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Resumo

O presente protocolo descreve um método eficiente para a aquisição dinâmica e em tempo real de correntes de canal de potássio dependentes de voltagem (Kv) em cardiomiócitos H9c2 usando a técnica de patch-clamp de células inteiras.

Resumo

Os canais de potássio na membrana celular miocárdica desempenham um papel importante na regulação das atividades eletrofisiológicas celulares. Sendo um dos principais canais iônicos, os canais de potássio dependentes de voltagem (Kv) estão intimamente associados a algumas doenças cardíacas graves, como dano miocárdico induzido por drogas e infarto do miocárdio. No presente estudo, a técnica de patch-clamp de células inteiras foi empregada para determinar os efeitos de 1,5 mM de 4-aminopiridina (4-AP, um inibidor do canal de potássio de amplo espectro) e aconitina (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM e 200 μM) sobre a corrente do canal de Kv (IKv) em cardiomiócitos H9c2. Verificou-se que o 4-AP inibiu o I Kv em cerca de 54%, enquanto o efeito inibitório da CA sobre o IKv mostrou uma tendência dose-dependente (sem efeito para 25 μM, taxa inibitória de 30% para 50 μM, taxa inibitória de 46% para 100 μM e taxa inibitória de 54% para 200 μM). Devido às características de maior sensibilidade e precisão, esta técnica promoverá a exploração da cardiotoxicidade e dos efeitos farmacológicos da etnomedicina visando os canais iônicos.

Introdução

Os canais iônicos são proteínas especiais integradas embutidas na bicamada lipídica da membrana celular. Na presença de ativadores, os centros dessas proteínas especiais integradas formam poros hidrofílicos altamente seletivos, permitindo que íons de tamanho e carga apropriados passem de forma passivade transporte 1. Os canais iônicos são a base da excitabilidade celular e da bioeletricidade e desempenham um papel fundamental em uma variedade de atividades celulares2. O coração fornece sangue a outros órgãos através de contrações regulares resultantes de um processo acoplado à excitação-contração iniciado pelos potenciais de ação3. Estudos prévios confirmaram que a geração de potenciais de ação em cardiomiócitos é causada pela alteração da concentração de íons intracelulares, e a ativação e inativação dos canais iônicos Na+, Ca2+ e K+ em cardiomiócitos humanos levam à formação de potenciais de ação em uma determinada sequência 4,5,6. Correntes de canal de potássio dependentes de voltagem (Kv) perturbadas (IKv) podem alterar o ritmo cardíaco normal, levando a arritmias, que são uma das principais causas de morte. Portanto, o registro do IKv é fundamental para a compreensão dos mecanismos das drogas para o tratamento de arritmias com risco de vida7.

O canal de Kv é um componente importante do canal de potássio. A função de coordenação do canal de Kv desempenha um papel importante na atividade elétrica e na contratilidade miocárdica do coração de mamíferos 8,9,10. Nos cardiomiócitos, a amplitude e a duração dos potenciais de ação dependem da cocondução de correntes K+ externas por múltiplos subtipos de canais de Kv11. A regulação da função do canal de Kv é muito importante para a repolarização normal do potencial de ação cardíaco. Mesmo a menor alteração na condutância de Kv impacta sobremaneira a repolarização cardíaca e aumenta a possibilidade de arritmia12,13.

Representando um método fundamental na pesquisa eletrofisiológica celular, uma vedação de alta resistência entre uma pequena área da membrana celular e uma ponta de pipeta para gravação de patch clamp de célula inteira pode ser estabelecida aplicando uma pressão negativa. A pressão negativa contínua faz com que a membrana celular entre em contato com a ponta da pipeta e grude na parede interna da pipeta. O circuito elétrico completo resultante permite registrar qualquer corrente de canal iônico único através da superfície da membrana celular14. Esta técnica tem uma sensibilidade muito alta para a corrente do canal iônico da membrana celular e pode ser usada para detectar correntes em todos os canais iônicos, e as aplicações são extremamente amplas15. Além disso, em comparação com a marcação fluorescente e a marcação radioativa, o patch-clamp tem maior autoridade e precisão16. Atualmente, a técnica de patch-clamp de células inteiras tem sido utilizada para detectar os componentes da medicina tradicional chinesa que atuam sobre as correntes do canal Kv17,18,19. Por exemplo, Wang et al. usaram a técnica de pinça de pinça de célula inteira e confirmaram que o componente efetivo da semente de lótus poderia alcançar a inibição do canal Kv4.3 bloqueando os canais de estado ativados19. A aconitina (AC) é um dos ingredientes eficazes e ativos das espécies de Acconitum, como Aconitum carmichaeli Debx e Aconitum pendulum Busch. Numerosos estudos têm demonstrado que overdoses de CA podem causar arritmias e até parada cardíaca20. A interação entre CA e canais iônicos dependentes de voltagem leva à ruptura da homeostase iônica intracelular, que é o principal mecanismo de cardiotoxicidade21. Portanto, neste estudo, a técnica de patch-clamp de células inteiras é usada para determinar os efeitos da CA no IKv dos cardiomiócitos.

Protocolo

Os cardiomiócitos de ratos H9c2 obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) foram incubados em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C em uma atmosfera umidificada de CO2 a 5%. A técnica de patch-clamp de células inteiras foi então empregada para detectar as alterações no IKv em células H9c2 normais e células tratadas com 4-AP- ou AC (Figura 1 e Figura 2).

1. Preparação da solução

  1. Preparar o meio de cultura de células DMEM contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (ver Tabela de Materiais).
  2. Preparar uma solução de 4-AP 1,5 M adicionando 14,1165 mg de 4-AP a 100 μL de solução de DMSO (ver Tabela de Materiais). Diluir 1,5 M 4-AP a 1,5 mM adicionando a solução extracelular (passo 1.5).
  3. Preparar 400 mM AC adicionando 5 mg de AC a 19,36 μL de solução de DMSO (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Todas as soluções acima foram armazenadas num frigorífico a 4 °C, e a concentração final do DMSO não deve exceder 0,1% (v/v).
  4. Preparar 50 mL de solução intracelular adicionando 0,4100 g de KCl (110,0 mM), 0,0120 g de MgCl 2 (1,2 mM), 0,1270 g de ATP Na2 (5,0 mM), 0,1190 g de HEPES (10,0 mM) e 0,1900 g de EGTA (10,0 mM) em 50 mL de água duplamente destilada (ver Tabela 1 e Tabela de Materiais).
    NOTA: O valor de pH da solução intracelular foi ajustado para 7,2 usando 1 M KOH e foi alicitado em pequenos volumes (1,5-2 mL) e armazenado a -20 °C.
  5. Preparar 50 mL de solução extracelular adicionando 0,0185 g de KCl (5,0 mM), 0,3945 g de NaCl (135,0 mM), 0,0203 g de MgCl 2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g de HEPES (5,0 mM) e 0,0990 g de D-glicose (10,0 mM) em 50 mL de água duplamente destilada (ver Tabela 1 e Tabela de Materiais).
    NOTA: A solução extracelular deve ser preparada para uso imediato, e seu valor de pH precisa ser ajustado para 7,4 usando 1 M de NaOH.

2. Cultura celular

  1. Uma vez que a placa de cultura H9c2 se torne 80% confluente, digera as células com 0,25% de tripsina por 30 s.
  2. Cultura 2 x 10 5 células/mL com meio normal ou meio contendo fármaco (25 μM, 50 μM, 100 μM e 200 μM AC) em um prato de 35 mm acarpetado com placas de vidro por 24 h a 37 °C, com atmosfera de5 % de CO2 e 70% a 80% de umidade relativa do ar (ver Tabela de Materiais).

3. Fabricação de micropipetas

  1. Ligue o extrator de micropipeta (consulte Tabela de materiais) e pré-aqueça por 30 min.
  2. Coloque um capilar de vidro borossilicato com um filamento (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm de comprimento) no puxador de micropipeta. Selecione o programa definido na etapa 3.3 e clique em Enter no painel de controle. Clique no programa de rampa no canto superior direito para determinar o valor "Calor" do capilar de vidro.
  3. Escreva o programa para puxar o eletrodo de acordo com o valor determinado pelo teste "Rampa" e use as seguintes etapas: Valor "Calor" = valor "Rampa", Puxar = 0, Vel = velocidade de movimento da haste de tração, Tempo = 200-250. Clique em Puxar para começar a fabricar as pipetas.
    NOTA: Observe a cor dos dessecantes no recipiente selado do extrator de micropipeta antes de usá-lo. Se a cor mudar de azul para rosa, os dessecantes devem ser substituídos. Para evitar a contaminação da ponta do eletrodo, tente não tocar na parte média do capilar de vidro durante a preparação da pipeta. Posteriormente, remova cuidadosamente as pipetas produzidas e coloque-as em um recipiente fechado e selado.

4. Configuração do instrumento

  1. Ligue os instrumentos correspondentes na seguinte ordem: o conversor digital-analógico, o amplificador de sinal, o micromanipulador, o microscópio e a câmera (consulte Tabela de materiais).
  2. Abra o aplicativo de imagem, o software amplificador de sinal e o software de aquisição de dados em sequência (consulte Tabela de materiais).
    NOTA: O instrumento deve ser ligado sequencialmente; caso contrário, o estado "Digitalizador de demonstração" aparecerá após a abertura do software.

5. IKv parametrização

  1. Edite o protocolo para gravar o IKv seguindo as etapas abaixo.
    1. Clique em Editar e selecione Editar Protocolo no software de aquisição de dados (consulte Tabela de Materiais).
    2. Edite o programa na interface "Waveform": Época A (Primeiro nível = −60 mV, Nível Delta = 0 mV, Primeira duração = 20 ms e Duração Delta = 0 ms); Época B (Primeiro nível = −40 mV, Nível Delta = 10 mV, Primeira duração = 150 ms e Duração Delta = 0 ms) e Época C (Primeiro nível = −60 mV, Nível Delta = 0 mV, Primeira duração = 30 ms e Duração Delta = 0 ms).
    3. Em seguida, clique na interface Mode/Rate e defina os dados "Trial Hierarchy": Trial delay = 0 s, Runs = 1, Sweeps = 11 e Sweep duration = 0.22 s22,23.
      NOTA: Adquira as correntes do canal IKv aplicando passos de despolarização de 150 ms de -40 mV a +60 mV com um incremento de 10 mV a um potencial de retenção de -60 mV sob condições de controle. O tempo total do protocolo precisa ser maior do que o tempo definido no programa "Waveform".
  2. Edite o programa de Subtração de Vazamento P/N: clique em Editar Protocolo para selecionar o botão Estímulo e defina o programa de subtração de vazamento na caixa de diálogo Subtração de Vazamento P/N : número de Subvarreduras = 2-8 (4 neste estudo), Tempo de assentamento = 100-1.000 ms (200 neste estudo), "Polaridade" = "Oposto à forma de onda", nível de retenção = −80 mV.
    NOTA: A subtração P/N Leak deve ter um nível de retenção inferior ao "First holding" (-60 mV).

6. Gravação patch-clamp de célula inteira do I Kv no modo voltagem-clamp

  1. Estabeleça o caminho de armazenamento de dados: clique em Arquivo e selecione Definir nomes de arquivos de dados no software de aquisição de dados. Abra o protocolo IKv estabelecido (etapa 5.1) selecionando Editar e clicando em Protocolo Aberto no software de aquisição de dados. Finalmente, clique na opção Ferramentas e selecione Teste de membrana para começar a executar o protocolo.
  2. Adicionar a solução extracelular (passo 1.5) ao banho celular no aparelho de fixação de retalhos de células inteiras (ver Tabela de Materiais) e colocar a tampa para cima com as células H9c2 (cultivadas na fase 2.1) no banho.
  3. Encha 30% da pipeta (fabricada no passo 3) com a solução extracelular e instale-a no suporte do eléctrodo de gravação integrado no aparelho patch-praçadeira. Aperte a pipeta com a junta de borracha o-ring e a arruela de plástico. Em seguida, solte a pipeta no banho com o micromanipulador. Clique na interface de deslocamento da pipeta do software amplificador de sinal (consulte Tabela de materiais) para manter a linha de base da corrente IKv a 0 pA.
    NOTA: A solução intracelular (passo 1.4) deve estar em contacto com a porção AgCl/Ag do fio de prata e o fio de prata não deve estar perto da parede interior da pipeta. A resistência da pipeta precisa ser de 2-6 MΩ. Para evitar a oclusão da ponta da pipeta, uma pressão positiva contínua deve ser administrada à pipeta usando uma seringa de 1,0 mL conectada ao suporte do eletrodo de gravação através de tubos de plástico24.
  4. Administrar uma pressão positiva adequada manualmente com uma seringa de 1,0 ml ligada ao suporte do elétrodo de registo através de um tubo de plástico. Mova ligeiramente a pipeta manipulando o micromanipulador em três dimensões para entrar em contacto com a célula.
  5. Uma vez que a onda quadrada de teste de membrana cai de 1/3 a 1/2 depois que a pipeta toca a membrana celular, remova a pressão positiva e entregue manualmente uma pressão negativa apropriada. Em seguida, clique na interface Patch do software de aquisição de dados para formar o selo GΩ. Use o software amplificador de sinal "C p Fast" e "Cp Slow" durante a vedação da célula para compensar a capacitância rápida e lenta.
    NOTA: Quando o teste de membrana é ≥1 GΩ, uma configuração de célula ligada é formada entre a ponta da pipeta e a célula.
  6. Aplique breves pulsos de pressão negativa para romper um pedaço da membrana celular.
    NOTA: Uma redução vertiginosa na resistência da membrana caracteriza um padrão de gravação de células inteiras bem-sucedido. Se a resistência de acesso (Ra) ≥30 MΩ, as células devem ser reselecionadas para as etapas 6.3-6.6. A fim de garantir a precisão dos dados IKv registrados, a pressão negativa deve ser removida após a quebra da membrana celular.
  7. Execute a compensação da capacitância da membrana de célula inteira clicando no botão Célula inteira do software amplificador de sinal. Finalmente, salve e registre os dados clicando no botão Gravação de dados .
  8. Abra os dados salvos IKv com o software de análise de dados. Salve as relações corrente-tensão (I−V): clique em Analisar para selecionar Estatísticas para fazer o seguinte: selecione o Intervalo como Cousors 1,2 para análise de dados; clique nos botões Amplitude de Pico e Média e, em seguida, clique em OK para visualizar os dados na página Resultados . Finalmente, copie a coluna de dados médios IKv para o software de desenho de funções (consulte Tabela de Materiais) para uma análise mais aprofundada.
  9. Salve o representante IKv traços atuais: clique em Editar para selecionar Transferir Rastreamentos; em seguida, selecione o rastreamento completo na região a ser transferida; em seguida, clique em Selecionar em Seleção de Rastreamento e selecione IN 0 (pA) em Sinais; finalmente, clique em OK para visualizar os dados na página "Resultados" e copie os dados totais para o software de desenho de funções para desenhar os traços atuais.
  10. Salve o protocolo IKv : clique em Editar para selecionar Criar sinal de forma de onda de estímulo e selecione OK. Em seguida, refaça a etapa 6.9, exceto para selecionar A0 # 0 (mA) em "Sinais".

Resultados

Este protocolo permitiu o registro do IKv de acordo com os parâmetros estabelecidos na técnica patch-clamp de células inteiras. O IKv foi desencadeado por 150 ms de estímulo de pulso despolarizante de -40 a +60 mV a um potencial de retenção de -60 mV (Figura 3A). O IKv dos cardiomiócitos de ratos H9c2 apareceu pela primeira vez em torno de -20 mV e, em seguida, a amplitude aumentou com mais despolarização. A relação média entre o IKv e ...

Discussão

A técnica eletrofisiológica patch-clamp é utilizada principalmente para registrar e refletir a atividade elétrica e as características funcionais dos canais iônicos na membrana celular25. Atualmente, os principais métodos de gravação da técnica patch-clamp incluem a gravação de canal único e a gravação de célula inteira26. Para o modo de célula inteira, o microeletrodo de vidro e a pressão negativa são usados para formar uma vedação de alta resistência...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130113) e do Programa Chave de P&D e Transformação do Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Qinghai (2020-SF-C33).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
4-AminopyridineSigmaMKCJ2184
AconitineChengdu Lemetian Medical Technology Co., LtdDSTDW000602
AmplifierAxon InstrumentMultiClamp 700B
Analytical BalanceSartorius124S-CW
ATP Na2Solarbio416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) Sutter Instrument163225-5
Cell culture dish (100 mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd1192022
Cell culture dish (35 mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd3012022
Clampex softwareMolecular Devices, LLC.Version 10. 5
Clampfit softwareMolecular Devices, LLC.Version 10. 6. 0. 13data acqusition software
D-(+)-glucoseRhawnRH289133
Digital cameraHamamatsuC11440
DigitizerAxon InstrumentAxon digidata 1550B
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)Gibco8121587
EGTABiofroxxEZ6789D115
Fetal bovine serumGibco2166090RP
Flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentModel P-1000
H9c2 cellsHunan Fenghui Biotechnology Co., LtdCL0111
HCImageLiveHamamatsu4.5.0.0
HClSichuan Xilong Scientific Co., Ltd2106081
HEPESXiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd20210221
KClChengdu Colon Chemical Co., Ltd2020082501
KOHChengdu Colon Chemical Co., Ltd2020112601
MgCl2Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute20160408
MgCl2·6H2OChengdu Colon Chemical Co., Ltd2021020101
MicromanipulatorSutter InstrumentMP-285A
MicroscopeOlympusIX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm)Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd80340-0630
Milli-QChengdu Bioscience Technology Co., LtdMilli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commanderAxon InstrumentMultiClamp commander 2.0signal-amplifier software 
OriginPro 8 softwareOriginLab Corporationv8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)Boster Biological Technology Co., Ltd17C18B16
PH meter Mettler ToledoS201K
Phosphate buffered saline (1x)Gibco8120485
Trypsin 0.25% (1x)HyCloneJ210045

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