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摘要

该抗体同源性建模预测方案之后是抗体-受体 Pyrx 对接和分子动力学模拟。这三种主要方法用于可视化准确的抗体-受体结合区域和最终结构的结合稳定性。

摘要

单链片段可变 （scFv） 抗体以前由可变轻链和重链构建，这些链由 （Gly4-Ser） 3 接头连接。接头是使用分子建模软件作为环结构创建的。在这里，我们介绍了一种对与表皮生长因子受体 （EGFR） 相互作用的完整 scFv 抗体进行计算机 分析的方案。同源建模，使用蛋白质-蛋白质对接的 Pyrx 以及相互作用的 scFv 抗体和 EGFR 的分子动力学模拟首先，作者使用蛋白质结构建模程序和 Python 进行同源建模，并对抗体 scFv 结构进行建模。研究人员下载了 Pyrx 软件作为对接研究的平台。分子动力学模拟使用建模软件运行。结果表明，当 MD 模拟进行能量最小化时，蛋白质模型的结合能最低 （-5.4 kcal/M）。此外，本研究中的 MD 模拟显示，当结构的运动急剧增加到 7.2 Å 时，对接的 EGFR-scFv 抗体稳定 20-75 ns。总之，进行了 计算机分析，scFv 抗体的分子对接和分子动力学模拟证明了所设计的免疫治疗药物 scFv 作为 EGFR 特异性药物治疗的有效性。

引言

蛋白质（配体和受体）的构象变化总是基于基于结构的功能而发生。研究蛋白质可能的结合沟和预测稳定的结合相互作用是制备药物以更好地在人体中使用的一种先进方法。同源建模后进行对接和分子动力学模拟是一种简单的方法，可以准确预测受体残基与用作特异性个性化药物的构建抗体之间结合的稳定相互作用 1,2。预测的模型结构可以显示配体-受体结合位点的构象变化和重排，特别是在抗体-受体界面处。这些变化的原因有很多，例如侧链的旋转、全局结构变换或更复杂的修改。同源建模的主要原因是区分蛋白质的三级结构与其一级结构 2,3。

一种称为表皮生长因子受体 （EGFR） 的酪氨酸激酶受体在癌细胞中起着许多生物学作用，包括细胞凋亡 4,5、分化 6,7、细胞周期进程 8,9、发育 9,10 和转录11。EGFR 是乳腺癌的知名治疗靶点之一12。常规激酶活性（如 EGFR）的过表达通常会导致癌细胞进展，这可以被多种癌症抑制剂抑制13。表皮生长因子受体 （EGFR） 被用作专门构建用于对抗该受体的单链片段变量的受体。其预测结构用于测试抗体结合活性。

在本文中，使用建模软件、Python 脚本和同源建模方法14,15 对 scFv 抗体结构进行建模。可以从受体和配体的蛋白质和氨基酸序列构建同源模型16,17。此外，采用分子对接等先进的生物信息学技术来预测小分子配体如何与正确的靶结合位点结合。对接将平衡针对多种疾病的新药的开发。考虑了绑定行为 5,18。

此外，分子对接是促进和加速配体-受体结合发展的关键技术。分子对接使科学家能够虚拟筛选针对靶蛋白的配体库，并预测配体与靶受体蛋白的结合构象和亲和力。分子动力学模拟 （MNS） 展示了残基如何在空间中移动，模拟抗体向受体的运动，并最终为抗体设计工作提供信息。这项研究是对网格框尺寸的新预测，它决定了 scFv 抗体如何与 EGFR 结合，以及在 MDsimulation 中检测该结合的能量和时间。

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研究方案

1. 单链片段可变 （scFv） 蛋白的二级结构预测

  1. 使用 BLAST 蛋白质数据库 （PDB）、KABAT 编号和建模软件构建单链片段可变 （scFv） 蛋白的 3D 结构。scFv 由连接可变重链 （VH） 和可变轻链 （VL） 的接头 （Gly4-Ser） 组成。
  2. 使用分子建模软件将接头构建为环结构，并按照先前研究 2,19,20 中描述的所有这些方法执行。

2. 模板选择和 scFv 和 EGFR 3D 结构预测和同源建模

  1. 为 EGFR 结构选择模板 1ivo（基于其高分辨率）。从 pdb 网站下载 1ivo.pdb 文件，如图 1B 所示。
  2. 如下所述准备输入 1ivo.pdb 文件。
    1. 在 1ivo.pdb 文件中，通过打开 pdb.org 网站并选择 1ivo 来删除所有外部配体。结构，并在 pdb 网站的 1ivo 结构页面上的小分子标题下查找配体的名称。
    2. 找到配体名称 NAG。打开从 pdb 网站下载的 1ivo.pdb 文件，找到终止残差 （TER）。
    3. 删除 1ivo 结构中外部配体的残基，从 TER 之后的残基开始，在残基结束之前。将 1ivo.pdb 文件保存在系统上。
  3. 如下所述准备保存的 1ivo.pdb 文件。
    1. 从窗口选择区域下载 Autodock 停靠软件 （autodock.scripps.edu）。单击 Open 1ivo.pdb 文件。
    2. 使用 Edit（编辑）命令选择 Add Hydrogen （添加氢气>添加），然后选择 Polar Only （仅极地），然后按 Ok（确定）。
    3. 使用 Edit 命令添加 Kollman 费用（补充图 1）。使用 Edit 命令删除水。将 1ivo.pdb 文件保存在 PC 上。
  4. 最小化 1ivo.pdb 结构的能量，如下所述。
    1. 下载 SPDBV。http://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html 软件。打开 1ivo.pdb 文件。
    2. 全选。选择命令 Perf > Energy minimization > Ok（补充图 2）。将 1ivo 文件保存在 PC 上。
  5. 如下所述，使用同源建模准备完整的模型 scFv。
    1. 从 Window- 64 下载建模软件17 和 Python 脚本 3.7.9 shell。将下载的软件文件保存在 D 驱动器中。
  6. 如下所述准备输入文件。
    1. 从 NCBI 网站加载 fasta 格式的 scFv Pdb 文件，并将文件重命名为 TARGET.ali。如 补充编码文件 1 中所述。使用 NCBI 中的 Blast 部分选择模板，粘贴排序文件，按照 补充编码文件 2 中的说明以 pdb 格式选择 7det.pdb，然后提交。然后，使用 pdb.org 网站获取模板文件。
    2. 按照 补充编码文件 3 中的说明将第三个输入文件准备为 align2d.py （Python），该文件打开，如 补充图 3A 所示。按 显示更多 选项，然后转到 使用 IDLE 编辑 > 使用 EDLE 编辑（64 位）”。使用 align2d.py 中的 run module 5 命令运行，以获取两个输出文件：Tar- 7det.ali 和 Tar- 7det.pap。
  7. 完成前面的三个步骤以使用最后一个输入文件中的命令。
  8. model-single.py 添加新的输入文件（命令 python 文件），如 补充编码文件 4 中所示，如下所述。
    1. 按 显示更多 选项，然后转到 使用 IDLE 编辑 > 使用 EDLE3.7（64 位）编辑。使用 （run module 5） 命令运行，如 补充图 3B 所示。
      注意：生成的输出文件是 补充图 3C 中显示的同源模型的六个文件。

3. 受体二级结构预测和评价

  1. 检测同源模型的校正和准确性，如下所述。
    1. 通过从 https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download 下载可视化工具，为 scFv 模型和 EGFR 模型创建 Ramachandran 图。
    2. 打开文件，然后用鼠标右键单击并选择显示序列（补充图 4）。复制序列并将其粘贴到 3D 结构 （pdbsum） www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/ 的 Pictorial 数据库中。
    3. 选择 按序列搜索，粘贴序列的副本，然后提交。创建如图 1B、D 所示的图。

4. 蛋白质-蛋白质对接

  1. 下载虚拟筛查工具软件。
  2. 转到 File>读取分子>加载 1ivo.pdb。右键单击 autodock 面板中的蛋白质以生成大分子。再次右键单击以制作配体（补充图 5）。
  3. 单击自动停靠面板以选择 蛋白质 ，然后选择 配体。
  4. 打开蛋白质列表。然后，从列表中选择 scFv Protein。
  5. 转到 Toggle Selection Spheres（切换选择球体）。将网格框调整到接收器的中心。点击 向前 当圆形粉红色按钮出现时。
  6. 要为 scFv-antibody 和 EGFR （1ivo） 结构准备 pdbqt 文件，请使用以下步骤。
    1. 转到 C 盘 > Program Files （86） > 用户），然后选择包含保存为 pdbqt 文件的大分子和蛋白质输出文件的 pyrx 文件。
    2. 然后，保存单链可变片段 （scFv） 抗体 pdbqt 文件。
  7. 在 PyMOL 下载 PyMOL 软件 |pymol.org。使用 PyMOL 软件显示 scFv 抗体受体 EGFR 配置。
    1. 转到文件并打开 C：\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein。准备 scFvantibody 的对接配置与 图 2A 中的受体相互作用，如下所述。
      1. 使用显示选项将 （1ivo） 受体文件显示为具有白色背景的序列残基，如 补充图 6 所示。
      2. 以更高分辨率显示停靠配置文件，以绿色和红色残基颜色查看配体颜色。以黄色显示 （1ivo） 受体刚性表面。
  8. 准备 scFvantibody 的对接配置与 图 2B 中的受体相互作用，如下所述。
    1. 从窗口选择区域下载停靠软件。使用 Autodock 显示 scFv 抗体受体 EGFR 构型和构象。
      1. 在 Autodock 中，选择 Analyze Option （分析选项），然后打开 Autodock Vina 结果。转到 文件 并打开 C：\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein。
      2. 选择蛋白质受体 pdb 文件，然后选择配体配置的区域（scFv 抗体结构）。将受体的刚性表面与对接结构的配置连接起来，并隐藏受体的其余部分。将受体的远残基从连接到配体的残基中隐藏起来，如图 2B 所示。
    2. 然后认为蛋白质-蛋白质复合物已准备好进行 MD 模拟。

5. EGFR-scFv 抗体对接复合物的分子动力学模拟（MD 模拟）

  1. 下载 MD 模拟软件并按如下方式使用。
    1. 使用修复向导准备 EGFR （1ivo） pdb 文件，如 补充图 7A 所示。作 preprocess 部分以优化文件。发送要在 System Builder 中设置的优化文件。
    2. 从工作目录加载分子动力学模拟软件。添加离子并升级精制文件以达到 20 Å 以提交作业（表 1），也显示在 补充图 7B 中。
    3. 从导入的文件中加载 EGFR （1ivo） pdb，然后选择 100 ns 时间步长来运行它（补充图 7C）。
  2. 完成 MDsimulation 后，开始分析模拟，如下所述。
    1. 创建一个作业文件夹并将其保存在 cms 文件中。加载 cms 文件以在 MD 模拟中执行此步骤。
    2. 为项目文件夹创建工作目录并报告能量值。使用 S.I.D. pdf 报告仿真结果（ 如图 3A 所示）和相互作用图和 H 键（ 如图 3B 所示）。
    3. 通过从文件夹浏览来加载 cms 的 pdf 文件，并使用 TIP3P 作为文件量最小化的模型。
    4. 创建溶剂化文件以执行 补充图 7D 中所示的此步骤。通过软件保存 pdf 文件，并分析数据，得到 图 4、 图 5 和 图 6。
  3. 通过创建 resolve 文件生成 MDsimulation 最终确定设置。在边界框中找到结果，如图 7 所示。

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结果

使用噬菌体展示技术，从小鼠 B 细胞杂交瘤系 C3A820,21 产生 scFv 基因抗 EGFR。根据 Chua 等人22，VH 和 VL 结构的单链片段可变 （scFv） 结构模型是分开构建的。之后，模型以使用 RasMol 生产的色带的形式可见。然后，使用分子建模软件，使用合成肽 [Gly4Ser]3 连接单独建模的 VH 和 VL 结构。配体与受体的相互作用以?...

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讨论

EGFR 是乳腺癌的主要靶受体。EGFR 过表达会增加世界各地的乳腺癌病例。同时，单链片段变量等特异性抗体是通过血液循环容易移动且在体内清除率快的抗体。抗体是一种明智的解决方案，也是一种有效的免疫治疗药物37。因此，基于结构的药物设计必须识别专门针对靶受体 （EGFR） 起作用的抑制药物，例如 scFv 抗体。基于 计算机药物 设计，本研?...

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披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

没有。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Autodock softwareCenter for Computational structural Biology AutoDock (scripps.edu)
Desmond Maestro 19.4 software Schrodingerwww.schrodinger.com 
Download Discovery Studio 2021  Dassault Systems https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
Modeler Version 9.24[17] University of Californiahttps://salilab.org/modeller/9.24/release.html
Pictorial database of 3D structures (pdbsum)EMBL-EBI www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/
PyMOL software SchrodingerPyMOL | pymol.org
Pyrx software Sourceforge Download PyRx - Virtual Screening Tool (sourceforge.net)
Python script 3.7.9 shell from the window (64)PythonPython Release Python 3.7.9 | Python.org
SPDBV software Expasyhttp://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html

参考文献

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