フィコエリトリンとフィコロビリンの高自家蛍光によるシアノバクテリア細胞由来タンパク質の免疫細胞化学的可視化

要約

このプロトコルは、フィコエリスリン含有シアノバクテリアである Crocosphaera watsoniiの細胞レベルでの細胞内の特定のタンパク質の可視化と定量化を概説しています。

要約

提示されたのは、貧栄養海における重要な一次生産者および窒素固定剤である海洋シアノバクテリア Crocosphaera watsoniiの細胞レベルで細胞内の特定のタンパク質を視覚化および定量するためのプロトコルです。海洋独立栄養性_N2 固定剤(ジアゾトローフ)の課題の1つは、プローブ由来の蛍光シグナルと自家蛍光を区別することです。 C. watsonii は、クロロフィル、フィコエリトリン、およびフィコロビリンを含むシアノバクテリアを表すために選択されました。このプロトコールは、 C. watsonii のタンパク質を単一細胞レベルで簡単かつ半定量的に可視化することを可能にし、異なる環境条件下でのタンパク質産生の調査を可能にし、標的シアノバクテリアの代謝活性を評価することができます。さらに、固定法および透過化法は、標的タンパク質からの蛍光シグナルを増強して、標的タンパク質、特にフィコエリトリンおよびフィコロビリンからの自家蛍光と区別するように最適化されています。増強されたシグナルは、共焦点または広視野蛍光顕微鏡を使用して視覚化できます。さらに、蛍光強度はフィジーのソフトウェアを使用して半定量化されました。このシングルセル解析ワークフローにより、特定のタンパク質含有量の細胞間変動を評価できます。このプロトコールは、標準的な機器のみを必要とし、他のフィコエリスリン含有シアノバクテリア細胞にも容易に適応できるため、あらゆるライフサイエンスラボで実施できます。

概要

シアノバクテリアを含む微生物内の代謝活性における細胞間の生理学的変動(一般に「不均一性」と呼ばれる)は、クローン培養の研究を通じて実証されています1,2,3,4。この不均一性は、細胞分裂⁵、炭素同化^6,7,8、窒素同化^9,10などの多様な代謝活性を包含しています。例えば、最近の研究では、コロニーシアノバクテリアC.watsoniiおよびC.subtropica(Cyanothece)の_N2固定活性は、単一細胞レベルの変動性を示し、細胞の亜集団に存在し、コミュニティ内の他の集団には存在しないことが示されています。特に、窒素の取り込みまたは_N2固定活性もまた、in situ細胞間で変動性を示す11,12,13。これらの知見は、同位体比質量分析計(NanoSIMS)^14,15を用いて実施された安定な^15N同位体分析によって実証されている。しかし、NanoSIMSは、個々の細胞レベルで同位体組成を分析するための新しい方法を提供しているにもかかわらず、その技術的な複雑さとコストのために、その使用は依然として制約されています。

代謝活動における細胞内の不均一性を観察する別のアプローチは、免疫検出によるものです。以前の報告では、個々の細胞におけるニトロゲナーゼの免疫検出が実証されているが、これは、それらの光合成色素16,17,18によって放出される自家蛍光のために課題を提起している。海洋シアノバクテリア、特に主要な海洋ジアゾトローフ菌C.watsoniiやTrichodesmiumなどの海洋水に適応したものには、短波長で自家蛍光を発するフィコビリンが大量に含まれています:フィコエリトリンとフィコロビリン¹⁹。この自家蛍光を回避するために、紫外線励起を伴う青色発光蛍光色素がシアノバクテリア研究に好まれている16,20,21。しかし、この戦略は一貫して成功を収めているわけではなく、一次抗体のみで処理した細胞は、UV励起下で強い青色から青みがかった黄色の自家蛍光を放出しました^20,21。この問題を軽減するための努力は、観察前に細胞を青色または紫外線にさらすこと、および半導体ナノ結晶²²を使用することによって行われてきた。本研究では、チラミドシグナル増幅システム(TSA)を使用してタンパク質蛍光シグナルを増強する別の戦略を採用しており、細胞含量が少ないタンパク質を視覚化します。

TSAは、触媒レポーター堆積法(CARD)とも呼ばれ、免疫細胞化学における低存在量のターゲットの検出を可能にする高感度の酵素法です。この技術は、ペルオキシダーゼの触媒活性を利用して、標識チラミドを標的タンパク質in situに近接して共有結合的に沈着させます^23,24。過酸化水素の存在下では、ペルオキシダーゼはチラミドの酸化縮合を触媒して反応性チラミドラジカルにし、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンなどの電子リッチ部分に結合します²⁵。これにより、標準的な方法と比較してシグナルが最大10〜200倍に向上し、標準的な発色技術または蛍光法でシグナルを検出できるようになります。その結果、この手法は、不均一な集団や希少な細胞サブセットにおける表現型マーカーと並んで、複数のタンパク質の迅速かつ同時評価を容易にします。注目すべきは、現在のところ、シアノバクテリアの免疫標識とTSAシステムの融合は、Cylindrospermopsis raciborskii²⁶でサキシトキシンを視覚化した単一の研究に限定されています。

本明細書で概説する方法は、単一細胞レベルでの様々な環境条件下でのタンパク質産生の調査を可能にし、標的シアノバクテリアにおける代謝活性の評価を可能にする。全細胞免疫蛍光タンパク質検出が利用できるため、 C. watsonii のタンパク質をシングルセルレベルで迅速かつ半定量的に可視化することができます。さらに、この方法は、フィコロビリンおよびフィコエリスリンを含む他のシアノバクテリア細胞での使用に容易に適応させることができます。

プロトコル

1.シアノバクテリアの栽培

1. ErlenmeyerフラスコまたはYBCII培地²⁷のフォトバイオリアクターでCrocosphaera watsonii PS0609細胞を培養します。培養密度を決定するには、選択した方法(顕微鏡法、フローサイトメトリー、セルカウンターなど)を使用して細胞密度を測定します。
2. 細胞密度を~1 × 10⁴ から ~5 × 10⁶ 細胞 ^mL-1 に維持します。

2. 試薬の調製

1. 100%メタノールを-20°Cに保ちます。
2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS):1.36 gのKH₂PO₄、1.42 gのNa₂HPO₄、8.0 gのNaCl、および0.224 gのKClを0.8 Lの蒸留水に溶解し、1 Lまで満たし、pHを7.4に調整してオートクレーブします( 材料の表を参照)。
3. PBS中の1%パラホルムアルデヒド(PFA)
   1. 換気フード内の攪拌板に載せたガラスビーカーにPBS50mLを加え、60°Cに加熱して攪拌機で混合する。
   2. 温めたPBS溶液に0.5gのパラホルムアルデヒド粉末を導入します。溶液が透明になるまで、ピペットから1 N NaOHを点滴供給してpHを徐々に上昇させます。パラホルムアルデヒドが完全に溶解した後、温度を下げて溶液のろ過に進みます。
   3. 溶液の量をPBSで40mLに調整します。少量の希薄なHClでpHを約6.9に調整します。溶液を-20°Cで保存します。
4. PBGブロッキング溶液(0.2%ゼラチン+ 0.5%ウシ血清アルブミン;BSA、 資料の表を参照)
   1. 200mLのガラスビーカーで、0.2gのゼラチンと0.5gのBSAを100mLのPBSに溶かします。混合物を60°Cに加熱し、攪拌します。その後、15mLのチューブに分注し、-20°Cで保存します。
5. 0.2% Triton X-100 in PBS:20 μL の Triton X-100 を 10 mL の PBS に加えます。15 mLのチューブで調製し、-20°Cで保存します。
6. 0.5 M EDTA:1.46 gのEDTAを10 mLの蒸留水(DW)に溶解し、pHを8.0に調整します(EDTAはpH 8.0<溶解しません)。15 mLのチューブで調製し、-20°Cで保存します。
7. 1 M Tris HCl:1.58 gのTris HClを10 mLのDWに溶解し、pHを8.0に調整します。15 mLのチューブで調製し、-20°Cで保存します。
8. 50 mM Tris HCl:0.079 gのTris HClを10 mLのDWに溶解し、pHを7.0に調整します。15 mLのチューブで調製し、-20°Cで保存します。
9. 10 mg/mL リゾチームを添加する: 100 mg のリゾチーム、1 mL の 0.5 M EDTA(pH 8)、1 mL の 1 M Tris HCl(pH 8)を添加します。15mLチューブに最大10mLのDWを加えます。ご利用当日に出来立てでご用意ください。
10. 10,000 units/mL アクロモペプチダーゼ:0.011 g の 900 units/mg アクロモペプチダーゼ( 材料表を参照)を 1 mL の DW に溶解し、よく混合し、-20 °C で保存します。
11. 60 units/mL achromopeptidase working solution: 0.5 mL の 50 mM Tris HCl に 3 μL の 10,000 units/mL アクロモペプチダーゼを加えます。使用日に新たに調製します。
12. 100倍チラミドストック溶液を調製する:チラミド試薬を150 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解します。2〜8°Cで最大6か月間保管してください。
13. 1x Reaction buffer:1 mLのDWに1滴の20x Reaction bufferを加えます。これは、pH 7.4のトリス緩衝液で置き換えることができます。
14. 反応停止試薬溶液
    1. 反応停止試薬ストック溶液:チラミドシグナル増幅キットに含まれる反応停止試薬のバイアル1本に1.45 mLの95%エタノールを加えます( 材料の表を参照)。-20°Cで6ヶ月間保存
    2. 反応停止試薬使用溶液:反応停止試薬原液(1:11)をPBSで希釈します。ご利用当日に出来立てでご用意ください。
15. 100x H₂O₂ 溶液:1 mLのDWに1滴(約50 μL)のH₂O₂ を加えます。ご利用当日に出来立てでご用意ください。
16. チラミドワーキング溶液(最終容量510 μL):100x チラミドストック溶液5 μL、100x H₂O₂ 溶液5 μL、1x Reaction buffer500 μLを上記の順序で1.5 mLチューブに加え、ピペッティングでよく混合します。ご利用当日に出来立てでご用意ください。

3. 細胞の採取

1. 10 mLのC. watsonii培養物を15 mLチューブに回収し、5,500 × g、4°Cで8分間遠心分離して細胞を回収し、上清を捨てます。手順の合間にサンプルを氷の上に置いておきます。
2. 残りの上清でペレットを再懸濁し、再懸濁したサブサンプルを1.5 mLチューブに移し、1 mLのPBSを洗浄液に加えます。遠心分離(5,500 × g、4°C、5分)で細胞を回収し、上清を捨てます。

4. 細胞の固定と保存

1. 1% PFA溶液1 mLを加え、室温で15分間インキュベートします。
2. 細胞を5,500 × g、4°C、5分間遠心分離し、ピペットで上清を除去し、割り当てられた化学廃棄物ビンに捨て、PBSを1 mL加えて再懸濁します。
3. 細胞を遠心分離(5,500 × g、4°C、5分)し、ピペットで上清を取り除き、廃棄します。100%メタノール(-20°Cに保持)1 mLを加え、ボルテックスミキサーを使用して再懸濁します。サブサンプルを-20°Cに15分間から一晩保管します。

5. 透過化とブロッキング

1. 細胞を遠心分離(5,500 × g、4°C、5分)し、上清(メタノール)をピペットで除去し、所定の化学廃棄物ビンに捨て、PBS1 mLを加えて再懸濁します。
2. 細胞を遠心分離(5,500 × g、4°C、5分)し、ピペットで上清を除去して廃棄し、0.2% Triton X-100 1 mLを加えて室温で15分間インキュベートします。
3. 細胞を遠心分離(5,500 × g、4°C、5分)し、Triton X-100上清をピペットで取り除いて廃棄し、PBS1 mLを加えて再懸濁します。
4. 細胞を遠心分離(5,500 × g、4°C、5分)し、ピペットを使用して上清を除去し、0.5 mLのリゾチーム( 材料表を参照)と0.5 mLのPBG(ステップ2.4)を加え、37°Cで3時間インキュベートします。
5. 細胞を遠心分離(5,500 × g、4°C、5分)し、ピペットを使用して上清を慎重に除去し、割り当てられたゴミ箱に捨て、0.5 mLの60ユニットのアクロモペプチダーゼ(ステップ2.10)と0.5 mLのPBGを加え、37°Cで30分間インキュベートします。
6. 細胞を遠心分離し(5,500 × g、4°C、5分)、ピペットを使用してアクロモペプチダーゼ上清を除去し、割り当てられたゴミ箱に捨て、必要な量のPBSを添加します。
   注:必要な量は、観察するサブサンプルの数によって決定する必要があります(1つのサブサンプルは、直径~2cmの円に対して90μLです)。ネガティブコントロールを準備してください。^{1st 抗体も} 2nd 抗体も持たず、^st 抗体も 1 つありません。

6. イメージング用サンプルの調製

1. スライドガラスにサンプルを載せ、1つ目の抗体²⁸を添加します。
   1. ポリリシンを塗布したスライドガラスに、撥液性スライドマーカーペンで直径約~2cmの円を2本描きます( 資料表参照)。90 μLのサブサンプルを円に塗布します。適用したサブサンプルをケミカルフードで乾燥させます。所要時間は約30〜60分です。
   2. サブサンプルを再水和し、90 μLのPBSで洗浄し、2分間インキュベートしてPBSを廃棄します。この手順を2回繰り返します。
   3. 1^番目の 抗体²⁸ (1 mg ^mL-1)をPBGブロッキング溶液で200倍に希釈します。サンプル数に応じて溶液の量を調整します。
      1. ネガティブコントロールを除く各サブサンプルに90 μLの一次抗体(1^st)抗体²⁸ を塗布します。蒸留した水濡れティッシュペーパーをチャンバーに入れ、カバーで閉じ、グラフトテープで包みます。4°Cで一晩インキュベートします。
2. 2^つ目の 抗体を塗布します。
   1. スライドガラスをティッシュペーパーの長辺に立たせて余分な1^番目の 抗体を取り除き、回転させて細胞を浮き上がらせ、ピペットを使用して各円に0.2%Triton X-100を加え、2分間インキュベートして細胞をすすぎます。5回繰り返します。
   2. ポリホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体(ヤギ、抗ウサギIgG)(材料表を参照)を穏やかに塗布し、室温で60分間インキュベートします。細胞をPBSで10分間穏やかにすすぎます。3回繰り返します。
3. チラミドシグナル増幅
   1. 90 μLのチラミドワーキング溶液をサンプルに加え、室温で10分間インキュベートします。スライドガラスをティッシュペーパーの長辺に立たせて溶液を捨てます。反応停止試薬90μLを加え、室温で3分間インキュベートします。解決策を破棄します。
      注:インキュベーション時間は、各標的タンパク質または各顕微鏡で試験する必要があります。インキュベーション時間を短縮したり、ステップを省略して共焦点顕微鏡でタンパク質の割り当てを観察したりして、シグナルの過飽和を回避することができます。
4. 30分ごとに細胞をPBS(5回)ですすいでください。DWで細胞をすすぎます。勢いよく水を取り除きます。封入剤を1滴加え( 材料表を参照)、カバーガラスを置きます。
5. カバーガラスを軽く押して余分な封入剤を取り除き、約30分間乾燥させます。透明のマニキュアで密封し、暗所で保管してください。

7. 蛍光顕微鏡による蛍光シグナルの検出

1. 蛍光顕微鏡、コンピューター、およびUV光源の電源を入れます。顕微鏡に接続されたカメラのソフトウェアを開きます( 材料の表を参照)。ライブ画像を監視するように設定します。部屋の照明を消します。
   1. 細胞の入ったスライドガラスを試料ステージに挿入します。倍率が最小のレンズを使用し、対物レンズと集光レンズを調整してピントを微調整します。レンズを1枚ずつ拡大倍率に変えてください。
   2. カバーガラスの上に浸漬油を敷き、レンズを油浸100倍レンズに交換します。光源から光源を覆い、Tyramide-350解析用のDAPIフィルターセットを選択し、励起UVライトシャッターを開きます。
   3. 3〜4回の露光時間をテストし、過飽和状態のない最適な露光時間を決定します。フィコエリトリン観察用のFITCフィルターセットを選択し、手順を繰り返して、最適な曝露時間を決定します。カメラのゲインアップモードまたはビニングモードを利用して、手順を迅速化し、光毒性による信号劣化を軽減することを検討してください。画像取得のゲインとビニングモードを戻します。
2. 視野を選択し、明視野画像、チラミド画像、フィコエリトリン画像のスナップショットを撮り、各画像について選択した露光時間で撮影します。

8. 共焦点顕微鏡での検出

1. 共焦点顕微鏡とコンピューターの電源を入れ、顕微鏡ソフトウェアを起動します。レーザーを60分間加熱します。部屋の照明を消します。細胞を収めたスライドガラスを、対物レンズに油浸しして試料ステージに置きます。
2. 405 nmレーザーを選択し、メインビームスプリッター(MBS)405をセットします。レーザー出力を0.5%に設定します。測定パラメータを設定して、0.03μmのピクセルサイズ、ズーム10(画像サイズ512 x 512ピクセル)を取得します。ピクセル滞留時間を 0.02 ミリ秒に設定すると、合計スキャン時間は 5.06 秒になります。
3. GaAsPスペクトル検出器で検出器の範囲を410nmから695nmに設定し、9nmのスペクトル分解能を実現します。最適なゲイン(800-900)を設定します。ラムダスキャンを開始します。
   注:最適なゲインは、各顕微鏡に最適化する必要があります。

9. フィジーを使用して信号の強度を定量化する

1. DAPIフィルターで撮影した画像を蛍光顕微鏡で開きます。明視野画像でセルを選択し、関心領域 (ROI) を定義します。すべてのセルの ROI を定義したら、ROI を保存します。
2. 明視野画像を閉じて、蛍光画像を開きます。RGB イメージを赤、青、緑に分けて、Tyramide-350 信号を抽出します。
3. 明視野画像により作製したROIを青色画像に適用し、信号の強度^{を測定する29}。結果を保存します。

結果

蛍光シグナルは、1^番目の抗体が使用されていないネガティブコントロールの細胞外物質から観察されました(図1A-C)。Rubiscoタンパク質(RbcL)の大きなサブユニットに結合したチラミドブースト試薬の蛍光シグナルは、UV励起付きDAPIフィルターを使用した蛍光顕微鏡下でC. watsoniiで検出に成功しました(

ディスカッション

シアノバクテリアについては、TSAシステムは、特定のrRNAを標的とするTSA-蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(TSA-FISH、CARD-FISH)に広く使用されています。しかし、タンパク質への応用は依然として限られています²⁶。この研究では、N₂固定シアノバクテリア C.watsoniiの全細胞免疫検出を可能にするためにTSA手順を適用し、以前の参?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Achromopeptidase	FUJIFILM	014-09661
Alexa Fluor350	Thermo Scientific	B40952	Tyramide-350
Alexa Fluor405	Thermo Scientific	B48254	Tyramide-405
Alexa Fluor488 Tyramide SuperBoost Kit	Thermo Scientific	B40922	Goat anti-rabbit IgG
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Centrifuge	Eppendorf	5804 R
Centrifuge tubes (15 mL)	VWR	525-1085	For harvesting cells
Confocal microscope	Zeiss	LSM880	Equipped with Airyscan
Fluorescence microscope	Olympus	BX51	DAPI filter: Ex.360-370 nm, Em. 420-460 nm
Gelatine	Merk	4070
High precision microscope cover glasses for confocal microscope	Deckgläser	No. 1.5H
Liquid Blocker Regular/Mini	Daido Sangyo Co., Ltd.	Part 6505	For keeping the cells on the slide glass
Lysozyme	ITW Reagents	A4972
Methanol	Carl Roth	67-56-1
Monopotassium Phosphate	Penta	12290
Monunting medium	Sigma-Aldrich	345789-20ML	FluorSave Reagent
Mounting medium	Vectashild	H-1300
Objective lens used in the confocal microscope	Zeiss	Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Poly-lysine coated slide glass	Sigma-Aldrich	P0425-72EA
Potassium chloride	Lach-Ner
Safe lock tube (1.5 mL)	Eppendorf	0030 120.086	For treating cells and storing chemicals
Sodium chloride	Penta	16610
Sodium hydrogen phosphate	Penta	15130
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100