通过全细胞膜片钳技术 记录 H9c2心肌细胞上的电压依赖性钾电流

摘要

本协议描述了一种使用全细胞膜片钳技术实时和动态采集H9c2心肌细胞中的电压门控钾（Kv）通道电流的有效方法。

摘要

心肌细胞膜上的钾通道在调节细胞电生理活动中起重要作用。作为主要的离子通道之一，电压门控钾（Kv）通道与一些严重的心脏病密切相关，例如药物引起的心肌损伤和心肌梗塞。本研究采用全细胞膜片钳技术测定1.5 mM 4-氨基吡啶（4-AP，一种广谱钾通道抑制剂）和乌头碱（AC，25 μM、50 μM、100 μM 和 200 μM）对 H9c2 心肌细胞中 Kv 通道电流 （I_Kv） 的影响。结果表明，4-AP抑制I Kv约54%，而AC对I_Kv的抑制作用呈剂量依赖趋势（25 μM无影响，50 μM抑制率为30%，100 μM抑制率为46%，200 μM抑制率为54%）。由于具有较高的灵敏度和精密度的特点，该技术将促进民族医学靶向离子通道的心脏毒性和药理作用的探索。

引言

离子通道是嵌入细胞膜脂质双层的特殊整合蛋白。在活化剂存在下，这种特殊整合蛋白的中心形成高度选择性的亲水孔，允许适当大小和电荷的离子以被动运输方式通过¹。离子通道是细胞兴奋性和生物电的基础，在各种细胞活动中起着关键作用²。心脏通过由动作电位启动的激发-收缩耦合过程引起的规律收缩向其他器官供血³.已有研究证实，心肌细胞动作电位的产生是由细胞内离子浓度的变化引起的，人心肌细胞中Na⁺、Ca²+和K⁺离子通道的活化和失活导致动作电位按^{一定序列4}，^5，6形成。电压门控钾（Kv）通道电流（I_Kv）紊乱可能会改变正常的心律，导致心律失常，这是导致死亡的主要原因之一。因此，记录I_Kv对于了解治疗危及生命的心律失常的药物机制至关重要⁷。

Kv通道是钾通道的重要组成部分。Kv通道的协调功能在^{哺乳动物心脏的}电活动和心肌收缩力中起重要作用8，^9，10。在心肌细胞中，动作电位的幅度和持续时间取决于多个 Kv 通道亚型向外 K⁺ 电流的共同传导¹¹。Kv通道功能的调节对于心脏动作电位的正常复极化非常重要。即使是Kv电导的最轻微变化也会极大地影响心脏复极化并增加心律失常的可能性^12，13。

代表细胞电生理研究的基本方法，可以通过施加负压在细胞膜的小区域和用于全细胞膜片钳记录的移液器吸头之间建立高电阻密封。持续的负压使细胞膜与移液器吸头接触并粘在移液器的内壁上。由此产生的完整电路允许人们记录穿过细胞膜¹⁴表面的任何单个离子通道电流。该技术对细胞膜离子通道电流具有非常高的灵敏度，可用于检测所有离子通道中的电流，应用极其广泛¹⁵。此外，与荧光标记和放射性标记相比，膜片钳具有更高的权威性和准确性¹⁶。目前，全细胞膜片钳技术已被用于检测作用于Kv通道电流¹⁷，^18，19的中药成分。例如，Wang等人使用全细胞膜片钳技术，证实莲子的有效成分可能通过阻断活化状态通道¹⁹来实现对Kv4.3通道的抑制。乌头碱（AC）是乌头属的有效活性成分之一，如乌头和乌头摆布希。大量研究表明，过量服用AC会导致心律失常甚至心脏骤停²⁰。AC和电压门控离子通道之间的相互作用导致细胞内离子稳态的破坏，这是心脏毒性的关键机制²¹。因此，本研究采用全细胞膜片钳技术测定AC对心肌细胞I_Kv的影响。

研究方案

将商业获得的H9c2大鼠心肌细胞（见 材料表）在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素 - 链霉素的DMEM中在37°C的5%CO₂加湿气氛中孵育。然后采用全细胞膜片钳技术检测正常H9c2细胞和4-AP或AC处理细胞中I_Kv 的变化（图1 和 图2）。

1. 溶液制备

1. 制备含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM细胞培养基（见 材料表）。
2. 通过将 14.1165 mg 4-AP 添加到 100 μL DMSO 溶液中来制备 1.5 M 4-AP 溶液（参见 材料表）。通过加入细胞外溶液将1.5M 4-AP稀释至1.5mM（步骤1.5）。
3. 通过将 5 mg AC 加入 19.36 μL DMSO 溶液中来制备 400 mM AC（参见 材料表）。
   注意:上述所有溶液均储存在4°C冰箱中，DMSO的最终浓度不得超过0.1%（v / v）。
4. 通过将 0.4100 g KCl （110.0 mM）、0.0120 g MgCl 2 （1.2 mM）、0.1270 g Na₂ ATP （5.0 mM）、0.1190 g HEPES （10.0 mM） 和 0.1900 g EGTA （10.0 mM） 加入 50 mL 双蒸水中制备 50 mL 细胞内溶液（参见表 1 和材料表）。
   注意:使用1M KOH将细胞内溶液的pH值调节至7.2，并等分成小体积（1.5-2mL）并储存在-20°C。
5. 通过将 0.0185 g KCl （5.0 mM）、0.3945 g NaCl （135.0 mM）、0.0203 g MgCl 2·6H 2 O （_2.0 mM）、0.0595 g HEPES （5.0 mM） 和 0.0990 g D-葡萄糖 （10.0 mM） 加入 50 mL 双蒸水中制备 50 mL 细胞外溶液（参见表 1 和 材料表）。
   注意:细胞外溶液必须准备立即使用，并且需要使用1M NaOH将其pH值调节至7.4。

2. 细胞培养

1. 一旦H9c2培养皿汇合80%，用0.25%胰蛋白酶消化细胞30秒。
2. 用普通培养基或含药物培养基（25 μM、50 μM、100 μM 和 200 μM AC）在铺有玻璃板的 35 mm 培养皿中培养 2 x 10⁵ 细胞/mL，在 37 °C 下，5% CO₂ 气氛和 70% 至 80% 相对湿度（参见 材料表）。

3. 微量移液器的制造

1. 打开微量移液器拉拔器（参见 材料表），并预热30分钟。
2. 将带有细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径:1.5毫米，内径:1.10毫米，长10厘米）放在微量移液器拉拔器上。选择在步骤 3.3 中设置的程序，然后单击控制面板上的 Enter 键。单击右上角的 斜坡 程序以确定玻璃毛细管的"热量"值。
3. 根据"斜坡"测试确定的值编写拉电极的程序，并按照以下步骤:"热量"值="斜坡"值，拉力=0，Vel=拉杆移动速度，时间=200-250。单击 拉 动开始制造移液器。
   注意:使用前观察微量移液器拉拔器密封容器中干燥剂的颜色。如果颜色从蓝色变为粉红色，则必须更换干燥剂。为防止电极尖端污染，在移液器制备过程中尽量不要触摸玻璃毛细管的中间部分。随后，小心地取出产生的移液器，并将它们放入封闭密封的容器中。

4. 仪器设置

1. 按以下顺序打开相应的仪器:数模转换器、信号放大器、显微操纵器、显微镜和相机（见 材料表）。
2. 依次打开成像应用程序、信号放大器软件和数据采集软件（见 材料表）。
   注意:仪器必须按顺序打开;否则，打开软件后将出现"演示数字化器"状态。

5. I_Kv 参数设置

1. 按照以下步骤编辑记录I_Kv 的协议。
   1. 单击"编辑"，然后在数据采集软件中选择"编辑协议"（参见材料表）。
   2. 在"波形"界面中编辑程序:纪元 A（第一级 = −60 mV，三角洲电平 = 0 mV，第一持续时间 = 20 毫秒，增量持续时间 = 0 毫秒）;大纪元 B（第一级 = −40 mV，增量电平 = 10 mV，第一持续时间 = 150 毫秒，增量持续时间 = 0 毫秒）和大纪元 C（第一级 = −60 mV，增量电平 = 0 mV，第一持续时间 = 30 毫秒，增量持续时间 = 0 毫秒）。
   3. 然后，单击 模式/速率 界面，并设置"试用层次结构"数据:试用延迟 = 0 秒，运行 = 1，扫描 = 11，扫描持续时间 = 0.22 秒^22，23。
      注意:在控制条件下，在−60 mV保持电位下施加150 mV去极化步进，在−60 mV保持电位下，以10 mV的增量，获取I_Kv 通道电流。协议的总时间需要大于"波形"程序中设置的时间。
2. 编辑 P/N 泄漏减法程序:单击"编辑协议"以选择"激励"按钮，然后在"P/N 泄漏减法"对话框中设置泄漏减法程序:子扫描次数 = 2-8（本研究中为 4），建立时间 = 100-1，000 ms（本研究中为 200），"极性"="与波形相反"，保持电平 = −80 mV。
   注意:P/N泄漏减法的保持电平必须低于"首次保持"（−60 mV）。

6. 电压钳模式下I _Kv 的全电池膜片钳记录

1. 建立数据存储路径:点击文件，在数据采集软件中选择设置数据文件名。通过选择编辑并单击数据采集软件中的开放协议，打开已建立的I_Kv协议（步骤5.1）。最后，单击"工具"选项，然后选择"膜测试"以开始运行协议。
2. 将细胞外溶液（步骤1.5）加入全细胞膜片钳装置上的细胞浴中（参见 材料表），并将盖玻片向上放置，将H9c2细胞（在步骤2.1中培养）置于浴中。
3. 用细胞外溶液填充30%的移液器（在步骤3中制造），并将其安装在集成到膜片钳装置中的记录电极支架上。用O形圈橡胶垫圈和塑料垫圈拧紧移液器。然后，用显微操纵器将移液器放入浴中。单击信号放大器软件的 移液器偏移 接口（参见 材料表），将I_Kv 电流基线保持在0 pA。
   注意:细胞内溶液（步骤1.4）必须与银丝的AgCl / Ag部分接触，并且银线不得靠近移液器的内壁。移液器的电阻需要为2-6 MΩ。为避免移液器吸头被堵塞，必须使用通过塑料管²⁴连接到记录电极支架的1.0 mL注射器将连续的正压输送到移液器。
4. 使用通过塑料管连接到记录电极支架的 1.0 mL 注射器手动输送适当的正压。通过三维操作显微操纵器以接触细胞来稍微移动移液器。
5. 一旦移液器接触细胞膜后膜测试方波下降1/3至1/2，去除正压，并手动提供适当的负压。然后，点击数据采集软件的补丁界面，形成GΩ密封。在电池密封过程中使用"C p Fast"和"C_p Slow"信号放大器软件来补偿快速和慢速电容。
   注意:当膜测试为≥1 GΩ时，移液器吸头和细胞之间形成细胞连接配置。
6. 施加短暂的负压脉冲以破坏细胞膜的贴片。
   注意:膜电阻的急剧降低是成功的全细胞记录模式的特征。如果接入电阻（R_a）≥30 MΩ，则必须在步骤6.3-6.6中重新选择电池。为了保证记录的I_Kv 数据的准确性，必须在细胞膜破裂后去除负压。
7. 通过单击信号放大器软件的全电池按钮执行 全电池 膜电容补偿。最后，通过单击保存并记录数据 数据记录 按钮。
8. 使用数据分析软件打开保存的I_Kv 数据。保存电流-电压 （I−V） 关系:单击" 分析 "以选择 "统计 "以执行以下操作:选择 范围 作为 Cousors 1，2 进行数据分析;单击" 峰值幅度 "和 "平均值 "按钮，然后单击" 确定 "以查看 "结果 "页面中的数据。最后，将I_Kv 均值数据的列复制到功能绘图软件中（见 材料表）进行进一步分析。
9. 保存代表性的I_Kv电流迹线:单击"编辑"以选择"传输迹线";然后，在"要传输的区域"中选择"完整跟踪";接下来，点击 选择 在 迹线选择，然后选择 IN 0 （pA） in 信号;最后，点击确定查看"结果"页面中的数据，并将总数据复制到功能绘图软件中绘制当前迹线。
10. 保存 I_Kv 协议:单击"编辑"以选择"创建激励波形信号"，然后选择"确定"。然后，重做步骤6.9，除了在"信号"中选择A0#0（mA）。

结果

该协议允许根据全细胞膜片钳技术中设置的参数记录I_Kv。I_Kv 由 −40 至 +60 mV 的 150 ms 去极化脉冲激励触发，保持电位为 −60 mV（图 3A）。H9c2大鼠心肌细胞的I_Kv首先出现在-20 mV左右，然后随着进一步去极化而振幅增加。根据测得的电流幅度计算I_Kv与膜电位之间的平均关系。结果表明，与对照组相比，用1.5 mM 4-AP处理5 min后，I_Kv振幅明显?...

讨论

膜片钳电生理技术主要用于记录和反映细胞^膜25上离子通道的电活动和功能特性。目前，膜片钳技术的主要记录方法包括单通道记录和全细胞记录²⁶。对于全细胞模式，玻璃微电极和负压用于在细胞膜的小面积和移液器吸头²⁷之间形成高电阻密封。一旦持续的负压导致移液器的尖端破裂细胞膜并且膜附着在移液器的内壁上，移液器和细胞之间形?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Aminopyridine	Sigma	MKCJ2184
Aconitine	Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd	DSTDW000602
Amplifier	Axon Instrument	MultiClamp 700B
Analytical Balance	Sartorius	124S-CW
ATP Na2	Solarbio	416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)	Sutter Instrument	163225-5
Cell culture dish (100 mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	1192022
Cell culture dish (35 mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	3012022
Clampex software	Molecular Devices, LLC.	Version 10. 5
Clampfit software	Molecular Devices, LLC.	Version 10. 6. 0. 13	data acqusition software
D-(+)-glucose	Rhawn	RH289133
Digital camera	Hamamatsu	C11440
Digitizer	Axon Instrument	Axon digidata 1550B
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)	Gibco	8121587
EGTA	Biofroxx	EZ6789D115
Fetal bovine serum	Gibco	2166090RP
Flaming/brown micropipette puller	Sutter Instrument	Model P-1000
H9c2 cells	Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd	CL0111
HCImageLive	Hamamatsu	4.5.0.0
HCl	Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd	2106081
HEPES	Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd	20210221
KCl	Chengdu Colon Chemical Co., Ltd	2020082501
KOH	Chengdu Colon Chemical Co., Ltd	2020112601
MgCl2	Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute	20160408
MgCl2·6H2O	Chengdu Colon Chemical Co., Ltd	2021020101
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285A
Microscope	Olympus	IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm)	Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd	80340-0630
Milli-Q	Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd	Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander	Axon Instrument	MultiClamp commander 2.0	signal-amplifier software
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)	Boster Biological Technology Co., Ltd	17C18B16
PH meter	Mettler Toledo	S201K
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
Trypsin 0.25% (1x)	HyClone	J210045