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摘要

本文将介绍止血血栓形成的穿刺伤口操作方法。形成的血栓很大，直径为数百微米。因此，体积成像方法是合适的。我们建议将蒙太奇广域透射电子显微镜作为许多人可用的高分辨率方法，并详细介绍了制备方案。

摘要

止血是对血管损伤进行正常生理控制的过程，是人类生活的基础。我们都会不时遭受轻微的割伤和刺伤。在止血中，自限性血小板聚集导致形成结构化血栓，其中止血来自从外部封住孔。这种结构的详细表征可能会导致止血和血栓形成之间的区别，血栓形成是血小板过度聚集导致闭塞性凝血的情况。这里提出了一种基于成像的穿刺伤口血栓结构方法，该方法利用薄层电子显微镜的能力来可视化止血血栓的内部。任何基于成像的实验方案中最基本的步骤是良好的样品制备。该协议提供了为小鼠准备穿刺伤口和富含血小板的血栓以进行后续电子显微镜检查的详细程序。给出了形成穿刺伤口血栓的 原位 固定及其后续处理以进行电子显微镜染色和包埋的详细程序。电子显微镜被介绍为末端成像技术，因为它能够在与顺序切片相结合时，以高分辨率可视化血栓内部的细节。作为一种成像方法，电子显微镜提供无偏采样和在 2 或 3 维中从纳米到毫米的实验输出。引用了适当的免费电子显微镜软件，该软件将支持广域电子显微镜，其中数百个框架可以混合，以提供整个穿刺伤口血栓横截面的纳米级成像。因此，图像文件的任何子区域都可以很容易地放入完整横截面的上下文中。

引言

形成穿刺伤口血栓导致止血是生活中最重要的事件之一1。然而，尽管具有这种必要性，但对血栓形成过程中结构变化的了解，无论是在静脉、动脉、动脉粥样硬化事件还是闭塞性凝块中，都受到分辨率和成像深度的限制。与完全形成的穿刺伤口血栓相比，传统的光学显微镜在深度上受到限制，在 Z1 中为 200 至 300 μm，与血小板细胞器的大小及其间距相比，分辨率水平有限，通常小于 30 nm2。双光子光学显微镜可以产生所需的成像深度，但不会显著提高分辨率。光学显微镜的最新进展，例如超分辨率技术，仍然受到分辨率限制，实际上 XY 为 ~20 nm，Z 轴为 20 nm，深度有限，不超过传统光学显微镜。此外，与许多研究用光学显微镜一样，超分辨率光学显微镜基于荧光显微镜，这种技术本质上偏向于一小部分存在良好抗体或良好标记构建体的候选蛋白质3。总之，传统的扫描电子显微镜最多只能看到形成的富含血小板的血栓的表面。

为了克服这些技术限制来表征血栓结构，我们有三个目标。首先，在小鼠静脉或动脉中可重复地产生明确的穿刺伤口，然后可以通过化学固定轻松原位稳定。其次，应用强调膜保存的制备程序，这一目标与定义形成血栓中单个血小板的位置的目标一致。第三，使用无偏倚的可视化技术，在单个图像中，该技术可以在纳米到接近毫米之间缩放。

蒙太奇广域电子显微镜被选为主要的末端可视化技术，原因只有一个:在电子显微镜成像中，人们可以看到细胞内的大量特征，这些特征勾勒出其细胞器和细胞器内的特征。可以识别核糖体等小物体。之所以能看到这一系列特征，是因为用于电子显微镜检查以产生造影剂的电子致密重金属污渍、铀酰、铅和锇与多种分子结合。在电子显微镜图像中，人们可以看到很多存在的东西，而使用免疫荧光和蛋白质标记方法，人们只能看到发光的东西。这意味着，例如，存在于给定的单个蛋白质物种上的抗原位点。对于标记分子（通常是蛋白质），它是该蛋白质所在的位点。所有其他分子都是暗的，没有亮起。然而，这种电子显微镜的选择是否实用？穿刺伤口血栓的尺寸为 300 x 500 μm，像素尺寸为 3 nm，即 100,000 x 167,000 像素的图像。高质量的电子显微镜相机具有 4000 x 4000 像素。这意味着必须拼接/混合大约 1000 帧才能得到单个图像。这是过去 15 年制造的大多数电子显微镜中都存在的可能性。显微镜载物台是计算机化的，图像可以用计算机拼接在一起。这就是导致制定所提出协议的基础选择的基本原理。

总之，我们在下面介绍了一系列步骤，这些步骤在小鼠的静脉或动脉中给出了可重复的伤口，然后，在 原 位固定步骤和后来的包埋步骤之后，可以通过 nm 尺度的蒙标记广域透射电子显微镜和在接近 mm 尺度上可视化的拼接图像，即实际 原位 的尺度固定血栓。这种可扩展性对于理解血栓形成既是血液学/健康学中的一个问题，也是血小板是主要细胞类型的发育生物学系统所必需的。这些进步提供了电子显微镜的一个主要优点，即人们可以看到那里的东西，而不仅仅是发光的东西。有关连续块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 样品制备的详细方案，读者可参考 Joshi 等人最近的一篇文章4。

研究方案

实验由阿肯色大学医学科学研究所动物护理和使用委员会 （IACUC） 审查和批准。在这里，使用了 8 - 12 周龄的野生型雄性和雌性 C57BL/6 小鼠。这些小鼠是脂肪积累很少的年轻成年人。相同的程序适用于对止血很重要的各种蛋白质的小鼠突变体，例如 von Willebrand 因子或血小板糖蛋白 VI （GPVI）5,6。使用的所有设备、手术器械、试剂和其他材料如图 1 所示，并列在材料表中。

1. 颈静脉/股动脉穿刺伤口 1,7

  1. 小鼠麻醉
    1. 将鼠标置于诱导室中，将异氟醚蒸发器调至高流速设置（500 mL/min，3% 异氟醚）。选择异氟醚是因为它对血管直径的影响很小。
      注意:长期接触异氟醚会对健康造成不利影响。使用低流量蒸发器、麻醉气体捕获罐和良好的室内通风可以大大减少暴露。
    2. 当鼠标似乎处于睡眠状态时，捏住鼠标的一个脚趾，看看鼠标是否有反应。如果是这样，请将鼠标放回感应室中几分钟，然后再次尝试捏合测试。如果鼠标没有反应，请将其仰卧在加热板上（之前用铝箔覆盖）。
    3. 将蒸发器调低至低流速（100 mL/min，1.75% 异氟醚）。将鼠标的鼻子放入鼻锥中。伸展每个肢体并用小块胶带向下粘贴。
    4. 插入直肠温度探头，并在温度控制器上将温度设置为 37 °C。用胶带固定温度探头线，以防止探头意外拉出。
  2. 小鼠切口
    1. 使用剪刀剃掉小鼠的颈部和胸部（用于颈静脉）或右腿内侧（用于股动脉）。用酒精垫擦去毛皮屑。如果需要，用理发器再次检查该区域以去除任何剩余的毛皮。
    2. 用新鲜的酒精棉片再次擦拭该区域以清除所有剪报。该区域尽可能干净非常重要。通过捏住脚趾确认手术麻醉平面。
    3. 使用剪刀和钝镊子提起并切开右颈静脉上的皮肤。在皮肤上切一个足够大的圆窗，以暴露颈静脉和一些周围组织。
  3. 清洁颈静脉（同样的原则适用于股动脉）
    1. 使用钝器解剖技术，轻轻推开脂肪和淋巴结以及结缔组织。
      注意:此步骤对容器周围进行一些一般清洁;然而，在颈静脉在多聚甲醛中固定 24 小时后，将在显微镜下进行仔细、彻底的清洁。
    2. 用加热至 37 °C 的生理盐水填充 20 mL 注射器。 将注射器装入注射器输液泵中。将 27G 蝶形针和相关管路连接到注射器上。
    3. 将注射泵设置为 0.5 mL/min 的流速。温和的盐水流会冲走刺破的静脉/动脉中的血液。将盐水流放置在穿刺部位的一侧几毫米处，而不是直接放在穿刺部位上方。
  4. 穿刺颈静脉/股动脉
    1. 启动计时器。获得一根用于颈静脉的 30G 皮下注射针（标称直径 300 μm）和一根用于股动脉的 33G 皮下注射针（直径 200 μm）。对于高压动脉情况，使用较小的针头只能提供略长的出血时间。
    2. 将斜面朝上转动。将针头以 25° 角放置在颈静脉/股动脉上。注意时间。
    3. 快速刺穿血管，确保仅刺穿血管顶部。也要小心不要刺穿容器底部。注意出血完全停止的时间。
    4. 在开始灌注固定之前（即 1、5、10 或 20 分钟以获得血栓形成的不同阶段），等待适当的时间以获得血栓形成（图 2A）。通过放血对动物实施安乐死，或遵循当地机构的安乐死指南。
  5. 进行经心灌注固定
    1. 在手术开始前设置蠕动泵。将两根 50 mL 锥形管放入试管架中。用在二甲胂酸钠缓冲溶液（0.2 M 二甲胂酸钠、0.15 M 氯化钠，pH 7.4）中制备的 4% 多聚甲醛固定液填充一根管，用于颈静脉穿刺研究，并用二甲胂酸钠缓冲溶液填充另一管。
      注:此处详述的条件对于颈静脉的低压情况来说已经足够了，然后针对动脉的高压情况进行了修改。对于动脉（即股动脉）的高压系统研究，多聚甲醛固定剂补充 0.1% 戊二醛，外滴固定与灌注固定相结合。
    2. 将泵管的提升端放入含有缓冲溶液的管中。将 27G 蝶针和相关管路连接到泵管的输出端，然后将针头放入干净的烧杯中。
    3. 将蠕动泵设置为 10 mL/min 的流速。打开灌注泵。
    4. 当缓冲溶液开始从针头流入烧杯时，关闭泵。管子和针头现在已准备好用于经心灌注。
    5. 使用解剖剪刀和钝钳在皮肤上从胸骨顶部到胸骨底部后几毫米处切开中线，露出胸腔。沿着胸腔底部做横向切口，从中线开始，从内侧切开每侧。
    6. 在开始经心灌注之前，立即切开胸腔并反射两侧以露出心脏。
    7. 打开蠕动泵。将 27G 蝶针的尖端放入左心室底部。
    8. 将针头固定在左心室的同时，使用锋利的解剖剪刀在右耳廓上切一条缝，让血液和灌注液流出。记下计时器上的时间。
    9. 用缓冲溶液灌注 3 分钟，以将血液从循环系统中冲出。在仍将针头固定在左心室的同时，关闭蠕动泵，将蠕动泵管的上升端移至含有固定液的 50 mL 管上。
    10. 记下计时器上的时间。再次打开蠕动泵，用固定液灌注 7 分钟。关闭蠕动泵。
    11. 将针头从左心室中取出，放入废烧杯中。将泵管的提升端放入装有蒸馏水的烧杯中。
    12. 打开蠕动泵，让大约 20 mL 的水流过管道，然后将 27G 针头流入废液烧杯中以清洁管道。在关闭泵之前，请务必让所有水从管路和针头中流出。

2. 电子显微镜样品的收集

  1. 在股动脉穿刺伤口的情况下，在灌注固定补充初始 2 分钟外固定剂后，仔细解剖包含穿刺部位和血栓的颈静脉/股动脉部分（图 2A）。用锋利的剪刀，在血管段的远端做一个对角线切口，然后在血管段的近端做一个直线切口。
    注意:以这种方式进行切割有助于稍后确定血管的方向并确定血管中血流的方向。
  2. 将容器段浸入新鲜的室温 4% 多聚甲醛二甲胂酸钠缓冲溶液（0.2 M 二甲胂酸钠、0.15 M 氯化钠，pH 7.4）中，并在室温下放置 1 小时。
  3. 将固定的组织转移至4°C24小时。第二天，取一个 35 毫米的培养皿，其中包含 ~5 毫米厚的硅胶垫（根据制造商的说明提前准备）。将足够的二甲胂酸钠缓冲溶液倒入培养皿中，以浸没固定的静脉段。
  4. 在光学显微镜下观察（~15 倍放大倍率）时，小心地将组织转移到含有缓冲溶液的 35 毫米培养皿中，并使用不锈钢细针和细镊子将容器的每一端固定到硅胶垫上。
  5. 使用一把微型剪刀和非常细的镊子仔细清洁颈静脉/股动脉段。
    1. 仅适用于颈静脉:取下其中一个针，然后用微型剪刀纵向剪断与穿刺/血栓部位相对的血管壁。轻轻打开容器，使用 4 到 5 个针（每个针都用剪线钳切成两半），将其固定在硅胶垫上，腔内侧朝上。
  6. 吸出缓冲溶液，迅速用 1% 多聚甲醛溶液在二甲胂酸钠缓冲溶液中替换，然后盖上培养皿。任何时候都不要让纸巾变干。始终将其浸没在液体中。
  7. 将组织储存在 4 °C，直到需要对其进行电子显微镜检查（图 2B）。处理一些颈静脉/股动脉穿刺伤口样本，通过 SBF-SEM4 成像，其他样本，通过 WA-TEM 8,9 成像。下面详细介绍了 WA-TEM 步骤。
    注意:在化学通风橱中执行所有涉及甲醛、环氧丙烷、OsO4 和 2,4,6-Tris（二甲氨基甲基）苯酚 （DMP-30） 的工作。这些是危险化学品。接触 OsO4 会导致失明和死亡。
    注:所有冲洗和染色体积至少是样品体积的 2 倍。1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 可以替代 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液。在固定过程中，切勿让样品变干，这一点非常重要，因为这会显着影响超微结构。使用聚丙烯管。

3. 蒙太奇广域透射电子显微镜 （WA-TEM） 样品的制备

注意:此步骤代表研究者致力于准备 WA-TEM 的决策点。此制备程序不支持 SBF-SEM。对于 SBF-SEM 体积 EM，所有染色必须在嵌入塑料之前完成。有关 SBF-SEM 制备方案，请参见4 。

  1. 在室温 （RT） 下，用 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 或 PBS 将 35 mm 培养皿中的组织样品洗涤 2 次。保持样品固定，以便通过这些制备步骤跟踪样品的方向。
  2. 用 0.8 mL 0.05% 孔雀石绿/2.5% 戊二醛/0.1 M 二甲胂酸钠 （pH 6.7 - 7.0） 在冰上固定 20 分钟。
  3. 去除固定剂，用 0.1 M 二甲胂酸钠洗涤样品 4 次，每次 5 分钟。去除 0.1 M 二甲胂酸钠。
  4. 用 0.8 mL 的 0.8% K3Fe（CN）6 或 K4Fe（CN）6 / 1.0% OsO4 K3Fe（CN）6 的 0.1 M 二甲胂酸钠溶液进行后固定。在培养皿上盖上盖子以防止光线进入（OsO4 对光敏感）。在 RT 下染色 20 分钟至 1 小时。
  5. 去除 OsO4 并用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗 4 次，每次 5 分钟。去除二甲胂酸钠缓冲液，并在冰上用 1% 单宁酸染色 20 分钟。
  6. 去除单宁酸，用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液 1 次和 2 次洗涤 5 分钟，每次用分子级蒸馏 （DI） 水洗涤 5 分钟。
  7. 用 0.5% 乙酸铀酰 （UA） 染色 1 小时 RT 或在 4 °C 下避光过夜。
  8. 取出乙酸铀酰，用分子级蒸馏水冲洗 5 次，每次 5 分钟。在最后一次洗涤之前，当样品仍浸没在去离子水中时，用剃须刀片切割固定样品周围的硅胶垫。将这一小块硅胶垫从板中取出，放入聚丙烯管中。
    注意:样品在试管中时保持固定在硅胶片上很重要。在此步骤中必须改用聚丙烯管，因为后续步骤中使用的环氧丙烷会降解 35 mm 板的聚苯乙烯。
  9. 去除最后的缓冲液后，用 25% 乙醇短暂冲洗 1 次。弃去 25% 乙醇，与 25% 乙醇在冰上孵育 3 分钟。
  10. 去除 25% 乙醇。用 50% 乙醇短暂冲洗 1 次。弃去 50% 乙醇，与 50% 乙醇在冰上孵育 3 分钟。
  11. 取出 50% 乙醇，用 75% 乙醇短暂冲洗 1 次。弃去 75% 乙醇，与 75% 乙醇在冰上孵育 3 分钟。
  12. 取出 75% 乙醇，用 95% 乙醇短暂冲洗 1 次。弃去 95% 乙醇，与 95% 乙醇在冰上孵育 3 分钟。
  13. 去除 95% 乙醇并用 100% 乙醇（200 标准）洗涤 3 次，每次至少 10 分钟。去除 100% 乙醇并加入环氧丙烷 （PO）。用 PO 冲洗 3 次，每次至少 10 分钟。
  14. 如下所述准备树脂混合物。
    1. 在 60 °C 下加热树脂组分以完全液化。在 60 °C 下，将 12.5 mL 的 Embed-218、7.5 mL 的 Araldite 502 和 27.5 mL 的 DDSA 在 50 mL 试管中充分混合。 该混合物可在 4 °C 下保存 6 个月。 使用前将其加热至 60 °C。使用前分装所需量。
  15. 如下所述嵌入示例。
    1. 将等分试样的树脂混合物放入试管中，加入 20 μL/mL 的 DMP-30 活化剂。在 60 °C 下旋转充分混合;颜色应该变暗。
    2. 在 PO 中将这等分试样的活性树脂稀释 50%，让树脂和 PO 完全混合。
    3. 从含样品的试管中取出最后一次 PO 冲洗液，并用 50% 树脂/PO 混合物替换，几乎完全填满试管。在室温下旋转样品过夜。
    4. 第二天，将新的等分试样树脂（每个样品 1 mL）与 20 μL/mL DMP-30 混合。
  16. 在解剖显微镜（~6 倍放大倍率）下，将样品放入含有样品管中少量 50% 树脂/PO 混合物的聚丙烯培养皿中，然后小心地从组织中取出针钉。仅将组织转移到另一个含有少量 100% 树脂和 DMP-30 活化剂的聚丙烯培养皿中。
  17. 用 DMP-30 活化剂的 100% 树脂填充硅胶包埋模具，然后小心地将样品放入模具中。将模具放入烤箱中，在 60 °C 下烘烤至少 48 小时。制备的样品如图 2B 所示。
  18. 按照10,11 中的描述进行蒙太奇广域透射电子显微镜 （WA-TEM） 成像。参见图 3 描述从初始穿刺到 3 维渲染的 1 分钟血栓的过程。此处不包括蒙太奇 WA-TEM 电子显微镜成像的详细方案，并且超出了当前样品制备方案的范围。
    注意:WA-TEM 是大多数具有计算机化载物台的现代透射电子显微镜中被低估的功能。支持这些功能的共享软件10,11 可从科罗拉多大学博尔德分校的 David Mastronarde 博士（http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/，http://bio3d.colorado.edu/imod/）的小组获得。

结果

药物对穿刺伤口出血时间影响的定量
穿刺伤口出血时间提供了药物风险的生理模型，可以很容易地在小鼠中进行。穿刺伤口实验的结果具有预测性。在这里，我们显示了达比加群剂量反应出血曲线。达比加群是一种凝血酶抑制剂，用作口服直接作用抗凝剂，即所谓的 DOAC12。颈静脉穿刺伤口模型用于评估不同剂量达比加群的固有风险，通?...

讨论

我们提出了一种详细的穿刺伤口程序，用于在颈静脉和股动脉中产生止血血栓、它们的 原位 灌注固定以及蒙太奇广域透射电子显微镜的样品处理。整个程序可用于生成止血血栓以进行超微结构分析和比较实验小鼠的出血时间，例如，用不同类型和剂量的药物治疗的小鼠。它还可用于比较对照野生型小鼠的出血时间与敲除小鼠的出血时间（即，血小板中与粘附配体?...

披露声明

作者与本研究没有利益冲突。

致谢

作者感谢阿肯色大学医学科学研究所（Jerry Ware 和 Sung W. Rhee）、宾夕法尼亚大学（Tim Stalker 和 Lawrence Brass）、肯塔基大学（Sidney W. Whiteheart 和 Smita Joshi）以及美国国立卫生研究院国家生物成像和生物工程研究所（Richard D. Leapman 和 Maria A. Aronova）的同事，我们从他们那里学到了很多东西。作者对美国心脏协会和美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（R01 HL119393、R56 HL119393、R01 155519 BS 以及 NIH 赠款 R01 HL146373 和 R35 HL150818的子奖励）表示感谢，以提供财政支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Normal Saline SolutionMedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein setMedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needlesMedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needlesMedlineNDA26393
50 mL Conical TubesFisher Scientific06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)MedlineMDS090670Z
Aluminum FoilFisher Scientific01-213-100
Animal Heating PlatePhysitemp InstrumentsHP-1M
Araldite GY 502Electron Microscopy Sciences10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy CameraCarl Zeiss Microscopy426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mLMedlineB-D303310Z
Calcium ChlorideFisher ScientificC79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mmCorning Inc.430165
Cotton Tipped ApplicatorsMedlineMDS202055H
DMP-30 ActivatorElectron Microscopy Sciences13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSAElectron Microscopy Sciences13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tippedIntegra Miltex6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serratedIntegra Miltex6-6
EMBED 812 ResinElectron Microscopy Sciences14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proofElectron Microscopy Sciences15055
Fisherbrand 4-Way Tube RackFisher Scientific03-448-17
Fisherbrand Digital TimerFisher Scientific14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion PumpFisher Scientific7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 PlyMedlineNON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)Electron Microscopy Sciences16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mLMedline66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5FIntegra Miltex17-305Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 FtVWRMFLX96410-15
L-Aspartic AcidFisher ScientificBP374-100
Lead NitrateFisher ScientificL-62
Malachite Green 4Electron Microscopy Sciences18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump HeadVWRMFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital DriveVWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire CuttersFisher Scientific50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences19150
Paraformaldehyde (16% Solution)Electron Microscopy Sciences15710
Physitemp Temperature ControllerPhysitemp InstrumentsTCAT-2LV
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP-8131
Propylene Oxide, ACS ReagentElectron Microscopy Sciences20401
Pyrex Glass BeakersFisher Scientific02-555-25B
Rectal Temperature Probe for MicePhysitemp InstrumentsRET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"3M Company305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4Electron Microscopy Sciences11623
SomnoFlo Low Flow Electronic VaporizerKent ScientificSF-01
SomnoFlo Starter Kit for MiceKent ScientificSF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien PinsFine Science Tools26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12Carl Zeiss Microscopy495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone ElastomerWorld Precision InstrumentsSYLG184silicone mat
Tannic AcidElectron Microscopy Sciences21700
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma-Aldrich88535
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400
Vannas Spring Micro ScissorsFine Science Tools15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, SerratedIntegra Miltex18-818Need 2 pairs.
Wagner ScissorsFine Science Tools14068-12
Wahl MiniFigura Animal TrimmerBraintree ScientificCLP-9868
Zen Lite SoftwareCarl Zeiss Microscopy410135-1001-000

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