研究稀缺细胞群中以启动子为中心的时空基因组结构的集成工作流程

摘要

基因表达由基因启动子与远端调控元件的相互作用调节。在这里，我们解释了低输入捕获Hi-C（liCHi-C）如何允许在稀有细胞类型中鉴定这些相互作用，这些相互作用以前是无法测量的。

摘要

时空基因转录受到远端调控元件（如增强子和消音器）的严格调控，这些元件依赖于与靶基因启动子的物理接近来控制转录。虽然这些调控元件很容易识别，但它们的靶基因很难预测，因为它们中的大多数是细胞类型特异性的，并且可能在线性基因组序列中被数百个千碱基分开，跳过其他非靶基因。几年来，启动子捕获Hi-C（PCHi-C）一直是远端调控元件与其靶基因关联的黄金标准。然而，PCHi-C依赖于数百万个细胞的可用性，禁止研究稀有细胞群，例如通常从原代组织获得的细胞群。为了克服这一限制，已经开发了低输入捕获Hi-C（liCHi-C），这是一种经济高效且可定制的方法来识别控制基因组每个基因的远端调控元件库。liCHi-C依赖于与PCHi-C类似的实验和计算框架，但通过采用最小的试管更换，修改试剂浓度和体积，以及交换或消除步骤，它可以在文库构建过程中实现最小的材料损失。总的来说，liCHi-C能够在发育生物学和细胞功能的背景下研究基因调控和时空基因组组织。

引言

时间基因表达驱动细胞分化，并最终推动生物体发育，其改变与^{多种疾病密切相关}1，²，³，^4，5。基因转录受调控元件作用的精细调控，调控元件可分为近端（即基因启动子）和远端（例如增强子或消音器），后者通常位于远离其靶基因的位置，并通过染色质环与它们发生物理相互作用以调节基因表达⁶，^7，8。

基因组中远端调控区域的鉴定是一个被广泛同意的问题，因为这些区域具有特定的组蛋白修饰⁹，^10，11并且包含特定的转录因子识别基序，作为它们的招募平台¹²，^13，14。<....

研究方案

为确保最小的材料损失，（1）使用DNA低结合管和吸头（参见 材料表），（2）将试剂放在管壁上，而不是将吸头引入样品内部，（3）如果可能，通过倒置而不是上下移液样品混合样品，然后向下旋转以回收样品。

1. 细胞固定

1. 悬浮生长的细胞
   1. 收获 50，000 至 100 万个细胞，并将它们放入 DNA 低结合的 1.5 mL 管中。
      注意：用于本研究的细胞类型详见代表性结果部分。
   2. 使用固定角度转子离心机在600× g （4°C）下离心细胞5分钟，并通过移液除去上清液。
   3. 在室温下将细胞重悬于补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的 1 mL RPMI 1640 中。
   4. 加入 143 μL 不含甲醇的 16% 甲醛，达到 2% 的浓度并混合。
   5. 将细胞孵育10分钟，同时在室温下旋转以固定细胞。
      注意：尝试在10分钟的孵育中尽可能准确。细胞的过度固定或固定不足会导致文库质量下降。
   6. 通过加入 164 μL 冰冷的 1 M 甘氨酸并混合来淬灭反应。孵育细胞5分钟，在室温下旋转。
   7. 进一步将细胞在冰上孵育15分钟，每~5分钟倒置混合一次。
   8. 使用固定角度转子离心机在1，000× g （4°C）下离心细胞10....

讨论

liCHi-C提供了使用PCHi-C的类似实验框架生成高分辨率启动子相互作用组库的能力，但细胞数量大大减少。通过消除不必要的步骤，例如苯酚纯化和生物素去除，可以极大地实现这一点。在经典的核内连接Hi-C方案⁵⁷ 及其随后的衍生技术PCHi-C中，生物素从非连接的限制性内切性片段中去除，以避免拉下随后没有信息的DNA片段。跳过这部分及其随后的DNA纯化不会显着降低有效读数的百?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8.0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer	New England Biolabs	B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes	Qiuantabio	2302820	For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification	Integrated DNA Technologies	-	Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers	Nunc	179693	Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)	Any brand
CHiCAGO R package	1.14.0
CleanNGS beads	CleanNA	CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65002	For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads	Invitrogen	65602	For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute	VWR	20821.321
FBS, qualified	Gibco	10270-106	Or any other brand
Glycine	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant	Invitrogen	AM9515	Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP	0.8.2
HindIII, 100 U/µL	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL	New England Biolabs	M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials	Covaris	520045	For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL	New England Biolabs	R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502
PCR primers for quality controls	Integrated DNA Technologies	-
PCR strips and caps	Agilent Technologies	410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531L	For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)	Roche	11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche	3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit	Invitrogen	Q33230	For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
rCutsmart buffer	New England Biolabs	B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology	PanReac AppliChem	A0676
Sodium acetate pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library	Agilent Technologies	5190-4831	Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1	Agilent Technologies	5190-8645	Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter	Agilent Technologies	931107	Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL	Invitrogen	15224025	For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000 units/mL	New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200 instrument	Agilent Technologies		For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML