通过全细胞膜片钳技术 记录 H9c2心肌细胞上的电压依赖性钾电流

摘要

本协议描述了一种使用全细胞膜片钳技术实时和动态采集H9c2心肌细胞中的电压门控钾（Kv）通道电流的有效方法。

摘要

心肌细胞膜上的钾通道在调节细胞电生理活动中起重要作用。作为主要的离子通道之一，电压门控钾（Kv）通道与一些严重的心脏病密切相关，例如药物引起的心肌损伤和心肌梗塞。本研究采用全细胞膜片钳技术测定1.5 mM 4-氨基吡啶（4-AP，一种广谱钾通道抑制剂）和乌头碱（AC，25 μM、50 μM、100 μM 和 200 μM）对 H9c2 心肌细胞中 Kv 通道电流 （I_Kv） 的影响。结果表明，4-AP抑制I Kv约54%，而AC对I_Kv的抑制作用呈剂量依赖趋势（25 μM无影响，50 μM抑制率为30%，100 μM抑制率为46%，200 μM抑制率为54%）。由于具有较高的灵敏度和精密度的特点，该技术将促进民族医学靶向离子通道的心脏毒性和药理作用的探索。

引言

离子通道是嵌入细胞膜脂质双层的特殊整合蛋白。在活化剂存在下，这种特殊整合蛋白的中心形成高度选择性的亲水孔，允许适当大小和电荷的离子以被动运输方式通过¹。离子通道是细胞兴奋性和生物电的基础，在各种细胞活动中起着关键作用²。心脏通过由动作电位启动的激发-收缩耦合过程引起的规律收缩向其他器官供血³.已有研究证实，心肌细胞动作电位的产生是由细胞内离子浓度的变化引起的，人心肌细胞中Na⁺、Ca²+和K⁺离子通道的活化和失活导致动作电位按^{一定序列4}，^5，6形成。电压门控钾（Kv）通道电流（I_Kv）紊乱可能会改变正常的心律，导致心律失常，这是导致死亡的主要原因之一。因此，记录I_Kv对于了解治疗危及生命的心律失常的药物机制至关重要⁷。

Kv通道是钾通道的重要组成部分。Kv通道的协调功能在^{哺乳动物心脏的}电活动和心肌收缩力中起重要作用8，

研究方案

将商业获得的H9c2大鼠心肌细胞（见 材料表）在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素 - 链霉素的DMEM中在37°C的5%CO₂加湿气氛中孵育。然后采用全细胞膜片钳技术检测正常H9c2细胞和4-AP或AC处理细胞中I_Kv 的变化（图1 和 图2）。

1. 溶液制备

1. 制备含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM细胞培养基（见 材料表）。
2. 通过将 14.1165 mg 4-AP 添加到 100 μL DMSO 溶液中来制备 1.5 M 4-AP 溶液（参见 材料表）。通过加入细胞外溶液将1.5M 4-AP稀释至1.5mM（步骤1.5）。
3. 通过将 5 mg AC 加入 19.36 μL DMSO 溶液中来制备 400 mM AC（参见 材料表）。
   注意：上述所有溶液均储存在4°C冰箱中，DMSO的最终浓度不得超过0.1%（v / v）。
4. 通过将 0.4100 g KCl （110.0 mM）、0.0120 g MgCl 2 （1.2 mM）、0.127....

结果

该协议允许根据全细胞膜片钳技术中设置的参数记录I_Kv。I_Kv 由 −40 至 +60 mV 的 150 ms 去极化脉冲激励触发，保持电位为 −60 mV（图 3A）。H9c2大鼠心肌细胞的I_Kv首先出现在-20 mV左右，然后随着进一步去极化而振幅增加。根据测得的电流幅度计算I_Kv与膜电位之间的平均关系。结果表明，与对照组相比，用1.5 mM 4-AP处理5 min后，I_Kv振幅明显?.......

讨论

膜片钳电生理技术主要用于记录和反映细胞^膜25上离子通道的电活动和功能特性。目前，膜片钳技术的主要记录方法包括单通道记录和全细胞记录²⁶。对于全细胞模式，玻璃微电极和负压用于在细胞膜的小面积和移液器吸头²⁷之间形成高电阻密封。一旦持续的负压导致移液器的尖端破裂细胞膜并且膜附着在移液器的内壁上，移液器和细胞之间形?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Aminopyridine	Sigma	MKCJ2184
Aconitine	Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd	DSTDW000602
Amplifier	Axon Instrument	MultiClamp 700B
Analytical Balance	Sartorius	124S-CW
ATP Na2	Solarbio	416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)	Sutter Instrument	163225-5
Cell culture dish (100 mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	1192022
Cell culture dish (35 mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	3012022
Clampex software	Molecular Devices, LLC.	Version 10. 5
Clampfit software	Molecular Devices, LLC.	Version 10. 6. 0. 13	data acqusition software
D-(+)-glucose	Rhawn	RH289133
Digital camera	Hamamatsu	C11440
Digitizer	Axon Instrument	Axon digidata 1550B
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)	Gibco	8121587
EGTA	Biofroxx	EZ6789D115
Fetal bovine serum	Gibco	2166090RP
Flaming/brown micropipette puller	Sutter Instrument	Model P-1000
H9c2 cells	Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd	CL0111
HCImageLive	Hamamatsu	4.5.0.0
HCl	Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd	2106081
HEPES	Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd	20210221
KCl	Chengdu Colon Chemical Co., Ltd	2020082501
KOH	Chengdu Colon Chemical Co., Ltd	2020112601
MgCl2	Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute	20160408
MgCl2·6H2O	Chengdu Colon Chemical Co., Ltd	2021020101
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285A
Microscope	Olympus	IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm)	Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd	80340-0630
Milli-Q	Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd	Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander	Axon Instrument	MultiClamp commander 2.0	signal-amplifier software
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)	Boster Biological Technology Co., Ltd	17C18B16
PH meter	Mettler Toledo	S201K
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
Trypsin 0.25% (1x)	HyClone	J210045