根癌农杆菌介导的绿色微藻、寻常小球藻的基因工程

摘要

该方案概述了 利用根癌农杆菌介导的转化（AMT）将目的基因整合到绿色微藻 小球藻的核基因组中，从而产生稳定的转化体。

摘要

根癌农杆菌介导的转化（AMT）是一种广泛使用的植物基因组操纵工具。然而， 根癌曲霉 表现出将基因转移到多种物种的能力。许多微藻物种缺乏将目标基因可靠地整合到其核基因组中的成熟方法。为了利用微藻生物技术的潜在优势，简单高效的基因组操作工具至关重要。本文，利用报告绿色荧光蛋白（mGFP5）和潮霉素B的抗生素耐药性标记物，提出了针对工业微藻物种 寻常小球藻的优化AMT方案。经过十代以上的传代培养后， 通过荧光定量 mGFP5 的表达，表明 T-DNA 盒的稳定转化。该方案允许在两周内可靠地生成多个转基因 寻常念珠 菌菌落，采用市售的pCAMBIA1302植物表达载体。

引言

根癌农杆菌是一种革兰氏阴性土壤传播细菌，具有独特的界间基因转移能力，因此被誉为“天然基因工程师”¹。这种细菌可以通过 IV 型分泌系统将 DNA （T-DNA） 从肿瘤诱导质粒 （Ti-Plasmid） 转移到宿主细胞中，导致 T-DNA 在宿主基因组内的整合和表达 1,2,3,4。在自然环境中，这个过程会导致植物肿瘤形成，通常称为冠瘿病。然而，农杆菌也可以将 T-DNA 转移到各种其他生物体中，包括酵母、真菌、藻类、海胆胚胎，甚至在实验室条件下的人类细胞 5,6,7,8。

利用这一自然系统， 根癌农杆菌介导的转化 （AMT） 通过修饰 Ti 质粒的 T-DNA 区域，将目标基因随机整合到宿主细胞的核基因组中。为此，广泛使用的AMT植物表达载体是pCAMBIA1302<....

研究方案

除非另有说明，否则所有培养基和溶液必须在使用前进行高压灭菌。所有离心管、移液器吸头等在使用前应无菌或高压灭菌。为了便于参考， 表1中列出了该协议中使用的培养基配方。

1. 根癌曲霉电 感受态细胞的制备

1. 将农杆菌（AGL-1）接种到25mL无菌摇瓶中，该瓶装有LB培养基（补充利福平，20mg / L - 1），来自冷冻甘油原液，并在28-30°C和150rpm下生长过夜。
   注： 农杆菌 菌株AGL-1对利福平、氨苄西林、氯霉素和链霉素具有抗性（见 材料表），可从多家供应商处获得。
2. 第二天，通过将0.5μL过夜培养物加入50mL高压灭菌的超纯水中，将培养物稀释1,00,000倍，并将10μL稀释的培养物铺在LB板上，然后在28-30°C下孵育1-3天。
3. 选择一个菌落，并在28-30°C下用利福平在LB中开始20mL过夜培养。
4. 第二天，在装有9 mL过夜培养物的摇瓶中接种500 mL LB培养基（无抗生素），并在28-30°C下生长，直到OD₆₀₀ 达到0.5。
5. 将培养物均匀地分成10个50mL离心管，并在冰上冷却30分钟。将离心机预冷至4°C。
6. 将试管在4°....

讨论

转换效率与几个不同的参数相关联。用于AMT的 根癌不动杆菌菌 株的选择至关重要。AGL-1 是已发现的最具侵袭性的菌株之一，因此，已常规用于植物 AMT。 用葡萄糖 （15-20 mM） 补充诱导培养基对于 AMT 效率也很重要。考虑到 寻常梭菌 可以在光养和异养条件下生长，微藻培养基中通常省略葡萄糖或其他碳源以防止污染。例如，Bold 的基础培养基 （BBM） 是 C. vulgaris^19<.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01