmern auftritt. Kammerflimmern hört in der Regel mit ein oder zwei Dosen Lidocain auf.
   4. Lactat-Ringer-Lösung kontinuierlich mit 10 ml/kg/h perfundieren.
      HINWEIS: Aufgrund der geringen verabreichten Flüssigkeitsmenge und der kurzen Operationszeiten benötigten die Tiere in den Überlebensstudien in dieser Arbeit keine Diurese vor der Extubation oder während der Erholungsphase. Wenn sich der Lungenstatus des Tieres verschlechtert (d. h. Erhöhung der Beatmungseinstellungen, Anzeichen eines Lungenödems bei der Auskultation usw.), wird eine Diurese empfohlen.
9. Führen Sie eine Verkleinerung der Halsschlagader durch und legen Sie eine 4 oder 5 französische arterielle Leitung, um die intraoperative Überwachung des arteriellen Blutdrucks (BP) zu erleichtern.
   HINWEIS: Die Arteria femoralis kann als alternative Stelle für den arteriellen Zugang verwendet werden.
10. Überwachen und zeichnen Sie alle physiologischen und mechanischen Variablen durch kontinuierliche Echtzeitanalyse auf.
    1. Überwachen Sie den arteriellen Blutdruck mit der Halsschlagaderlinie und erfassen Sie die_{O2-Sättigung} mittels Pulsoximetrie über einen Sensor, der an einer rasierten Pfote angebracht ist.
    2. Monitor mit einem Elektrokardiogramm (EKG) mit drei Gliedmaßenableitungen: I, II und III, und drei berechneten erweiterten Ableitungen: aVL, aVR und aVF.
       1. Zeichnen Sie die EKG-Aufzeichnungen zu präischämischem Ausgangswert, während der Ischämie, während der Reperfusion und seriell während der Tage 7-28 der Genesung auf (wenn eine Überlebensstudie durchgeführt wird).
    3. Überwachen Sie den Grad der Sedierung durch kontinuierliche Überwachung des Blutdrucks und der Herzfrequenz (HF).
    4. Überwachen Sie die Temperatur mit einer Rektalsonde.
    5. Verwenden Sie 2D-ECHO aus der linken parasternalen und apikalen Ansicht, um die Myokardfunktion zu den gewünschten Zeitpunkten sowohl im Überlebens- als auch im Nicht-Überlebensfall zu beurteilen.
       1. Beurteilen Sie die Myokardfunktion anhand der fraktionierten Verkürzung (FS), indem Sie die enddiastolische Distanz des linken Ventrikels (LVEDD) und die endsystolische Distanz des linken Ventrikels (LVESD) messen und die folgende Formel verwenden:
          FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 100
11. Legen Sie das Tier während der Operation auf eine zirkulierende Heißwasserdecke, um eine stabile Körperkerntemperatur aufrechtzuerhalten.
12. Bereiten Sie das Tier steril vor und drapieren Sie es:
    1. Rasieren Sie die Operationsstelle und bereiten Sie sie mit Betadin und 70%igem Isopropylalkohol vor, die jeweils dreifach aufgetragen werden. Tupfen Sie den Bereich mit sterilen Mullbinden trocken und decken Sie das gesamte Tier mit sterilen Handtüchern ab.
13. Linke Mini-Thorakotomie (Überlebensstudien)
    1. Führen Sie eine Interkostalblockade an der vorbestimmten Thorakotomiestelle mit Bupivacain-IM durch.
    2. Verabreichen Sie 1% Lidocain i.v. über die Ohrvene vor der Inzision.
    3. Führen Sie eine linke Mini-Thorakotomie durch den vierten Interkostalraum entlang des oberen Teils der fünften Rippe durch, um das neuromuskuläre Bündel zu vermeiden, das sich parallel zur Unterseite jeder Rippe befindet.
       1. Führen Sie eine anterolaterale Thorakotomie durch, um die anterolaterale Oberfläche des Herzens (d. h. die anatomische Lage der diagonalen LAD-Äste) optimal zu visualisieren.
       2. Positionieren Sie das Kaninchen mit der linken Seite um ca. 30° mit einem Kissen oder Sitzsack.
       3. Befestigen Sie das ipsilaterale Bein des Kaninchens über dem Kopf, um Platz für das Operationsfeld und zwischen den Rippenspalten zu schaffen.
       4. Ertasten und umreißen Sie die knöchernen Landmarken, einschließlich der Rippen, des Brustbeins und des Schulterblatts, mit einem Markierungsstift mit Filzspitze. Schneiden Sie die Haut über der fünften Rippe mit einer #10-Klinge ein. Achten Sie darauf, dass der Schnitt parallel zur Rippe verläuft.
       5. Verwenden Sie Elektrokauter, um den Musculus pectoralis major und den Musculus serratus anterior zu trennen. Trennen Sie die Interküstenmuskeln direkt über der fünften Rippe mit Elektrokauter, um das neurovaskuläre Bündel zu erhalten.
       6. Betreten Sie den Pleuraspalt vorsichtig durch den vierten Interkostalraum mit scharfer oder stumpfer Dissektion. Verlängern Sie den anfänglichen Pleuraschnitt parallel zur Rippe in beide Richtungen mit scharfer oder stumpfer Dissektion, bis ein Rippenspreizer oder Sternumretraktor eingeführt werden kann.
    4. Platzieren Sie einen Rippenspreizer oder einen Brustbein-Retraktor innerhalb des Rippenraums und erweitern Sie ihn, um eine angemessene Visualisierung des Herzens und des Perikardsacks zu ermöglichen. Heben Sie den Herzbeutel mit einer DeBakey-Pinzette an und öffnen Sie den Herzbeutel mit einer Metzenbaum-Schere.
    5. Isolierung der LAD-Arterie
       1. Den zweiten oder dritten diagonalen Ast der Arteria LAD mit einem Polypropylen-Naht (3-0) auf einer konischen Nadel umschließen. Entferne die Nadel und fädele beide Enden des Polypropylen-Filaments durch ein kleines Vinylröhrchen, um eine Schlinge zu bilden.
       2. Platzieren Sie einen Pledget zwischen der Schlinge und der Koronararterie, um eine Beschädigung des Herzkranzgefäßes und/oder einen Vasospasmus durch Ligatur zu vermeiden.
          1. Nehmen Sie mit einer DeBakey-Pinzette eine rechteckige PTFE-Filzzzange (ca. 7 mm x 3 mm) auf. Platzieren Sie das Pledget zwischen den beiden Polypropylen-Filamenten, so dass es zwischen der isolierten LAD-Arterie und dem Vinylschlauch liegt, wenn die Schlinge angezogen wird.
14. Sternotomie der Mittellinie (Nicht-Überlebensstudien)
    HINWEIS: Der Mittellinien-Sternotomie-Ansatz ist ideal für Nicht-Überlebensfälle, für die eine invasivere Überwachung mit LVDP und Sonomikrometrie verwendet werden kann.
    1. Führen Sie eine Sternotomie in der Mittellinie mit einer gebogenen Mayo-Schere durch. Platzieren Sie einen Sternumretraktor und erweitern Sie ihn, um eine angemessene Visualisierung des Herzens und des Perikardsacks zu ermöglichen.
    2. Heben Sie den Herzbeutel mit einer DeBakey-Pinzette an und öffnen Sie den Herzbeutel mit einer Metzenbaum-Schere.
    3. Platzieren der drei piezoelektrischen Sonomikrometrie-Kristalle:
       1. Machen Sie drei kleine 1 mm große Schnitte auf dem Epikard des LV, die die Ecken eines Dreiecks bilden. Platzieren Sie die piezoelektrischen Sonomikrometrie-Kristalle in den Epikardschnitten.
       2. Befestigen Sie die Drähte mit einem 5-0 Polypropylen-U-Stich an der Herzoberfläche. Wenn Sie mit Sonomikrometrie aufzeichnen, pausieren Sie die mechanische Beatmung, um eine genaue Aufzeichnung über zwei bis drei Herzschläge zu ermöglichen.
          HINWEIS: Wenn das Herzflimmern auftritt, 1% Lidocain nicht wirksam ist und eine epikardiale Defibrillation erforderlich ist, schalten Sie das Sonomikrometer aus und trennen Sie es vom Datenerfassungssystem, um beide vor elektrischem Input zu schützen.
    4. Isolierung der LAD-Arterie:
       1. Den zweiten oder dritten diagonalen Ast der Arteria LAD mit einem Polypropylen-Naht (3-0) auf einer konischen Nadel umschließen.
       2. Entferne die Nadel und fädele beide Enden des Polypropylen-Filaments durch ein kleines Vinylröhrchen, um eine Schlinge zu bilden.
       3. Platzieren Sie einen Pledget zwischen der Schlinge und der Koronararterie, um eine Beschädigung der Koronararterie und/oder einen Vasospasmus durch Ligatur zu vermeiden.
       4. Nehmen Sie mit einer DeBakey-Pinzette eine rechteckige PTFE-Filzzzange (ca. 7 mm x 3 mm) auf. Platzieren Sie das Pledget zwischen den beiden Polypropylen-Filamenten, so dass es zwischen der isolierten LAD-Arterie und dem Vinylschlauch liegt, wenn die Schlinge angezogen wird.
    5. Messung des LVDP:
       1. Lege einen 5-0 Polypropylen-U-Stich in den Scheitelpunkt des LV und mache einen kleinen 1 mm langen Schnitt mit einer 11er Klinge in den LV-Scheitelpunkt.
       2. Führen Sie einen 3 französischen Ballonkatheter in das LV-Lumen ein. Befestigen Sie den Katheter am LV, indem Sie ihn an die 5-0 Polypropylen-U-Naht binden.
       3. Schließen Sie den Katheter an den an den Monitor angeschlossenen Schallkopf an, um die LVDP aufzuzeichnen. Zeichnen Sie die LVDP mit dem Datenerfassungssystem auf (siehe unten). Stellen Sie den Katheter auf Null, um die hämodynamischen Variablen aufzuzeichnen, indem Sie den Drei-Wege-Absperrhahn in die Luft öffnen und auf dem Monitor auf Null stellen.
    6. Datenerfassungssystem
       1. Starten Sie das Datenerfassungssystem (siehe Materialtabelle) auf dem verwendeten Computer/Laptop. Schließen Sie das Kabel vom Monitor an den Computer/Laptop an.
       2. Wählen Sie Kanal 1 auf dem Datenerfassungssystem aus, und nennen Sie ihn LVDP. Stellen Sie den Wandler mit dem Monitor auf Null.
          HINWEIS: Wenn Sie den BP und den HR an das Datenerfassungssystem anschließen, gehen Sie wie folgt vor: Schließen Sie das Kabel an den Laptop an, wählen Sie Kanal und Null, wenn Sie den Blutdruck messen.
15. Verschließen Sie die Koronararterie, indem Sie die Schlinge festziehen, indem Sie auf den Vinylschlauch drücken, während Sie an den Polypropylen-Nahtfäden ziehen. Halten Sie die gewünschte Dichtheit mit einer Moskitoklemme aufrecht, indem Sie den Schlauch direkt einklemmen und fixieren.
16. Bestätigen Sie die myokardiale Ischämie visuell durch die regionale Zyanose des Epikards. Eine regionale Ischämie kann auch im EKG mit dem Vorhandensein eines ST-Segments und T-Wellen-Veränderungen bestätigt werden.
17. Nach visueller Bestätigung eine regionale Ischämie für 30 Minuten unter Narkose induzieren.
    1. Bei 0 min, 10 min, 20 min und 30 min während der regionalen Ischämie ist der FS mit 2D ECHO sowohl für die Überlebens- als auch für die Nicht-Überlebensfälle zu bewerten.
    2. Beurteilen Sie die LVDP und die Sonomikrometrie kontinuierlich während der Zeit vor der Ischämie, der myokardialen Ischämie und der postischämischen Zeit für die Nicht-Überlebensfälle.
    3. Falls erforderlich, grenzen Sie den gefährdeten Bereich ab, indem Sie die Arterie erneut ligieren, wobei der Polypropylen-Nahtstich an Ort und Stelle bleibt. Klemmen Sie die Aorta quer und injizieren Sie das Monastral Blue-Pigment 98% (verdünnt 1:5 in PBS) mit einer Kardioplegienadel durch die Aorta. Die durchbluteten Bereiche des Myokards färben sich blau, und der gefährdete Bereich bleibt ungefärbt.
    4. Kontinuierliche Überwachung und Aufzeichnung der HF-, Blutdruck- und_{O2-Sättigung} .
    5. Lassen Sie das Tier 2 Stunden (Nicht-Überleben) oder 28 Tage (Überleben) sich erholen.
       HINWEIS: Das EKG kann verwendet werden, um die Reperfusion zu bestätigen. Obwohl in dem in dieser Studie durchgeführten Experiment nicht beobachtet, kann eine Hypokaliämie häufig während der Reperfusion auftreten und kann mit einer Kaliumkontrolle oder einer geeigneten Infusion korrigiert werden.
18. Abschluss des Verfahrens
    1. Überlebensfälle
       1. In Überlebensfällen schneidest du den 3-0-Polypropylenfaden, der für die Snare verwendet wurde, ab, bindest die Enden locker zusammen und lässt ihn an Ort und Stelle. Identifizieren Sie den Risikobereich und die Infarktzone anhand des 3-0-Polypropylen-Fadens.
       2. Nachdem der Eingriff abgeschlossen ist, schließen Sie den Einschnitt in drei Schichten.
          1. Schließen Sie die erste Schicht, indem Sie zwei 2-0 Polyglactin 910 Achterstiche um die Rippen binden.
          2. Verschließen Sie die muskulären und subkutanen Schichten mit einer 3-0-Polydioxanon-Naht im Lauf.
          3. Verschließen Sie die Haut subkutikulär mit einer 5:0-Monofilamentnaht. Verwenden Sie eine vergrabene Naht, um die Reizung des Tieres zu minimieren.
       3. Evakuieren Sie die Pleuraluft, indem Sie eine Nadel-Thorakozentese durchführen.
       4. Tragen Sie 72 Stunden lang ein transdermales Fentanyl-Pflaster auf, um die postoperative Schmerzbehandlung zu erleichtern.
       5. Führen Sie eine transthorakale Echokardiographie zu den 1-wöchigen und 2-wöchigen postoperativen Zeitpunkten durch, um die Trends im FS zu beurteilen.
       6. Nach der vorgegebenen Erholungsphase wird das Tier wie oben beschrieben sediert, intubiert und betäubt. Führen Sie eine mediane Sternotomie durch. Legen Sie den Perikardsack frei und öffnen Sie ihn. Euthanasieren Sie das Kaninchen unter tiefer Narkose, indem Sie das Herz en bloc entfernen und das Tier durch Ausblutung sterben lassen.
    2. Fälle, in denen nicht überlebt wird
       1. Nach dem Experiment und nach einer Tiefenanästhesie wird das Herz vollständig freigelegt und für die biochemische und Gewebeanalyse en bloc entfernt. Das Tier stirbt durch Ausblutung.

Ergebnisse

Nach dem Protokoll (Abbildung 1) wurde die myokardiale Ischämie sofort durch die direkte Visualisierung einer Zyanose des Epikards bestätigt.

Standard-EKGs (drei Extremitätenableitungen: I, II und III und drei berechnete erweiterte Ableitungen: aVL, aVR und aVF) wurden kontinuierlich vor der Ischämie, während der Ischämie und bei der Reperfusion aufgezeichnet (Abbildung 2). Die EKGs zeigen Tachykardie, Arrhythmien (d.h. Kammerfl...

Diskussion

Unser Protokoll demonstriert eine zuverlässige Methodik zur Durchführung einer akuten regionalen myokardialen Ischämie beim Kaninchen. Die linke Mini-Thorakotomie ist ideal für Überlebensfälle, bei denen der Schnitt und die damit verbundenen Schmerzen minimiert werden müssen. Wichtig ist, dass eine diuretische Therapie vor der Extubation nicht notwendig war und es keine Mortalität intraoperativ in der Nicht-Überlebensgruppe oder 4 Wochen postoperativ in der Überlebensgruppe gab. Wenn das Design des Protokolls e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 blade	Bard Parker	371210
#11 blade	Fisher Scientific	B3L
22 G PIV needle	BD Insyte	381423
Acepromazine	VETONE	NDC 13985-587-50	0.5 mg/kg IM and IV
Aline pressure bag	Infu-Stat	2139
Angiocath	Becton Dickinson	382512
Arterial Catheter	Teleflex	MC-004912
Atropine	Hikma Pharmaceuticals	NDC 0641-6006-01	0.01 mg/kg IM
Betadine and 70% isopropyl alcohol	McKesson	NDC 68599-2302-6
Blood gas machine	Siemens	MRK0025
Bovie	Valleylab	E6008
Bulldog clamps	World Precision Instruments	14119
Bupivacaine	Auromedics	NDC 55150-249-50	3 mg/kg IM
Butorphanol	Roxane	NDC 2054-3090-36	0.5 mg/kg IM
Clear acetate sheet	Oxford Instruments	ID 51-1625-0213
Clipers	Andis	AGC2
DeBakey forceps	Integra	P6280
Echocardiography machine	Philips	IE33 F1
Electrocardiography machine	Meditech	MD908B
Endotracheal tube	Medline	#922774
Fentanyl	West-Ward	NDC 0641-6030-01	1–4 µg/kg transdermal patch
Formaldehyde solution 10%	Epredia	94001
Glass plates	United Scientific	B01MUHX6MR
Heparin Sodium	Sagent	NDC 69-0058-02	1000U in 1 mL 3 mg/kg
Hot water blanket	3M	55577
Isoflurane	Penn Veterinary Supply, INC	NDC 50989-606-15	1%–3%
Ketamine	Dechra	NDC 42023-138-10	10 mg/kg IV
Lab Chart 7 Acquisition Software	Adinstruments
Lactated Ringer's solution	ICUmedical	NDC 0990-7953-09	10 mL/kg/h
Laryngoscope	Welch Allyn	68044
Left ventricule lumen catheter 3Fr	McKesson	385764-EA
Lidocaine (1%)	Pfizer	4276-01	1–1.5 mL/kg IV
LVDP transducer	Edward	PDP-ED
Marking pen	Viscot	1451SR-100 Unsterile
Mayo scissors	Mayo	S7-1098
Medetomidine	Entireoly Pets Pharmacy	NDC 015914-005-01	0.25 mg/kg IM
Metzenbaum scissors	Cole-Parmer	UX-10821-05
Monastra. Blue pigment 98%	Chemsavers	MBTR1100G
Monocryl 5-0	Ethicon	Y463G
Mosquito clamp	Shioda	802N
PDS 3-0	Ethicon	42312201
Piezoelectric sonomicrometry crystals	Sonometrics	Small 2mm round
Plegets	DeRoyal	32-363
Povuine Iodine Prep Solutions	Medline	MDS093940
Precision vaporized system face mask	Yuwell	B07PNH69BF
Prolene 3-0	Ethicon	8665G
Proline 5-0	Ethicon	8661G
Pulse oximetry probe	Masimo	9216-U
Rib spreader	Medline	MDS5621025
S12 Pediatric Sector Probe	Phillips	21380A
Sonomicrometer	Sonometrics	BZ10123724
Sterile gauze	Medline	3.00802E+13
Sterile towels	McKesson	MON 277860EA
Sternal retractor	Medline	MDS5610321
Sutures for closure	J&J Dental	8698G
Telemetriy monitor	Meditech	MD908B
Temperature probe	Omega	KHSS-116G-RSC-12
Triphenyl tetrazolium chloride (1%)	Millipore	MFCD00011963
Ventilator	MedGroup	MSLGA 11
Vicryl 2-0	Ethicon	V635H
Vinyl tubing	ABE	DISW 3001