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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Auf dieses Vorhersageprotokoll zur Modellierung der Antikörperhomologie folgen das Antikörper-Rezeptor-Pyrx-Docking und die molekulardynamische Simulation. Diese drei primären Methoden werden verwendet, um die genauen Antikörper-Rezeptor-Bindungsbereiche und die Bindungsstabilität der endgültigen Struktur sichtbar zu machen.

Zusammenfassung

Einzelkettige Fragment variable (scFv) Antikörper wurden zuvor aus variablen leichten und schweren Ketten aufgebaut, die durch einen (Gly4-Ser) 3-Linker verbunden waren. Der Linker wurde mit Hilfe einer molekularen Modellierungssoftware als Schleifenstruktur erstellt. Hier stellen wir ein Protokoll für dieIn-silico-Analyse eines vollständigen scFv-Antikörpers vor, der mit dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) interagiert. Die Homologiemodellierung mit Pyrx des Protein-Protein-Dockings und der molekulardynamischen Simulation des interagierenden scFv-Antikörpers und EGFR Zunächst verwendeten die Autoren ein Modellierungsprogramm für die Proteinstruktur und Python für die Homologiemodellierung, und die Antikörper-scFv-Struktur wurde für die Homologie modelliert. Die Forscher luden die Pyrx-Software als Plattform in der Docking-Studie herunter. Die molekulardynamische Simulation wurde mit Hilfe einer Modellierungssoftware durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Proteinmodell die niedrigste Bindungsenergie aufwies, wenn die MD-Simulation einer Energieminimierung unterzogen wurde (-5,4 kcal/M). Darüber hinaus zeigte die MD-Simulation in dieser Studie, dass der angedockte EGFR-scFv-Antikörper für 20-75 ns stabil war, wenn die Bewegung der Struktur stark auf 7,2 Å anstieg. Zusammenfassend wurde eine In-silico-Analysedurchgeführt, und die molekularen Docking- und Molekulardynamik-Simulationen des scFv-Antikörpers bewiesen die Wirksamkeit des entwickelten immuntherapeutischen Medikaments scFv als spezifische medikamentöse Therapie für EGFR.

Einleitung

Konformationsänderungen des Proteins (Ligand und Rezeptor) erfolgen immer auf der Grundlage strukturbasierter Funktionen. Die Untersuchung der möglichen Bindungsrillen des Proteins und die Vorhersage der stabilen Bindungsinteraktion ist eine fortschrittliche Methode, um Arzneimittel für eine bessere Verwendung im menschlichen Körper vorzubereiten. Die Homologiemodellierung, gefolgt von Docking und molekulardynamischer Simulation, ist eine einfache Methode zur genauen Vorhersage stabiler Bindungsinteraktionen zwischen den Resten von Rezeptoren und konstruierten Antikörpern, die als spezifische personalisierte Medizin verwendet werden 1,2. Die vorhergesagte Modellstruktur kann Konformationsänderungen und Umlagerungen in Liganden-Rezeptor-Bindungsstellen, insbesondere an der Antikörper-Rezeptor-Grenzfläche, zeigen. Die Gründe für diese Veränderungen sind vielfältig, wie z.B. die Rotation von Sidechains, der globale Strukturwandel oder komplexere Modifikationen. Der Hauptgrund für die Homologiemodellierung besteht darin, die Tertiärstruktur eines Proteins von seiner Primärstruktur zu unterscheiden 2,3.

Ein Tyrosinkinase-Rezeptor namens epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) spielt viele biologische Rollen in Krebszellen, darunter Apoptose 4,5, Differenzierung 6,7, Zellzyklusprogression 8,9, Entwicklung 9,10 und Transkription11. EGFR ist eines der bekanntesten therapeutischen Ziele für Brustkrebs12. Die Überexpression regulärer Kinaseaktivität wie EGFR führt in der Regel zu einer Progression von Krebszellen, die durch viele Arten von Krebsinhibitoren unterdrückt werden kann13. Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) wurde als Rezeptor für die Variable des einkettigen Fragments verwendet, die speziell konstruiert wurde, um gegen diesen Rezeptor zu wirken. Die vorhergesagte Struktur wurde verwendet, um die Bindungsaktivität des Antikörpers zu testen.

In dieser Arbeit wurde die Struktur des scFv-Antikörpers unter Verwendung einer Modellierungssoftware mit Python-Skript und der Homologie-Modellierungsmethode14,15 modelliert. Aus den Protein- und Aminosäuresequenzen von Rezeptoren und Liganden kann ein Homologiemodell aufgebaut werden16,17. Darüber hinaus wurden fortschrittliche bioinformatische Technologien wie molekulares Andocken eingesetzt, um vorherzusagen, wie niedermolekulare Liganden an die richtige Zielbindungsstelle binden. Das Andocken würde die Entwicklung neuartiger Medikamente ausgleichen, die auf mehrere Krankheiten abzielen. Dabei wird das Bindungsverhalten berücksichtigt 5,18.

Darüber hinaus ist das molekulare Andocken eine wichtige Technik, um die Entwicklung der Liganden-Rezeptor-Bindung zu erleichtern und zu beschleunigen. Molekulares Docking ermöglicht es den Wissenschaftlern, eine Bibliothek von Liganden virtuell gegen ein Zielprotein zu screenen und die Bindungskonformationen und Affinitäten der Liganden zum Zielrezeptorprotein vorherzusagen. Die molekulardynamische Simulation (MNS) zeigt, wie sich die Reste im Raum bewegen, simuliert die Bewegungen der Antikörper zu ihren Rezeptoren und informiert schließlich über die Bemühungen um das Antikörperdesign. Diese Studie ist eine neuartige Vorhersage der Grid-Box-Dimensionen, die darüber entscheidet, wie der scFv-Antikörper an EGFR bindet und die Energie und Zeit dieser Bindung in der MD-Simulation nachweist.

Protokoll

1. Vorhersagen der Sekundärstruktur eines Proteins mit einer Single Chain Fragment Variable (scFv)

  1. Erstellen Sie die 3D-Struktur des scFv-Proteins (Single-Chain Fragment Variable) mit der BLAST-Proteindatenbank (PDB), der KABAT-Nummerierung und der Modellierungssoftware. Das scFv besteht aus einem Linker (Gly4-Ser), der eine variable schwere Kette (VH) und eine variable leichte Kette (VL) verbindet.
  2. Verwenden Sie die molekulare Modellierungssoftware, um den Linker als Schleifenstruktur zu erstellen, und führen Sie alle diese Methoden durch, wie in früheren Studienbeschrieben 2,19,20.

2. Vorlagenauswahl und scFv- und EGFR-3D-Strukturvorhersage und Homologiemodellierung

  1. Wählen Sie die Vorlage 1ivo für EGFR-Strukturen (aufgrund ihrer hohen Auflösung). Laden Sie die Datei 1ivo.pdb von der pdb-Website herunter, wie in Abbildung 1B dargestellt.
  2. Bereiten Sie die Eingabedatei 1ivo.pdb wie unten beschrieben vor.
    1. Entfernen Sie in der Datei 1ivo.pdb alle externen Liganden, indem Sie die pdb.org-Website öffnen und 1ivo auswählen. Struktur und suchen Sie nach dem Namen der Liganden unter dem Titel "small molecule" auf der 1ivo-Strukturseite der pdb-Website.
    2. Suchen Sie den Ligandennamen NAG. Öffnen Sie die von der pdb-Website heruntergeladene Datei 1ivo.pdb und suchen Sie den Terminierungsrest (TER.).
    3. Die Reste der externen Liganden in der 1ivo-Struktur werden gelöscht, beginnend mit dem Rest nach TER und bevor der Rest endet. Speichern Sie die Datei 1ivo.pdb auf dem System.
  3. Bereiten Sie die gespeicherte Datei 1ivo.pdb wie unten beschrieben vor.
    1. Laden Sie die Autodock-Docking-Software (autodock.scripps.edu) aus dem Fensterauswahlbereich herunter. Klicken Sie auf die Datei 1ivo.pdb öffnen.
    2. Verwenden Sie den Befehl Bearbeiten, um Wasserstoff hinzufügen > Hinzufügen auszuwählen, wählen Sie dann Nur Polar aus, und drücken Sie dann OK.
    3. Verwenden Sie den Befehl Bearbeiten, um Kollman-Ladungen hinzuzufügen (Ergänzende Abbildung 1). Verwenden Sie den Befehl Bearbeiten, um Wasser zu löschen. Speichern Sie die Datei 1ivo.pdb auf dem PC.
  4. Minimieren Sie die Energie der Struktur 1ivo.pdb wie unten beschrieben.
    1. Laden Sie SPDBV herunter. Software von http://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html. Öffnen Sie die Datei 1ivo.pdb.
    2. Alles auswählen. Wählen Sie den Befehl Leistungs- > Energieminimierung > Ok (Ergänzende Abbildung 2). Speichern Sie die 1ivo-Datei auf dem PC.
  5. Bereiten Sie das vollständige scFv-Modell mithilfe der Homologiemodellierung vor, wie unten beschrieben.
    1. Laden Sie die Modellierungssoftware17 und das Python-Skript 3.7.9 Shell von Window- 64 herunter. Bewahren Sie die heruntergeladenen Softwaredateien auf Laufwerk D auf.
  6. Bereiten Sie die Eingabedateien wie unten beschrieben vor.
    1. Laden Sie die scFv Pdb-Datei im fasta-Format von der NCBI-Website und benennen Sie die Datei in TARGET.ali um. wie in der ergänzenden Codierungsdatei 1 beschrieben. Wählen Sie die Vorlage mit dem Abschnitt Blast in NCBI aus, fügen Sie die sequenzierte Datei ein, wählen Sie im pdb-Format 7det.pdb aus, wie in Ergänzende Codierungsdatei 2 beschrieben, und senden Sie sie dann. Verwenden Sie dann die pdb.org-Website, um die Vorlagendatei abzurufen.
    2. Bereiten Sie die dritte Eingabedatei als align2d.py (Python) vor, wie in der ergänzenden Codierungsdatei 3 beschrieben, die wie in der ergänzenden Abbildung 3A gezeigt geöffnet wird. Drücken Sie die Option Mehr anzeigen und gehen Sie dann zu Mit IDLE bearbeiten > Mit EDLE bearbeiten (64-Bit). Führen Sie den Vorgang mit dem Befehl run module 5 im align2d.py aus, um zwei Ausgabedateien zu erhalten: Tar- 7det.ali und Tar- 7det.pap.
  7. Führen Sie die vorherigen drei Schritte aus, um den Befehl in der letzten Eingabedatei zu verwenden.
  8. Fügen Sie eine neue Eingabedatei model-single.py (Befehl python file) hinzu, wie in der ergänzenden Codierungsdatei 4 gezeigt und wie unten beschrieben.
    1. Klicken Sie auf die Option Mehr anzeigen und gehen Sie dann zu Mit IDLE bearbeiten > Mit EDLE3.7 (64-Bit) bearbeiten. Führen Sie den Vorgang mit dem Befehl (Modul 5 ausführen) aus, wie in der ergänzenden Abbildung 3B gezeigt.
      HINWEIS: Bei den resultierenden Ausgabedateien handelt es sich um die sechs Dateien der Homologiemodelle, die in der ergänzenden Abbildung 3C gezeigt sind.

3. Vorhersage und Bewertung der Rezeptor-Sekundärstruktur

  1. Ermitteln Sie die Korrektur und Genauigkeit der Homologiemodelle, wie unten beschrieben.
    1. Erstellen Sie den Ramachandran-Plot für die scFv-Modelle und EGFR-Modelle, indem Sie das Visualisierungswerkzeug von https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download herunterladen.
    2. Öffnen Sie die Datei, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie die Anzeigesequenz aus (Ergänzende Abbildung 4). Kopieren Sie die Sequenz und fügen Sie sie www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/ in die Bilddatenbank der 3D-Strukturen (pdbsum) ein.
    3. Wählen Sie Nach Sequenz suchen aus, fügen Sie die Kopie der Sequenz ein, und senden Sie sie dann. Erstellen Sie das Diagramm wie in Abbildung 1B,D gezeigt.

4. Protein-Protein-Docking

  1. Laden Sie die Software für das virtuelle Screening-Tool herunter.
  2. Gehen Sie zu Datei> lesen Sie Moleküle > laden Sie 1ivo.pdb. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Protein im Autodock-Panel, um ein Makromolekül zu erstellen. Klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste, um einen Liganden zu erstellen (Ergänzende Abbildung 5).
  3. Klicken Sie in das Autodock-Fenster, um Protein und dann Ligand auszuwählen.
  4. Öffnen Sie die Proteinliste. Wählen Sie dann aus der Liste scFv-Protein aus.
  5. Gehen Sie zu Auswahlkugeln umschalten. Stellen Sie die Gitterbox auf die Mitte des Rezeptors ein. Klicken Sie auf Vorwärts , wenn die runde rosa Schaltfläche angezeigt wird.
  6. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um die pdbqt-Dateien sowohl für scFv-Antikörper- als auch für EGFR (1ivo)-Strukturen vorzubereiten.
    1. Wechseln Sie zu C Drive > Programme (86) > Benutzer, und wählen Sie dann die Pyrx-Datei aus, die Makromoleküle und Proteinausgabedateien enthält, die als pdbqt-Datei gespeichert wurden.
    2. Speichern Sie dann die pdbqt-Datei mit dem Antikörper single-chain fragment variable (scFv).
  7. Laden Sie die PyMOL-Software bei PyMOL herunter | pymol.org. Verwenden Sie die PyMOL-Software, um die scFv-Antikörper-Rezeptor-EGFR-Konfigurationen anzuzeigen.
    1. Gehen Sie zur Datei und öffnen Sie C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein. Bereiten Sie die Andockkonfigurationen des scFvantikörpers vor, der mit dem Rezeptor in Abbildung 2A interagiert, wie unten beschrieben.
      1. Verwenden Sie die Anzeigeoption, um die (1ivo)-Rezeptordatei als Sequenzreste mit weißem Hintergrund anzuzeigen, wie in der ergänzenden Abbildung 6 gezeigt.
      2. Zeigen Sie die Docking-Konfigurationsdatei mit höherer Auflösung an, um die Ligandenfarbe in grünen und roten Restfarben anzuzeigen. Zeigen Sie die starre Oberfläche des (1ivo)-Rezeptors in gelb an.
  8. Bereiten Sie die Andockkonfigurationen des scFvantikörpers vor, der mit dem Rezeptor in Abbildung 2B interagiert, wie unten beschrieben.
    1. Laden Sie die Docking-Software aus dem Fensterauswahlbereich herunter. Verwenden Sie das Autodock, um die EGFR-Konfigurationen und -Konformationen des scFv-Antikörperrezeptors anzuzeigen.
      1. Wählen Sie im Autodock die Option "Analysieren" aus, und öffnen Sie dann das Ergebnis "Autodock Vina". Gehen Sie zu Datei und öffnen Sie C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein.
      2. Wählen Sie die Proteinrezeptor-PDB-Datei und dann den Bereich der Ligandenkonfiguration (scFv-Antikörperstruktur) aus. Verbinden Sie die starre Oberfläche des Rezeptors mit der Konfiguration der angedockten Struktur und verbergen Sie den Rest des Rezeptors. Verbergen Sie die entfernten Reste des Rezeptors vor den mit dem Liganden verbundenen Resten, wie in Abbildung 2B gezeigt.
    2. Der Protein-Protein-Komplex galt dann als bereit für die Durchführung der MD-Simulation.

5. Molekulardynamische Simulation (MD-Simulation) des EGFR-scFv-Antikörper-Docking-Komplexes

  1. Laden Sie die MD-Simulationssoftware herunter und verwenden Sie sie wie folgt.
    1. Bereiten Sie die PDB-Datei EGFR (1ivo) mit dem Reparaturassistenten vor, wie in der ergänzenden Abbildung 7A dargestellt. Führen Sie den Abschnitt preprocess aus, um die Datei zu verfeinern. Senden Sie die verfeinerte Datei, um sie im Systemgenerator festzulegen.
    2. Laden Sie die Molekulardynamik-Simulationssoftware aus dem Arbeitsverzeichnis. Addieren Sie die Ionen und aktualisieren Sie die verfeinerte Datei auf 20 Å, um den Auftrag zu übermitteln (Tabelle 1), die auch in der ergänzenden Abbildung 7B dargestellt ist.
    3. Laden Sie die EGFR (1ivo) PDB aus der importierten Datei und wählen Sie dann 100 ns Zeitschritte, um sie auszuführen (Ergänzende Abbildung 7C).
  2. Starten Sie die Analyse der Simulation nach Abschluss der MD-Simulation, wie unten beschrieben.
    1. Erstellen Sie einen Job-Ordner und speichern Sie diesen in der CMS-Datei . Laden Sie die CMS-Datei, um diesen Schritt in der MD-Simulation auszuführen.
    2. Erstellen Sie ein Arbeitsverzeichnis für Projektordner und melden Sie die Energiewerte. Verwenden Sie S.I.D. pdf, um die Simulation zu melden, wie in Abbildung 3A gezeigt, und das Wechselwirkungsdiagramm und die H-Bindung, wie in Abbildung 3B dargestellt.
    3. Laden Sie die PDF-Datei von cms, indem Sie aus dem Ordner blättern, und verwenden Sie TIP3P als Modell für die Minimierung des Dateivolumens.
    4. Erstellen Sie die Solvatationsdatei, um diesen Schritt auszuführen, der in der ergänzenden Abbildung 7D dargestellt ist. Speichern Sie die PDF-Datei über die Software und analysieren Sie die Daten, was zu Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6 führt.
  3. Generieren Sie ein MDsimulation-Finalisierungs-Setup, indem Sie die Auflösungsdatei erstellen. Suchen Sie die Ergebnisse im Begrenzungsfeld, wie in Abbildung 7 dargestellt.

Ergebnisse

Mit Hilfe der Phagen-Display-Technologie wurde das scFv-Gen anti-EGFR aus der Maus-B-Zell-Hybridom-Linie C3A820,21 hergestellt. Die Single Chain Fragment Variable (scFv)-Strukturmodelle der VH- und VL-Strukturen wurden laut Chua et al.22 separat erstellt. Danach waren die Modelle als mit RasMol hergestellte Bänder sichtbar. Anschließend wurde mit Hilfe einer molekularen Modellierungssoftware ein syntheti...

Diskussion

EGFR ist der primäre Zielrezeptor von Brustkrebs. EGFR-Überexpression erhöht die Zahl der Brustkrebsfälle weltweit. Spezifische Antikörper wie einkettige Fragmentvariablen sind Antikörper, die sich leicht über den Blutkreislauf bewegen und eine schnelle Clearance-Rate im Körper aufweisen. Antikörper sind eine kluge Lösung und ein wirksames Immuntherapeutikum37. Daher muss im Rahmen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns inhibitorische Arzneimittel wie sc...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Nichts.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Autodock softwareCenter for Computational structural Biology AutoDock (scripps.edu)
Desmond Maestro 19.4 software Schrodingerwww.schrodinger.com 
Download Discovery Studio 2021  Dassault Systems https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
Modeler Version 9.24[17] University of Californiahttps://salilab.org/modeller/9.24/release.html
Pictorial database of 3D structures (pdbsum)EMBL-EBI www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/
PyMOL software SchrodingerPyMOL | pymol.org
Pyrx software Sourceforge Download PyRx - Virtual Screening Tool (sourceforge.net)
Python script 3.7.9 shell from the window (64)PythonPython Release Python 3.7.9 | Python.org
SPDBV software Expasyhttp://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html

Referenzen

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