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摘要

该方案概述了在细胞水平上细胞内含有藻红蛋白的蓝藻 Crocosphaera watsonii 的特定蛋白质的可视化和定量。

摘要

提出了一种方案，用于在细胞水平上可视化和定量海洋蓝藻 Crocosphaera watsonii 的细胞中特定蛋白质，Crocosphaera watsonii 是贫营养海洋中重要的初级生产者和固氮剂。海洋自养 N2 固定剂（重氮营养生物）面临的挑战之一是区分探针衍生的荧光信号和自发荧光。选择 C. watsonii 来代表含有叶绿素、藻红蛋白和藻胆素的蓝细菌。该方案允许在单细胞水平上对 C. watsonii 中的蛋白质进行简单和半定量可视化，从而能够研究不同环境条件下的蛋白质产生，以评估目标蓝细菌的代谢活性。此外，固定和透化方法经过优化，以增强来自靶蛋白的荧光信号，以将它们与自发荧光区分开来，特别是与藻红蛋白和藻尿蛋白区分开来。可以使用共聚焦或宽场荧光显微镜观察增强的信号。此外，使用 Fiji 软件对荧光强度进行半定量。该单细胞分析工作流程允许评估特定蛋白质含量的细胞间差异。该方案可以在任何生命科学实验室中进行，因为它只需要标准设备，并且也可以很容易地适应其他含有藻红蛋白的蓝藻细胞。

引言

通过对克隆培养物的研究，已经记录了微生物（包括蓝藻）体内代谢活动在不同细胞之间的生理变化（通常称为“异质性”）1,2,3,4。这种异质性包括不同的代谢活动，例如细胞分裂5、碳同化 6,7,8 和氮同化 9,10。例如，最近的研究表明，菌落蓝藻 C. watsonii 和 C. subtropica （Cyanothece） 中的 N2 固定活性表现出单细胞水平的变异性，存在于细胞亚群中，而存在于群落内的其他细胞群中。值得注意的是，氮摄取或 N2 固定活性在原位细胞之间也表现出可变性 11,12,13。这些发现已通过使用同位素比质谱仪 （NanoSIMS） 进行的稳定 15N 同位素分析得到证实14,15。然而，尽管 NanoSIMS 为在单个细胞水平上分析同位素组成提供了一种新的途径，但由于其技术复杂性和成本，其使用仍然受到限制。

观察代谢活动细胞内异质性的另一种方法是通过免疫检测。早期的报道已经证明了单个细胞中固氮酶的免疫检测，但由于它们的光合色素发出的自发荧光，这带来了挑战 16,17,18。海洋蓝藻，特别是那些适应海洋水域的蓝藻，如主要的海洋重氮菌 C. watsonii 和 Trichodesmium，含有大量的藻胆素，这些藻胆素会以较短的波长发出自发荧光：藻红蛋白和藻胆素19。为了避免这种自发荧光，具有紫外激发的蓝色发射荧光染料已被蓝藻研究所青睐 16,20,21。然而，这种策略并未始终取得成功，因为仅用一抗处理的细胞在紫外线激发下会发出强烈的蓝色至蓝黄色自发荧光20,21。通过在观察之前让细胞暴露在蓝光或紫外线下，并采用半导体纳米晶体，已经努力缓解这个问题22。本研究采用一种不同的策略，使用酪胺信号放大系统 （TSA） 增强蛋白质荧光信号，以可视化细胞含量低的蛋白质。

TSA，也称为催化报告基因沉积 （CARD），是一种高灵敏度的酶法，能够在免疫细胞化学中检测低丰度靶标。该技术利用过氧化物酶的催化活性，将标记的酪胺原位共价沉积在靶蛋白附近 23,24。在过氧化氢存在下，过氧化物酶催化酪胺氧化缩合成反应性酪胺自由基，然后与酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等富电子基团结合25。与标准方法相比，这将信号增强多达 10 到 200 倍，从而使信号可通过标准显色或荧光技术检测。因此，该技术有助于快速、同时评估异质群体和稀有细胞亚群中的多种蛋白质以及表型标记物。值得注意的是，截至目前，蓝藻免疫标记和 TSA 系统的合并仅限于一项在 Cylindrospermopsis raciborskii26 中可视化石房房蛤毒素的研究。

本文概述的方法允许在单细胞水平上研究不同环境条件下的蛋白质产生，从而能够评估目标蓝细菌的代谢活性。全细胞免疫荧光蛋白检测的可用性允许在单细胞水平上对 C. watsonii 中的蛋白质进行快速和半定量可视化。此外，该方法可以很容易地适用于其他含有藻胆素和藻红蛋白的蓝藻细胞。

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研究方案

1. 蓝藻培养

  1. 在 Erlenmeyer 培养瓶或 YBCII 培养基27 中的光生物反应器中培养 Crocosphaera watsonii PS0609 细胞。为了确定培养物密度，使用选择的方法（例如，显微镜、流式细胞术、细胞计数仪等）测量细胞密度。
  2. 将细胞密度保持在 ~1 × 104 至 ~5 × 106 个细胞 mL-1 之间。

2. 试剂的制备

  1. 将 100% 甲醇保持在 -20 °C。
  2. 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）：将 1.36 g KH2PO4、1.42 g Na2HPO4、8.0 g NaCl 和 0.224 g KCl 溶于 0.8 L 蒸馏水中，填充至 1 L，将 pH 值调节至 7.4 并高压灭菌（见 材料表）。
  3. PBS 中的 1% 多聚甲醛 （PFA）
    1. 将 50 mL PBS 加入通风罩中搅拌板上的玻璃烧杯中，加热至 60 °C，然后通过搅拌器混合。
    2. 将 0.5 g 多聚甲醛粉末加入加热的 PBS 溶液中。从移液管滴入 1 N NaOH 直至溶液变得透明，逐渐升高 pH 值。多聚甲醛完全溶解后，降低温度并继续过滤溶液。
    3. 用 PBS 将溶液体积调节至 40 mL。用少量稀盐酸盐将 pH 值调节至约 6.9。将溶液保存在 -20 °C。
  4. PBG 封闭液（0.2% 明胶 + 0.5% 牛血清白蛋白;BSA，见 材料表）
    1. 将 0.2 g 明胶和 0.5 g BSA 溶于 200 mL 玻璃烧杯中的 100 mL PBS 中。将混合物加热至 60 °C 并搅拌。然后，将其分装到 15 mL 试管中并储存在 -20 °C 下。
  5. PBS 中的 0.2% Triton X-100：将 20 μL Triton X-100 添加到 10 mL PBS 中。将其制备在 15 mL 试管中，并在 -20 °C 下保存。
  6. 0.5 M EDTA：将 1.46 g EDTA 溶解在 10 mL 蒸馏水 （DW） 中，并将 pH 值调节至 8.0（EDTA 不会溶解在 pH 值< 8.0 中）。将其制备在 15 mL 试管中，并在 -20 °C 下保存。
  7. 1 M Tris HCl：将 1.58 g Tris HCl 溶解到 10 mL DW 中，并将 pH 值调节至 8.0。将其制备在 15 mL 试管中，并在 -20 °C 下保存。
  8. 50 mM Tris HCl：将 0.079 g Tris HCl 溶入 10 mL DW 中，并将 pH 值调节至 7.0。将其制备在 15 mL 试管中，并在 -20 °C 下保存。
  9. 添加 10 mg/mL 溶菌酶：添加 100 mg 溶菌酶、1 mL 0.5 M EDTA （pH 8） 和 1 mL 1 M Tris HCl （pH 8）。将 DW 至 10 mL 加入 15 mL 试管中。使用当天新鲜准备。
  10. 10,000 单位/mL 脱色肽酶：将 0.011 g 900 单位/mg 脱色肽酶（参见 材料表）溶解到 1 mL DW 中，充分混合，并在 -20 °C 下保存。
  11. 60 单位/mL 去色肽酶工作溶液：在 0.5 mL 50 mM Tris HCl 中加入 3 μL 10,000 单位/mL 去色肽酶。使用当天新鲜制备。
  12. 制备 100x 酪胺储备液：将酪胺试剂溶解在 150 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 中。在 2-8 °C 下储存长达 6 个月。
  13. 1x 反应缓冲液：向 1 mL DW 中加入 1 滴 20x 反应缓冲液。这可以用 pH 7.4 的 Tris 缓冲液代替。
  14. 反应终止试剂解决方案
    1. 反应终止试剂储备液：将 1.45 mL 95% 乙醇加入酪胺信号放大试剂盒中包含的一小瓶反应终止试剂中（参见 材料表）。在 -20 °C 下储存 6 个月
    2. 反应终止试剂工作溶液：在 PBS 中稀释反应终止试剂储备液 （1：11）。使用当天新鲜准备。
  15. 100x H2O2 溶液：向 1 mL DW 中加入 1 滴（约 50 μL）H2O2 。使用当天新鲜准备。
  16. 酪胺工作溶液（最终体积为 510 μL）：按上述顺序将 5 μL 100x 酪胺储备液、5 μL 100x H2O2 溶液和 500 μL 1x 反应缓冲液加入 1.5 mL 试管中，并通过移液轻轻混匀。使用当天新鲜准备。

3. 收获细胞

  1. 将 10 mL 的 C. watsonii 培养物收获到 15 mL 管中，通过在 4 °C 下以 5,500 × g 离心 8 分钟收集细胞，并弃去上清液。在两次手术之间将样品放在冰上。
  2. 用剩余的上清液重悬沉淀，将重悬的亚样品转移到 1.5 mL 试管中，并向洗涤液中加入 1 mL PBS。通过离心（5,500 × g，4°C，5 分钟）收集细胞，并弃去上清液。

4. 细胞的固定和保存

  1. 加入 1 mL 1% PFA 溶液，并在室温下孵育 15 分钟。
  2. 将细胞在 5,500 × g、4 °C、5 分钟下离心，用移液管除去上清液并将其丢弃到指定的化学废物箱中，加入 1 mL PBS，然后重悬。
  3. 离心细胞（5,500 × g，4°C，5 分钟），用移液管除去上清液并丢弃。加入 1 mL 100% 甲醇（保持在 -20 °C），并使用涡旋混合器重悬。将子样品在 -20 °C 下保存 15 分钟至过夜。

5. 透化和封闭

  1. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液管除去上清液（甲醇）并将其丢弃到指定的化学废物箱中，加入 1 mL PBS，然后重悬。
  2. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液管除去上清液并丢弃，加入 1 mL 0.2% Triton X-100 并在室温下孵育 15 分钟。
  3. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液管除去 Triton X-100 上清液并丢弃，加入 1 mL PBS 并重悬。
  4. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液管除去上清液，加入 0.5 mL 溶菌酶（参见 材料表）和 0.5 mL PBG（步骤 2.4），并在 37 °C 下孵育 3 小时。
  5. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液管小心去除上清液并将其丢弃到指定的废圾桶中，加入 0.5 mL 60 单位脱色肽酶（步骤 2.10）和 0.5 mL PBG，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  6. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液管除去无色肽酶上清液，将其丢弃到指定的垃圾箱中，并加入必要量的 PBS。
    注：必要的量应由要观察的子样品数量决定（对于 ~2 cm 直径的圆，一个子样品为 90 μL）。确保准备阴性对照;无 1st 或 2nd 抗体，也无 1st 抗体。

6. 制备成像样品

  1. 将样品放在载玻片上，加入第 1 抗体28。
    1. 用防液载玻笔在聚赖素涂层的载玻片上画两个直径约 ~2 厘米的圆圈（参见 材料表）。将 90 μL 子样品加入圆圈中。在化学罩中干燥应用的子样品。大约需要 30-60 分钟。
    2. 对亚样品进行再水化，用 90 μL PBS 洗涤，孵育 2 分钟，然后弃去 PBS。重复这些步骤 2 次。
    3. 将 1st 抗体在 PBG 封闭液中稀释28 （1 mg mL-1） 200 倍。根据样品数量调整溶液的量。
      1. 在每个子样品上涂抹 90 μL 一抗（1st）抗体 28 ，阴性对照除外。将蒸馏的水湿薄纸放入腔室中，用盖子盖住，然后用嫁接胶带包裹。在 4 °C 下孵育过夜。
  2. 应用 2nd Antibody。
    1. 让载玻片在薄纸上长边站立，去除过量的 1st 抗体，转动它以使细胞上升，然后用移液管将 0.2% Triton X-100 加入每个圆圈中，孵育 2 分钟以冲洗细胞。重复 5 次。
    2. 轻轻涂抹多辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的二抗 （2nd） 抗体（山羊，抗兔 IgG）（参见 材料表），并在室温下孵育 60 分钟。用 PBS 轻轻冲洗细胞 10 分钟;重复 3 次。
  3. 酪胺信号放大
    1. 将 90 μL 酪胺工作溶液添加到样品上，并在室温下孵育 10 分钟。让载玻片在薄纸上长边放置，丢弃溶液。加入 90 μL 反应终止剂，并在室温下孵育 3 分钟。丢弃解决方案。
      注：应测试每种靶蛋白或每种显微镜的孵育时间。可以缩短孵育时间，或者可以省略该步骤，使用共聚焦显微镜观察蛋白质分配，以避免信号过度饱和。
  4. 每 30 分钟用 PBS（5 次）冲洗细胞。用 DW 冲洗细胞。轻快地把水倒掉。添加一滴封固剂（参见 材料表）并放置盖玻片。
  5. 轻轻按压盖玻片以去除多余的封固剂，然后晾干约 30 分钟。用透明指甲油密封并避光存放。

7. 使用荧光显微镜检测荧光信号

  1. 打开荧光显微镜、计算机和紫外光源的电源。打开连接到显微镜的相机的软件（参见 材料表）。设置为 监视实时图像。关掉房间的灯。
    1. 将包含细胞的载玻片插入标本载物台上。使用放大倍数最小的镜头，并调整物镜和聚光镜以微调焦距。将镜头逐个更改为更大的放大倍数。
    2. 将浸油放在盖玻片顶部，然后将镜头更换为油浸 100 倍镜头。从光源中覆盖光源，选择用于 Tyramide-350 分析的 DAPI 滤光片集，然后打开激发紫外光快门。
    3. 测试 3-4 次曝光时间，确定不会过度饱和的最佳曝光时间。选择用于藻红蛋白观察的 FITC 滤光片集，重复该过程，并决定最佳曝光时间。考虑在相机上使用增加增益或合并模式来加快程序并减轻由于光毒性引起的信号衰减。将增益和合并模式设置回图像采集。
  2. 选择视野，为明场图像、酪胺图像和藻红蛋白图像拍摄快照，并为每个图像选择曝光时间。

8. 在共聚焦显微镜下进行检测

  1. 打开共聚焦显微镜和计算机的电源，然后启动显微镜软件。加热激光 60 分钟。关掉房间的灯。将含有细胞的载玻片放在物镜上，使用浸油将载玻片放在标本台上。
  2. 选择 405 nm 激光器并设置主分束器 （MBS） 405。将激光功率设置为 0.5%。设置测量参数以获得 0.03 μm 的像素大小，缩放 10（图像大小 512 x 512 像素）。将像素停留时间设置为 0.02 毫秒，总扫描时间为 5.06 秒。
  3. 在 GaAsP 光谱检测器上将检测器范围设置为 410 nm 至 695 nm，使光谱分辨率为 9 nm。设置最佳增益 （800-900）。启动 lambda 扫描。
    注意：应针对每台显微镜优化最佳增益。

9. 使用 Fiji 量化信号强度

  1. 在荧光显微镜下打开 DAPI 滤镜捕获的图像。在明场图像中选择单元格并定义感兴趣区域 （ROI）。定义所有单元格的 ROI 后，保存 ROI。
  2. 关闭明场图像并打开荧光图像。将 RGB 图像分为红色、蓝色和绿色，以提取 Tyramide-350 信号。
  3. 将明场图像制备的 ROI 应用于蓝色图像并测量信号强度29。保存结果。

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结果

在阴性对照中从细胞外物质中观察到荧光信号，其中未使用第 1种抗体（图 1A-C）。在荧光显微镜下，使用具有紫外线激发的 DAPI 滤光片在 C. watsonii 中成功检测到与 Rubisco 蛋白 （RbcL） 的大亚基偶联的酪胺增强试剂的荧光信号（图 1D-F）。此外，从细胞外聚合物?...

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讨论

对于蓝藻，TSA 系统已广泛用于靶向特异性 rRNA 的 TSA 荧光 原 位杂交（TSA-FISH、CARD-FISH）。然而，它在蛋白质中的应用仍然有限26。在这项研究中，应用 TSA 程序对 N2 固定蓝细菌 C. watsonii 进行全细胞免疫检测，并结合基于先前参考文献20 的修饰。值得注意的修订包括透化，通过溶菌酶和无色肽酶的组合完成

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披露声明

我们确认不存在与本研究相关的利益冲突。

致谢

我们感谢 Radek Kana 博士和 Barbora Šedivá 在共聚焦显微镜分析方面的帮助，以及 Roman Sobotka 博士和 Kateřina Bišová 博士在免疫检测和荧光显微镜分析方面的建议。这项研究得到了捷克研究基金会 GAČR（项目 20-17627S 到 OP 和 TM）、JSPS 和捷克科学院之间的 Mobility plus 项目（JPJSBP 120222502）和 JSPS KAKENHI（项目 23H02301）的财政支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
AchromopeptidaseFUJIFILM014-09661
Alexa Fluor350Thermo ScientificB40952Tyramide-350
Alexa Fluor405Thermo ScientificB48254Tyramide-405
Alexa Fluor488 Tyramide SuperBoost KitThermo ScientificB40922Goat anti-rabbit IgG
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
CentrifugeEppendorf5804 R
Centrifuge tubes (15 mL)VWR525-1085For harvesting cells
Confocal microscopeZeissLSM880 Equipped with Airyscan
Fluorescence microscopeOlympusBX51DAPI filter: Ex.360-370 nm, Em. 420-460 nm
GelatineMerk4070
High precision microscope cover glasses for confocal microscopeDeckgläserNo. 1.5H
Liquid Blocker Regular/MiniDaido Sangyo Co., Ltd.Part 6505For keeping the cells on the slide glass
LysozymeITW ReagentsA4972
MethanolCarl Roth67-56-1
Monopotassium PhosphatePenta12290
Monunting mediumSigma-Aldrich345789-20MLFluorSave Reagent
Mounting mediumVectashildH-1300
Objective lens used in the confocal microscopeZeissPlan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Poly-lysine coated slide glassSigma-AldrichP0425-72EA
Potassium chloride Lach-Ner
Safe lock tube (1.5 mL)Eppendorf0030 120.086For treating cells and storing chemicals
Sodium chloride Penta16610
Sodium hydrogen phosphate Penta15130
Triton X-100Sigma-AldrichX100

参考文献

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