用于药物开发应用的全人肝培养系统

摘要

最近的技术进步使用于药物代谢和毒性应用的 体外 平台的规模化生产成为可能。全人 2D+ 肝脏系统 （TV2D+） 使用传统的二维培养方法提供生理相关结果。该协议将支持最终用户进行系统的设置、维护和应用。

摘要

为药理学和毒理学研究寻找一种长期的、与人类相关的原代人肝细胞培养模型仍然是一个挑战。目前的 体外 模型平台通常不方便且复杂，随着时间的推移缺乏表型稳定性，并且不支持多个PHH批次，缺乏实验可重复性和灵活性。在这里，我们提供了全人 2D+ 肝脏系统 （TV2D+） 的解冻、铺板和维护的详细方案，该方案利用了标准的二维 （2D） 培养技术和设备，同时保持了寿命和表型稳定性随着时间的推移，通常伴随着更复杂的三维 （3D） 系统。结果显示，TV2D+ 中的附着和可板性百分比与 PHH 接种密度有关，并且在培养物中至少 2 周内具有稳定的功能。评估一系列PHH接种密度，以实现成功的长期培养。如果建立得当，TV2D+ 中的 PHH 会组织成肝细胞集落，表达肝脏特异性标志物，并维持活力、结构完整性以及白蛋白和尿素的生理相关水平。这种独特的属性组合使TV2D+系统成为各种药理学和毒理学应用的合适肝脏模型。

引言

预测治疗安全性和有效性是临床前药物开发的重要组成部分。然而，传统的临床前体外肝脏模型在准确模拟体内肝细胞微环境和保持肝细胞功能和形态方面的能力有限。需要提供稳定代谢能力超过 1 周的模型来评估缓慢周转化合物或研究与亚急性或慢性暴露相关的结果。由于人类肝脏清除机制的转化物种差异，体内动物试验通常无法预测药物疗效和风险¹.目前的体外二维 （2D） 肝脏模型，例如传统的原代人肝细胞 （PHH） 单培养物或夹心培养物，缺乏表型稳定性和培养寿命，导致关键肝细胞功能和结构完整性随时间推移而丧失²。另一种方法涉及形成 3 维 （3D） 肝细胞球体，与 2D 培养相比，提供更相关的微环境。然而，该方法受到原材料可用性、PHH 供体批次选择、可重复性和随着球体尺寸增加而失去活力的限制 ^3,4,5,6。已经引入了多细胞平台，将 PHH 与饲养细胞一起接种到固定大小的微图案板上。尽管这些模型可能支持更长的培养时间，但这些平台中使用的非人饲养细胞可能会改变实验结果并限制其应用，因为先天背景对药物清除和代谢特征的贡献 ^1,7。最近在 Weaver 等人⁸ 中描述的 TruVivo 全人 2D+ 肝脏系统 （TV2D+） 旨在解决 PHH 的传统、共培养和 3D 培养方法的一些局限性。非肝饲养细胞减少了代谢和旁分泌产生的种间差异，并以可重复的、稳健的方式为原代肝细胞提供必要的支持，由于扩增、表型和性能的限制，来自单个供体批次的相应非实质肝细胞无法提供这种支持。选择的饲养细胞能够在使用前持续扩增，并且不需要转化或分化。正如 Glicklis 等人 ⁴ 和 Khetani 等人 ⁵ 所描述的那样，由于供体变异性和保持球状体大小的一致性，肝细胞球体等 3D 培养模型在可重复性方面存在挑战，这会影响大于 200 μm 的球体中的营养扩散，导致活力和功能降低。与 3D 球体形成一样，TV2D+ 系统依赖于 PHH 的自组装;然而，形成的PHH菌落分散在单细胞深度的孔表面积上，而不是压实成单个聚集体。这种培养方法可能有助于解决供体变异性问题，允许 PHH 在各种接种密度下进行铺板、培养并保持基本功能。TV2D+系统还可以提高用户处理的鲁棒性，因为在操作过程中或在3D球体中执行扩展培养所需的专用设备。

TV2D+ 系统将标准 2D 培养物与 3D 系统通常伴随的寿命和表型稳定性相结合。本文描述的方案为在配备标准设备（如生物安全柜、离心机和 CO₂ 培养箱）的实验室中具有基本组织培养技能的用户提供了分步指导。详细概述了该过程的每个步骤，包括培养基制备、解冻、铺板和所得培养系统的维护。该协议还包含一种用于确定基本肝细胞功能输出、白蛋白和尿素的方法，以及用于确定 PHH 附着以进行标准化的免疫荧光图像分析。如果建立得当，TV2D+ 中的 PHH 会组织成肝细胞集落，模仿天然肝脏形态，并在至少 2 周内保持扩展的活力、结构完整性以及白蛋白和尿素的生理相关水平⁸。由于该系统可以允许一系列的 PHH 接种密度，因此它可能有助于增加具有理想供体特征的可板性较低的 PHH 批次的可用性。这种可访问性和功能性的结合使TV2D+成为各种药理学和毒理学应用的合适肝脏模型。

研究方案

该协议遵循 Lifenet Health 伦理委员会的指导方针。该手稿不包含任何作者对人类参与者进行的任何研究或动物研究。所有细胞均从供体组织中分离出来，并完全同意Lifenet Health用于研究目的。

1.培养基制备

1. 在37°C水浴中或在4°C下解冻16-24小时，每个饲养细胞解冻培养基，补充A，补充B和补充C（见 材料表）各一瓶。
2. 将整瓶 （10 mL） 饲养细胞解冻培养基等分装到 15 mL 或 50 mL 锥形管中。
   注意:使用 15 mL 锥形管更容易查看细胞沉淀的大小。
3. 将 4.5 mL 补充剂 B 和 11 mL 补充剂 A 加入一瓶电镀介质 （75 mL）（参见 材料表）中，制成完整的电镀介质。
   注意:完全电镀介质的FBS浓度为<5% v/v。
4. 在单独的瓶子中加入 100 mL 培养基（参见 材料表）、1 mL 添加剂 C 和 14 mL 添加剂 A，制成完整的培养基。
   注:完全培养基的FBS浓度为<1% v / v
5. 将剩余的补充剂C和补充剂A储存在-20°C下，直到第2周培养基制备。
   注意:反复的冻融循环会缩短补充剂的保质期。建议只冻融一次。
6. 使用前，将10mL饲养层细胞解冻培养基，肝细胞解冻培养基，完全铺板培养基和完全培养基在37°C水浴中加热20-30分钟。

2. 解冻、计数和铺板人饲养层细胞（图 1A）

1. 在接种PHH之前培养饲养层细胞约1小时，在37°C水浴中解冻饲养层细胞（参见 材料表）1-2分钟。
   注意:当液体倒置时在冷冻管中变得松散时，通过监测解冻和取出小瓶来避免长时间暴露（例如，>2 分钟）。
2. 解冻后，立即将饲养细胞放在冰上。
3. 使用无菌技术，在生物安全柜 （BSC） 中，将新解冻的细胞加入 10 mL 饲养层细胞解冻培养基中。
4. 使用 1000 μL 移液管用 1 mL 细胞/解冻培养基悬浮液洗涤小瓶一次并收集。
5. 在室温（RT）下以400× g 旋转4分钟。
6. 小心地丢弃上清液，以免通过移液或真空抽吸干扰细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于 1 mL 完全接种培养基中并计数饲养层细胞。
   注意:可以在自动细胞计数器上使用吖啶橙和碘化丙啶 （AOPI） 或使用血细胞计数器对台盼蓝进行饲养层细胞计数。细胞计数可能因技术和用户而异。为获得最佳结果，请对重复样品进行计数，并在所选方法中保持一致。
7. 使用完全接种培养基将细胞悬液稀释至 100,000 个细胞/mL。
8. 将稀释的细胞悬浮液每孔500μL（50,000个细胞）铺在胶原包被的24孔板上（参见 材料表）。
9. 在 N-S 方向上来回运动 2 次，然后以相同的运动 E-W 以北 （N）-南 （S）-东 （E）-西 （W） 运动摇晃板。重复此摇晃方案 2 次，总共 3 轮。
   注意: 使用适度的力进行摇晃，以避免溅到板盖上，同时仍有助于细胞分布（请参阅视频）。
10. 在37°C / 5%CO₂ 下孵育60分钟。
11. 在继续解冻肝细胞之前查看饲养细胞附着。
    注意:可接受的饲养细胞附着在视觉上约为 50% 汇合。

3. 解冻、计数和铺板原代人肝细胞（图 1B）

1. 在饲养层细胞培养30分钟后，通过0.2μm聚醚砜（PES）过滤单元过滤预热的肝细胞解冻培养基。
2. 在37°C水浴中解冻PHHs1-2分钟。
   注意:当液体倒置时在冷冻管中变得松散时，通过监测解冻和取出小瓶来避免长时间暴露（例如，>2 分钟）。
3. 解冻后，立即将PHH放在冰上。
4. 在 BSC 中，将 PHH 悬浮液倒入肝细胞解冻培养基中。
   注意:尽可能避免移液PHH细胞悬浮液。在将解冻的PHH从冷冻管转移到解冻介质的过程中，最关键的是不要进行移液。
5. 使用 1000 μL 移液管洗涤小瓶 3-4 次，将 1 mL 肝细胞/解冻培养基悬浮液轻轻移液回小瓶中，然后将其倒回解冻培养基中收集洗涤液。
6. 盖上盖子并轻轻倒置解冻的PHH悬浮液5次。
7. 在室温下以100× g 旋转8分钟。
8. 小心地丢弃上清液，以免通过移液或真空抽吸干扰细胞沉淀。在锥形管壁上，加入 3 mL 完全电镀介质。
9. 左右摇晃锥形管以重悬细胞沉淀。
10. 向重悬的肝细胞中再加入 5 mL 完全铺板培养基。
11. 计算 PHH。
    注意:PHH可以在自动细胞计数仪上使用AOPI进行计数，也可以使用血细胞计数器使用台盼蓝进行计数。细胞计数可能因技术和用户而异。为获得最佳结果，请对重复样品进行计数，并在所选方法中保持一致。
12. 使用完全接种培养基将细胞悬液稀释至所需的接种密度（300,000-600,000 PHHs/mL）。
    注意:最佳肝细胞接种密度可能因批次而异。给定批次的推荐播种密度将在分析证书 （COA） 中提供。使用以下公式确定 24 孔板的肝细胞/mL。
    
13. 从镀层的补层细胞中，通过移液或真空抽吸除去培养基。
    注意:为确保饲养层细胞的活力，建议一次更换不超过 3 个孔。
14. 立即将稀释的肝细胞悬浮液每孔 500 μL（150,000-300,000 个细胞）铺板到含有饲养细胞的预包被胶原 24 孔板上。
15. 在 NS 方向上来回运动 2 次，然后以相同的运动 E-W 以 N-S-E-W 运动摇晃板。重复此摇晃方案 2 次，总共 3 轮。
    注意: 使用适度的力进行摇晃，以避免溅到板盖上，同时仍有助于细胞分布。
16. 在37°C/5%CO₂ 下孵育2-4小时。对于培养的前 60 分钟，如上面的步骤 3.15 所示，以 N-S-E-W 运动每 15 分钟摇动一次板。
17. 孵育后，将板从培养箱中取出并将其放入 BSC 中。
18. 摇晃板，通过移液或真空吸液除去完整的镀层介质。
    注意:为确保培养物的活力，建议一次更换不超过 3 个孔。
19. 立即向每个孔中加入 500 μL 预热的完全培养基。

4. 维护

1. 将等分试样和预热的完全培养基在37°C水浴中浸泡20-30分钟。 一个24孔板需要约13.5mL培养基。
2. 每天用每孔 500 μL 的新鲜预热完全培养基喂养培养物。
   注意:为确保培养物的活力，建议一次更换不超过 3 个孔。
3. 每 7 天制备一次新鲜的完整培养基。

5. 收集用于测量白蛋白和尿素的培养上清液样品

1. 在第 7、10 和 14 天，将 500 μL 培养基从所需样品孔中收集到微量离心管中，如 图 1C 所示。
2. 将样品在4°C下以320× g 旋转10分钟以沉淀碎片。
3. 使用移液管将样品上清液转移到新的微量离心管中，避免沉淀中断。
4. 在白蛋白和/或尿素测定中运行样品（分别参见第 10 节和第 11 节）。
   注意:样品可以在-20°C至-80°C下储存2周。

6. 染色第一天

注意:固定缓冲液含有多聚甲醛。多聚甲醛会引起眼睛损伤、皮肤刺激和器官毒性。在通风良好的区域工作，并穿戴适当的个人防护装备 （PPE）。

1. 在第 14 天收集培养基样品后，向每个要染色的孔中加入 300 μL 固定缓冲液（参见 材料表），如 图 1C 所示。至少染色 2 个孔。
2. 在4°C孵育20-60分钟。
3. 通过向 45 mL 1x PBS 中加入 5 mL 10x 储备溶液（参见材料表）来制备 1x 透化缓冲液（参见材料表）。
   注意:1x 透化缓冲液可在 4°C 下储存 1 个月。
4. 用 300 μL 1x 透化缓冲液在冰上洗涤 2 次。
5. 加入 300 μL 一抗细胞角蛋白 18（参见 材料表），在冰上的 1x 透化缓冲液中以 1:1000 的稀释度。
   注意:至少，仅将 1x 通透缓冲液孵育一个孔，用于仅二抗对照。
6. 在4°C孵育16-24小时。

7. 染色第二天

1. 第二天，通过移液或真空抽吸去除一抗。
2. 在冰上用每孔 300 μL 的 1x 透化缓冲液洗涤 2 次。
3. 加入 300 μL 荧光二抗（参见 材料表），在 1x 通透缓冲液中以 1:500 的稀释度（包括仅二次对照）。
   注意:使用荧光抗体时避免光线。
4. 在4°C下在黑暗中孵育30-45分钟。
5. 通过移液或真空抽吸去除二抗。
6. 在冰上用每孔 300 μL 的 1x 透化缓冲液洗涤 2 次。
7. 用 300 μL 每孔 1x PBS 洗涤 1 次。
8. 向每个孔中加入150μL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封固剂（参见 材料表），并在室温下在黑暗中孵育15分钟。
   注意:板可以包裹在封口膜中，并在4°C下在黑暗中储存1周。
9. 在荧光显微镜下观察。使用 10 倍物镜为每个孔捕获每个特定荧光通道的 5 张图像（确保一张图像具有比例尺）。
   注意:DAPI 的激发/发射波长为 358 nm/461 nm。使用配备DAPI和荧光团二抗检测滤光片的荧光显微镜。

8. ImageJ分析（图2）

注意:建议使用 ImageJ 版本 1.52a 或更高版本。

1. 在 ImageJ 中打开包含比例尺的图像。单击 "直线 "图标，然后绘制一条线到比例尺的确切长度 [图 2 （1）]
   注意: 如果需要，请单击 放大镜 图标以放大或缩小。
2. 单击 "分析 "选项卡。突出显示并单击 设置比例。
3. 将 "已知距离" 更改为比例尺的距离。 将"长度单位" 更改为比例尺的单位。通过选中 全局应用设置。单击 "确定 "设置比例。
   注意:应用此设置后，打开的每张图像都将以用户输入的单位显示视野的计算面积。
4. 在 ImageJ 中打开仅限 DAPI 的图像。单击 "处理 "选项卡并突出显示" 减去背景"。一次删除背景 50 像素，直到未染色的区域变黑。
   注意:如果图像不包含背景，则不需要此步骤。
5. 单击 "图像 "选项卡并突出显示 "类型"。单击 8 位 使图像灰度 [图 2 （2）]。
6. 手动或自动对图像进行阈值以包含所有DAPI粒子（注意不要手动超过阈值）[图2 （3）]。单击 "图像 "选项卡并突出显示 "调整"。单击 "阈值"。完成后单击 应用 。
7. 单击" 进程 "选项卡并突出显示 "二进制"。单击 分水岭。
8. 单击 "分析 "选项卡并加亮显示/单击 "分析粒子 "[图 2 （4）]。将 大小 设置为 5-无穷大 ，将 圆度 设置为 0.00-1.00。在 显示 下拉选项卡中，选择 大纲。确保选中 "显示结果"、" 汇总"和 "包括孔 "。单击 "确定"。
   注意:如果阈值产生背景像素，则可以调整所需的粒子范围。
9. 将计数结果记录为 TOTAL DAPI。
10. 在 ImageJ 中打开合并的细胞角蛋白 18/DAPI 图像。
11. 使用 多点 [图 2 （5）] 图标手动计数所有未染色的细胞角蛋白 18 DAPI 颗粒。
12. 将结果记录为 FEEDER CELLS。使用下面的公式确定肝细胞 DAPI。
    肝细胞 DAPI = 总 DAPI - 饲养层细胞 DAPI

9. 总附着肝细胞和附着百分比的定量（可电镀性）

1. 使用以下公式为 24 孔培养区域创建比例因子。视场测量值可以在打开的每张图像的顶部找到[图2 （2），绿色框]。
   
2. 使用下面的公式计算附着的肝细胞总数。
   附着的肝细胞 = 肝细胞 DAPI ×比例因子
3. 使用下面的公式计算肝细胞附着的百分比。
   

10. 白蛋白测定

1. 使用夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）（参见 材料表）在以1:200稀释的样品上测量白蛋白的产生。
   注意:为了准确起见，用户确认样品落在标准曲线线性范围内。指定的试剂盒提供执行测定的所有材料和说明。
2. 使用下面的公式将样品浓度归一化到附着的肝细胞。
   

11. 尿素测定

注意:血尿素氮 （BUN） 酸试剂含有硫酸。BUN酸试剂中的硫酸浓度被认为是腐蚀性的。不要摄入。在通风良好的区域工作，并穿戴适当的个人防护装备。

1. 使用改良的二乙酰一肟法测量尿素合成（见 材料表）。
2. 将 53.3 μL 75 mg/dL 尿素稀释到 346.7 μL 完全培养基中，制成标准品 #1 （100 μg/mL）
3. 标记管2-8并使用1:2连续稀释制成尿素测定标准品（表1）。
4. 将 10 μL 样品或标准品加入黑壁透明底部 96 孔板的孔中（参见 材料表）。
5. 向每个含有样品的孔中加入 150 μL BUN 试剂。将 1/3 的 BUN 颜色试剂与 2/3 BUN 酸试剂混合制备 BUN 试剂。使用下面的公式来辅助计算。
   
   BUN 颜色试剂 （mL） = 所需的总 BUN 试剂 × 0.333
   BUN 酸试剂 （mL） = 所需的总 BUN 试剂× 0.667
6. 将板在60°C的烤箱或培养箱中孵育90分钟。
7. 立即读取 540 nm 和 650 nm 处的板吸光度。
8. 通过从所有样品和标准品中减去空白和背景吸光度（650nm）来创建标准曲线。通过线性回归分析生成最佳拟合线。
9. 从标准曲线确定未知样品浓度。
10. 使用下面的公式将样品浓度归一化为附着的肝细胞。
    

结果

肝培养系统的铺板、培养和基本功能测试的总体方法涉及常见的原代细胞培养技术和分析，如 图 1 所示。在第 14 天，使用 ImageJ 分析每孔至少 5 张细胞角蛋白 18 和 DAPI 染色图像计算肝细胞附着和可板性百分比（图 2）。用饲养层细胞培养的PHH的代表性图像如 图3所示。不同肝脏播种密度在播种密度的基础上显示出融合的视觉差异，并在14 d的培养中保持典型的肝脏立方体形态。针对每个测试的接种密度捕获肝细胞供体批次A和B的图像（图4A）。在所有使用的接种密度中，供体B的平均可平板性百分比（89.04%±3.99%，198,552±49,885 PHHs）高于供体A（66.08%±6.67%，146,128±33,063 PHHs）（图4B）。与250,000-300,000 PHHs/孔（62.75%±9.64%）相比，供体A使用150,000 PHHs/孔（76.07%±12.87%）的可电镀性百分比显著更高。供体 B 在肝细胞百分比可板性方面没有显着差异。在最高接种密度（300,000 PHHs/孔）下，供体B的肝细胞可板性最低（85.78%±13.25%）。与供体A类似，150,000 PHHs/孔的接种供体B的肝细胞可板性百分比最高（94.75%±15.07%）。

在 14 天培养期间的三个时间点测量白蛋白生成和尿素合成，并将其标准化为计算的附着肝细胞。总体而言，与供体B相比，供体A的白蛋白产生增加（41.32±4.58μgalb/天/10⁶ PHHs与34.66±10.03μg alb/天/10⁶ PHHs）（图5）。供体A和B的白蛋白产量最高，分别为150,000 PHHs/well、45.91±5.96 μg alb/day/10⁶ PHHs和48.67 ± 20.44 μg alb/day/10⁶ PHHs。在所用的接种密度中，白蛋白的产生没有显著差异。正如 Baudy 等人 ³ 所述，肝脏微生理系统希望保持一致的白蛋白产生和尿素合成，在 14 天的培养过程中变化小于 50%。变异系数 （CV） 的计算方法是将平均值除以第 7、10 和 14 天的标准差。所有样品均重复运行。在 150,000 PHHs/孔的 14 天培养期间，供体 A 的白蛋白输出量 CV 为 12.24%，供体 B 为 37.97%，低于所需的 50% 标准。当以 250,000 和 300,000 PHHs/孔播种时，供体 A 和供体 B 的白蛋白产量存在很大差异。在这些接种密度下，两个供体在培养的第 7、10 和 14 天之间白蛋白产生急剧下降（CV 供体 A 为 22.49%，供体 B 为 45.07%）。

当平均第 7、10 和 14 天 PHH 批次特定数据时，供体 B 尿素合成（95.09 ± 18.91 μg 尿素/天/10⁶）与供体 A（64.92 ± 4.66 μg 尿素/天/10⁶ PHH）相比有所增加（图 6）。供体B（113.49±37.34μg尿素/天/10⁶ PHHs）和供体A（69.12±17.06μg尿素/天/10⁶ PHHs）在14天的培养期内，尿素合成量最大，密度分别为150,000 PHHs/孔和200,000 PHHs/孔。两个供体批次的尿素产量最低，CV最高，为300,000 PHHs/井。在所用的播种密度中，尿素合成没有显著差异。供体A的尿素合成CV最低，培养浓度为250,000 PPHs/孔（23.11%），供体B培养浓度为200,000 PHHs/孔（28.26%）。正如这些结果所强调的，给定批次PHH的最佳接种密度取决于测定时所需的汇合度水平和所测量结果的性质;较高的播种密度可能并不总是与较高的信号或动态范围相关。

图 1:具有饲养层细胞的肝细胞的铺板、培养和功能测试流程图。 （A）将饲养细胞在特定的解冻介质中解冻（见 材料表），重悬于完全的镀层介质中（见 材料表），并计数细胞。将细胞稀释，铺板并在37°C / 5%CO₂下孵育60分钟。（B）将肝细胞在特定的解冻培养基中解冻（见 材料表），重悬于完全的铺板培养基中，并对细胞进行计数。将肝细胞稀释并用饲养细胞接种。将细胞在37°C / 5%CO₂下孵育2-4小时，在培养的前60分钟每15分钟以N-S-E-W运动摇动。用预热的完全培养基代替铺板培养基以维持培养物（参见 材料表）。每天喂食培养物。（C） 在第 7、10 和 14 天，收集培养基样品进行白蛋白和尿素检测。在第14天收集样品后，将细胞固定并在4°C下用细胞角蛋白18（参见 材料表）抗体16-24小时染色。 此外，将它们孵育在适当的二抗中，洗涤并用DAPI封装（参见 材料表）用于捕获和图像分析。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:使用 ImageJ 软件进行图像分析。ImageJ 处理捕获的图像。 第 1 步:根据显微镜特定的比例尺将比例应用于所有图像。第 2 步:更改图像类型。第 3 步:应用阈值限制来选择 DAPI 颗粒。第 4 步:进行颗粒分析，并记录计数。第 5 步:要确定附加的馈线单元数，请使用多点工具对合并的图像进行计数。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3:用饲养层细胞培养的各种肝脏接种密度的形态。 用饲养细胞（50,000 个细胞/孔）培养的 PHH 第 7 天和第 14 天的代表性图像，肝脏接种密度为 150,000、200,000、250,000 和 300,000 PHH/孔。在倒置相差显微镜上使用10倍物镜拍摄图像。比例尺 = 100 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:用饲养层细胞培养的各种肝脏接种密度的荧光免疫细胞化学。 （A） 第 14 天在肝播种密度为 150,000、200,000、250,000 和 300,000 PHHs/孔时细胞角蛋白 18（红色）染色的代表性图像。每个接种密度的两个孔在4°C下固定30分钟。 孔在4°C下用1:1000的一抗孵育16-24小时。在4°C的黑暗中以1:500的比例使用二抗30分钟。在室温下将DAPI（蓝色）核染色剂加入孔中15分钟。在倒置荧光显微镜上使用10倍物镜拍摄图像。比例尺 = 100 μm。 （B） 使用 ImageJ 计算的计算附着肝细胞和各种肝播种密度的可板性百分比。 *p ≤ 0.05，即 200,000、250,000 和 300,000 PHHs/孔的可电镀性百分比。误差线表示标准偏差（每个条件 n ≥ 5 个图像）。 请点击这里查看此图的较大版本.

图5:用饲养层细胞培养的肝细胞产生的白蛋白。 肝播种密度为 150,000、200,000、250,000 和 300,000 PHHs/孔的白蛋白生产。列表示白蛋白/天微克的 14 天平均值，归一化为总附着肝细胞。一条线表示第 7、10 和 14 天之间的 CV。误差线表示标准偏差（每个条件 n ≥ 2 个孔，重复）。 请点击这里查看此图的较大版本.

图6:用饲养层细胞培养的肝细胞的尿素合成。 从150,000、200,000、250,000和300,000 PHHs/孔的肝播种密度合成尿素。列表示 14 天平均值 μg 尿素/天归一化为总附着肝细胞。一条线表示第 7、10 和 14 天之间的 %CV。误差线表示标准偏差（每个条件 n ≥ 2 个孔，重复）。 请点击这里查看此图的较大版本.

标准 （S）#	浓度 （μg/mL）	尿素溶液 （μL）	完全培养物 （μL）
1	100	53.3 75 mg/dL 原液	346.7
2	50	100 （S1 解决方案）	100
3	25	100 （S2 解决方案）	100
4	12.5	100 （S3 解决方案）	100
5	6.26	100 （S4 解决方案）	100
6	3.125	100 （S5 解决方案）	100
7	1.5625	100 （S6 解决方案）	100
空白	0	0	100

表1:尿素标准样品制备。 使用 75 mg/dL 储备尿素，制备 100 μg/mL 尿素溶液。等分试样建议的体积以达到标准曲线的最终浓度。

讨论

所述肝培养系统可以在配备有标准组织培养仪器的实验室中建立。该系统由用饲养层细胞培养的 PHH 组成，允许用户在稳定产生白蛋白和合成尿素的情况下培养 PHH 至少两周。由于 PHH 供体批次的可变性，建议仅将预先筛选和合格的 PHH 用于系统。尽管附着的PHH的数量因供体批次和接种密度而异，但每个供体批次内的相对可板性仍然相似。虽然建议使用推荐的接种密度，但上述数据表明，肝细胞接种密度可以根据不同的实验需求进行调整;然而，应该注意的是，播种更多的PHH可能无法提供更高或更一致的功能输出。对评估的PHH批次的分析显示，使用较低的播种密度（150,000 PHHs/孔）和200,000 PHHs/孔，白蛋白生产和尿素合成的CV最低;然而，在任何接种密度下，白蛋白和尿素之间均未发现显著差异。250,000 PHHs/孔和 300,000 PHHs/孔的较高播种密度表明，在 14 天的培养期内，白蛋白和尿素的减少幅度更大。对于测试的供体批次，在 250,000 PHHs/孔和 300,000 PHHs/孔时，固有的供体可阻变异性可能会影响白蛋白生产和尿素合成的一致性。与大肝细胞球体类似，在 TV2D+ 系统中过度接种 PHH 可能对 PHH 的长期培养和功能产生负面影响。

解冻、铺板和维护的所有步骤对于成功培养和数据生成至关重要;但是，没有经验的用户可以避免几个常见错误。PHH极易受到继发于温度波动、剪切应力和暴露于空气中的损坏^9,10。解冻PHH时应采取预防措施，以避免解冻时间延长和过度移液。使用手动浇注方法、计时器以及立即从水浴转移到冰块将减少这些可能影响 PHH 活力和可电镀性的常见错误。 此外，随着供应链问题变得越来越普遍，可能很难获得胶原蛋白涂层板。使用I型胶原蛋白（5-10μg/cm²）的商业溶液手动涂布组织培养处理的平板可用于克服此问题;但是，为了获得最佳性能和一致性，建议使用预涂胶原蛋白板。在从仅饲养层细胞培养过渡到引入 PHH 的过程中，防止饲养层细胞层干燥至关重要。切勿让空气暴露在进料池中。任何空气暴露时间都可能导致饲养层细胞层质量差，这将对 PHH 的长期培养产生负面影响。最佳做法是在更换培养基之间保留少量残留培养基。有时，PHH可能含有过量的分离碎片，这可能使观察形态变得困难。为了帮助解决这个问题，请在更换介质之前摇晃板并使用真空吸气。最后，在进行培养基更换时，小心吸出用过的培养基，注意不要干扰培养的细胞。将新鲜的培养基体积沿孔侧移液，以避免直接移液到细胞层上。用户还应避免在每次更换介质时暴露在空气中，使用推荐的 3 孔更换（第 3 节和第 4 节）。还应该注意的是，每天更换介质是理想的，但不是必需的。

尽管荧光显微镜在大多数实验室中已经很常见，但执行特定图像分析所需的软件可能会产生额外的费用。ImageJ 可以免费下载，使其成为易于访问的图像分析工具。方案中的步骤提供了用户可能需要优化的基础，特别是DAPI染色的颗粒分析;然而，在缺乏荧光成像能力的情况下，第 14 天的 PHH 附着值在批次特异性分析证书上提供。阈值不足将导致 DAPI 颗粒计数不准确。还建议在设置尺寸排除之前检查单个 DAPI 颗粒的表面积。这可以通过使用椭圆形图标 [图 2 （1），编辑选项卡下方的圆圈图标] 并绘制包含 DAPI 粒子的圆来实现。然后，"分析"选项卡可用于测量所选 DAPI 颗粒的面积。可以使用"分析"选项卡下的"设置测量值"选择特定测量值 [步骤 8.9 和图 2 （4）]。

目前培养PHH的方法涉及使用胶原蛋白-I等涂层来增加传统二维单一培养中的细胞附着¹¹或覆盖细胞外基质，如基于鼠的基质，这种技术通常被称为"三明治培养"12,13,14,15.虽然与传统的单一培养相比，三明治培养技术随着时间的推移改善了PHH的形态和极性，但对于大多数可板块的PHH来说，这两种方法在培养中仍然缺乏长期的表型稳定性。用于培养 PHH 的另一种方法是制作 3D 球体;然而，正如 Glicklis 等人^之前所说4，由于供体的可变性，球体大小的可重复性可能存在技术挑战。为了制作更具生理相关性的肝脏模型，已经开发了多细胞模型。正如 Ware 等人 ⁷ 所描述的，使用微模式，小鼠成纤维细胞和被 PHH 包围的原代人肝窦样内皮细胞能够延长体外培养时间。然而，微图案化可能是一个复杂且耗时的过程，非人类饲养细胞可能有助于代谢信号的背景，从而限制了该平台在某些应用中的实用性。使用各种非肝细胞，包括人和大鼠真皮成纤维细胞和牛主动脉内皮细胞作为肝细胞共培养的饲养细胞，显示出白蛋白分泌和紧密连接形成，类似于肝源性饲养细胞的共培养¹⁶。然而，TV2D+非肝饲养细胞与培养物中PHHs相互作用的机制需要进一步研究，以更好地了解对该系统中PHHs稳定性和功能的影响。Weaver 等人 ⁸ 先前描述的培养系统可以在肝菌落中成功培养 PHH 长达 42 天，形成广泛的胆管网络。在该系统中培养的 PHH 保持关键的肝功能，包括细胞色素 1A2、2B6 和 3A4 活性和基于尿苷 5′-二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶 （UGT） 的酶活性、I 期和 II 期代谢物形成、白蛋白产生和尿素合成在体外至少 22 天，没有基质胶。该培养系统可产生稳定的、与生理相关的输出，可轻松适应任何实验室的药理学和毒理学应用。尽管 TV2D+ 系统中保留了关键的 PHH 功能，但尚未与 3D 椭球体模型进行直接比较;然而，未来在培养系统之间比较相同PHH供体的工作将证明在确定两种方法的局限性和优势方面很有价值。

TV2D+ 的潜在应用包括评估低周转化合物的代谢清除率和药物间相互作用、药物诱导的肝损伤以及农用化学品的风险评估。准确预测新药和新兴药物的肝清除率依赖于稳定和长期的PHH培养，并保留关键的肝细胞功能，这在评估低周转化合物时尤其具有挑战性。此外，风险评估和化学诱导的肝毒性是主要的健康问题，目前的模型无法提供培养的长期稳定性和功能，无法准确评估可能继发于急性暴露的潜在慢性化学毒性。在 TV2D+ 中培养的健康和患病 PHH 在功能和脂质处置方面表现出特征性差异，这些差异会随着时间的推移而保留¹⁷。这些研究支持TV2D+作为各种药理学和毒理学应用的有前途的工具。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm PES  filter unit	Thermo Fisher Scientific	565-0020	User preference
15 mL or 50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	352196 or 352070	User preference
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-21428	Other secondary antibodies can work
Anti-Cytokeratin 18 antibody	abcam	ab24561	Necessary using same dilution
AOPI	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Used for Cellometer counting
Biosafety cabinet	Labconoco	3460801	User preference
Black-walled, clear bottom, 96-well plate	Thermo Fisher Scientific	165305	User preference
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Sorvall X4R	Capable of speeds up to 400 x g
Collagen coated plate, 24-well	Greiner Bio-One	662950	Rat tail collagen coating
Counting slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002	Used for Cellometer counting
Culture medium	LifeNet Health	MED-TCCM
Culture supplement	LifeNet Health	MED-TCSC
DAPI	Thermo Fisher Scientific	00-4959-52	Contains mounting medium
DPBS (-Ca, -Mg)	Thermo Fisher Scientific	14190250	User preference
Feeder cell supplement	LifeNet Health	MED-TCSA
Feeder cell thawing medium	LifeNet Health	MED-FCTM
Fluorescent microscope	Zeiss	AxioObserver Z1	Equipped with user specific filters
Hepatocyte thawing medium	LifeNet Health	MED-HHTM4C-50ML
Human albumin ELISA kit	abcam	ab108788	Necessary if using same dilution
Human feeder cells	LifeNet Health	PHFC24
Humidified incubator	VWR	97025-842	Capable of 5% CO2
IC Fixation buffer	Thermo Fisher Scientific	00-8222-49	Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used
ImageJ	National Insitute of Health	Version 1.52a	1.52a or higher
Inverted phase contrast microscope	Olympus	CK40-F100	User preference
Microcentrifuge tubes	VWR	20170-022	User preference
Micropipettes (various sizes)	USA Scientific	ErgoOne	User preference
Permeabilization buffer (10x)	Thermo Fisher Scientific	00-8333-56	Other permeabilization buffers can work
Plate reader	BMG Labtech	CLARIOstar	Capable of reading absorbance 450-640 nm
Plating medium	LifeNet Health	MED-TCPM
Plating supplement	LifeNet Health	MED-TCSB
Primary human hepatocytes	LifeNet Health	various	Catalog number may vary based on lot number
Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21428	User preference
Serological pipet controller	Gilson	F110120	User preference
Storage bottle 100–500 mL	VWR	76311-770	User preference
Urea Nitrogen (BUN) Test	Stanbio	0580-250
Water bath	PolyScience	WBE05	Capable for use at 37 °C