Hemostasia de Ferida por Punção e Preparação de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica de Área Larga Montada

Resumo

Um procedimento de punção para formação de trombo hemostático é apresentado aqui. Os trombos formados são grandes e têm centenas de mícrons de diâmetro. Portanto, as abordagens de imagem de volume são apropriadas. Sugerimos microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada como uma abordagem de alta resolução disponível para muitos e detalhamos um protocolo preparativo.

Resumo

A hemostasia, o processo de controle fisiológico normal do dano vascular, é fundamental para a vida humana. Todos nós sofremos pequenos cortes e perfurações de vez em quando. Na hemostasia, a agregação plaquetária autolimitada leva à formação de um trombo estruturado no qual a cessação do sangramento vem do fechamento do orifício pelo lado de fora. A caracterização detalhada dessa estrutura poderia levar a distinções entre hemostasia e trombose, um caso de agregação plaquetária excessiva levando à coagulação oclusiva. Uma abordagem baseada em imagem para a estrutura do trombo da ferida por punção é apresentada aqui, que se baseia na capacidade da microscopia eletrônica de seção fina de visualizar o interior dos trombos hemostáticos. A etapa mais básica em qualquer protocolo experimental baseado em imagem é uma boa preparação da amostra. O protocolo fornece procedimentos detalhados para a preparação de feridas por punção e trombos ricos em plaquetas em camundongos para microscopia eletrônica subsequente. Um procedimento detalhado é fornecido para a fixação in situ do trombo da ferida de punção em formação e seu processamento subsequente para coloração e incorporação para microscopia eletrônica. A microscopia eletrônica é apresentada como a técnica de imagem final devido à sua capacidade, quando combinada com o seccionamento sequencial, de visualizar os detalhes do interior do trombo em alta resolução. Como método de imagem, a microscopia eletrônica fornece amostragem imparcial e uma saída experimental que escala de nanômetros a milímetros em 2 ou 3 dimensões. É citado um software de microscopia eletrônica freeware apropriado que suportará microscopia eletrônica de área ampla, na qual centenas de quadros podem ser combinados para fornecer imagens em escala nanométrica de seções transversais inteiras de trombos de feridas de punção. Assim, qualquer sub-região do arquivo de imagem pode ser facilmente colocada no contexto da seção transversal completa.

Introdução

A formação de um trombo de punção que leva à cessação do sangramento é um dos eventos mais essenciais da vida¹. No entanto, apesar dessa essencialidade, o conhecimento do que ocorre estruturalmente durante a formação do trombo, seja em uma veia, uma artéria, um evento aterosclerótico ou um coágulo oclusivo, tem sido limitado pela resolução e profundidade da imagem. A microscopia óptica convencional é limitada em profundidade quando comparada a um trombo de ferida por punção totalmente formado, 200 a 300 μm em Z¹, e em nível de resolução quando comparada ao tamanho das organelas plaquetárias e seu espaçamento, geralmente inferior a 30 nm². A microscopia de luz de dois fótons pode produzir a profundidade necessária de imagem, mas não melhora significativamente a resolução. Os avanços mais recentes na microscopia de luz, por exemplo, técnicas de super-resolução, ainda são limitados pela resolução, na prática ~ 20 nm em XY e duas vezes isso em Z, e limitados em profundidade, não mais do que a microscopia de luz convencional. Além disso, a microscopia de luz de super-resolução, como grande parte da microscopia de luz de pesquisa, é baseada na microscopia de fluorescência, uma técnica que é inerentemente tendenciosa para um pequeno conjunto de proteínas candidatas para as quais existem bons anticorpos ou boas construções marcadas³. Em conclusão, a microscopia eletrônica de varredura convencional pode, no máximo, visualizar a superfície do trombo rico em plaquetas em formação.

Para superar essas limitações técnicas para caracterizar a estrutura do trombo, tivemos três objetivos. Primeiro, produza de forma reprodutível uma ferida de punção definida em uma veia ou artéria de camundongo que possa ser prontamente estabilizada in situ por fixação química. Em segundo lugar, aplique um procedimento preparativo que enfatize a preservação da membrana, um objetivo consistente com o objetivo de definir a posição das plaquetas individuais dentro do trombo em formação. Terceiro, use uma técnica de visualização imparcial que, em uma única imagem, possa ser dimensionada entre nanômetros e quase milímetros.

A microscopia eletrônica montada de área ampla foi escolhida como uma das principais técnicas de visualização final por um único motivo importante: na imagem de microscópio eletrônico, vê-se uma vasta gama de características dentro de uma célula que delineia suas organelas e características dentro das organelas. Pequenos objetos, como ribossomos, podem ser reconhecidos. Essa gama de recursos é vista porque as manchas de metais pesados densos em elétrons, uranila, chumbo e ósmio, que são usadas para microscopia eletrônica para produzir contraste, ligam-se a uma ampla gama de moléculas. Em uma imagem de microscópio eletrônico, vê-se muito do que está lá, enquanto com as abordagens de imunofluorescência e marcação de proteínas, vê-se apenas o que acende. Isso significa, por exemplo, os locais de antígeno presentes em uma determinada espécie de proteína individual. No caso de uma molécula marcada, geralmente uma proteína, é o(s) local(is) onde essa proteína está. Todas as outras moléculas são escuras e não iluminadas. No entanto, essa escolha de microscopia eletrônica é prática? Um trombo de ferida por punção tem um tamanho de 300 por 500 μm e, com um tamanho de pixel de 3 nm, é uma imagem de 100.000 por 167.000 pixels. Uma câmera de microscópio eletrônico de alta qualidade tem 4000 por 4000 pixels. Isso significa que aproximadamente 1000 quadros devem ser costurados/misturados para fornecer uma única imagem. Essa é uma possibilidade que está presente na maioria dos microscópios eletrônicos fabricados nos últimos 15 anos. A platina do microscópio é computadorizada e as imagens podem ser costuradas com um computador. Essa é a lógica que levou às escolhas subjacentes à formulação do protocolo apresentado.

Conclusivamente, apresentamos abaixo uma série de etapas que fornecem uma ferida reprodutível na veia ou artéria de camundongos que, em seguida, seguindo as etapas de fixação in situ e as etapas de incorporação posteriores, podem ser visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada em escala nm e na imagem costurada visualizada em escala próxima de mm, a escala do in situ real trombo fixo. Escalabilidade desse tipo é necessária para entender a formação de trombos como um problema em hematologia / saúde e como um sistema de biologia do desenvolvimento no qual as plaquetas são o principal tipo de célula. Esses avanços oferecem uma grande virtude da microscopia eletrônica, ou seja, vê-se o que está lá, não apenas o que acende. Para um protocolo detalhado sobre a preparação de amostras para microscopia eletrônica de varredura facial em bloco serial (SBF-SEM), o leitor é direcionado para um artigo recente de Joshi et ^al.4.

Protocolo

Os experimentos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas. Aqui, foram usados camundongos C57BL / 6 machos e fêmeas do tipo selvagem de 8 a 12 semanas de idade. Esses camundongos são adultos jovens com pouco acúmulo de gordura. Os mesmos procedimentos são aplicáveis a mutantes de camundongos para várias proteínas importantes para a hemostasia, como o fator de von Willebrand ou a glicoproteína plaquetária VI (GPVI)^5,6. Todos os equipamentos, instrumentos cirúrgicos, reagentes e outros materiais utilizados são mostrados na Figura 1 e listados na Tabela de Materiais.

1. Ferida de punção da veia jugular/artéria femoral ^1,7

1. Anestesia do mouse
   1. Coloque o mouse na câmara de indução e gire o vaporizador de isoflurano para uma configuração de alta taxa de fluxo (500 mL / min, 3% de isoflurano). O isoflurano é escolhido porque tem pouco efeito no diâmetro dos vasos sanguíneos.
      CUIDADO: A exposição prolongada ao isoflurano pode causar efeitos adversos à saúde. O uso de um vaporizador de baixo fluxo, recipientes de captura de gás anestésico e boa ventilação ambiente podem reduzir bastante a exposição.
   2. Quando o mouse parecer adormecido, aperte um dos dedos do mouse para ver se o mouse reage. Nesse caso, coloque o mouse de volta na câmara de indução por alguns minutos e tente o teste de pinça novamente. Se o mouse não reagir, coloque-o em decúbito dorsal na placa de aquecimento (previamente coberta com papel alumínio).
   3. Abaixe o vaporizador para uma taxa de fluxo baixa (100 mL/min, 1,75% de isoflurano). Coloque o nariz do mouse no cone do nariz. Estenda cada membro e prenda com fita adesiva pequenos pedaços.
   4. Insira a sonda de temperatura retal e ajuste a temperatura para 37 °C no controlador de temperatura. Prenda o cabo da sonda de temperatura com fita adesiva para evitar que a sonda seja puxada acidentalmente.
2. Incisão no rato
   1. Usando o aparador, raspe o pescoço e o peito do camundongo (para a veia jugular) ou a parte interna da perna direita (para a artéria femoral). Limpe as aparas de pele com uma compressa com álcool. Se necessário, passe por cima da área novamente com a tesoura para remover qualquer pelo restante.
   2. Limpe a área novamente com uma compressa com álcool para limpar todos os recortes. É muito importante que a área esteja o mais limpa possível. Confirme o plano cirúrgico da anestesia por meio de uma pinça no dedo do pé.
   3. Usando uma tesoura e uma pinça romba, levante e corte a pele sobre a veia jugular direita. Corte uma janela redonda na pele grande o suficiente para expor a veia jugular e parte do tecido circundante.
3. Limpeza da veia jugular (os mesmos princípios se aplicam à artéria femoral)
   1. Usando a técnica de dissecção romba, afaste suavemente os gânglios adiposos e linfáticos, bem como o tecido conjuntivo.
      NOTA: Alguma limpeza geral ao redor do vaso ocorre nesta etapa; No entanto, uma limpeza cuidadosa e completa ocorrerá sob o microscópio depois que a veia jugular for fixada em paraformaldeído por 24 horas.
   2. Encha uma seringa de 20 ml com solução salina normal aquecida a 37 °C. Coloque a seringa na bomba de perfusão da seringa. Conecte a agulha borboleta 27G e o tubo associado à seringa.
   3. Defina a bomba de seringa para uma vazão de 0.5 mL/min. O fluxo suave de solução salina lavará o sangue da veia/artéria perfurada. Posicione o fluxo de solução salina alguns mm ao lado do local da punção, não diretamente sobre ele.
4. Punção da veia jugular/artéria femoral
   1. Inicie o cronômetro. Obtenha uma agulha hipodérmica 30G (diâmetro nominal de 300 μm) para a veia jugular e uma agulha hipodérmica 33G (diâmetro de 200 μm) para a artéria femoral. O uso de uma agulha menor fornece apenas um tempo de sangramento um pouco mais longo para a situação arterial de pressão mais alta.
   2. Vire o chanfro para cima. Posicione a agulha em um ângulo de 25° sobre a veia jugular/artéria femoral. Observe a hora.
   3. Perfure rapidamente o recipiente, certificando-se de perfurar apenas a parte superior do recipiente. Tenha cuidado para não perfurar o fundo do vaso também. Observe o momento em que o sangramento para completamente.
   4. Aguarde o tempo adequado para obter a formação de trombos (Figura 2A) antes de iniciar a fixação da perfusão (ou seja, 1, 5, 10 ou 20 minutos para obter diferentes estágios de desenvolvimento do trombo). Eutanásia do animal por exsanguinação ou siga as diretrizes institucionais locais para a eutanásia.
5. Realização da fixação da perfusão transcárdica
   1. Configure a bomba peristáltica antes do início da cirurgia. Coloque dois tubos cônicos de 50 mL em um rack de tubos de ensaio. Encha um tubo com solução fixadora de paraformaldeído a 4% preparada em solução tampão de cacodilato de sódio (cacodilato de sódio 0,2 M, cloreto de sódio 0,15 M em pH 7,4) para estudos de punção jugular e encha o outro tubo com solução tampão de cacodilato de sódio.
      NOTA: As condições detalhadas aqui são suficientes para o caso de baixa pressão da jugular e são então modificadas para o caso de alta pressão de uma artéria. Para os estudos do sistema de alta pressão com artérias, ou seja, a artéria femoral, o fixador de paraformaldeído é complementado com glutaraldeído a 0,1% e a fixação por gotejamento externo é combinada com fixação de perfusão.
   2. Coloque a extremidade de captação da tubulação da bomba no tubo que contém a solução tampão. Conecte uma agulha borboleta 27G com tubulação associada à extremidade de saída da tubulação da bomba e coloque a agulha em um béquer limpo.
   3. Defina a bomba peristáltica para uma vazão de 10 mL/min. Ligue a bomba de perfusão.
   4. Quando a solução tampão começar a fluir da agulha para o copo, desligue a bomba. O tubo e a agulha estão agora preparados para a perfusão transcárdica.
   5. Exponha a cavidade torácica fazendo um corte na linha média na pele da parte superior do esterno até alguns milímetros após a parte inferior do esterno usando uma tesoura de dissecação e uma pinça romba. Faça incisões transversais ao longo da base da caixa torácica, começando na linha média e cortando de medial para lateral de cada lado.
   6. Imediatamente antes de iniciar a perfusão transcárdica, abra rapidamente a caixa torácica e reflita cada lado para expor o coração.
   7. Ligue a bomba peristáltica. Coloque a ponta da agulha borboleta 27G na base do ventrículo esquerdo.
   8. Enquanto segura a agulha segura no ventrículo esquerdo, faça uma fenda na aurícula direita usando uma tesoura de dissecação afiada para permitir que o sangue e o fluido de perfusão fluam. Anote a hora no cronômetro.
   9. Perfundir com solução tampão por 3 min para eliminar o sangue do sistema circulatório. Enquanto ainda segura a agulha segura no ventrículo esquerdo, desligue a bomba peristáltica e mova a extremidade de captação do tubo da bomba peristáltica para o tubo de 50 mL que contém a solução fixadora.
   10. Anote a hora no cronômetro. Ligue novamente a bomba peristáltica e perfunda com a solução fixadora por 7 min. Desligue a bomba peristáltica.
   11. Retire a agulha do ventrículo esquerdo e coloque-a em um copo de resíduos. Coloque a extremidade de captação da tubulação da bomba em um copo de água destilada.
   12. Ligue a bomba peristáltica e deixe fluir aproximadamente 20 mL de água através da tubulação e sair a agulha 27G para o copo de resíduos para limpar a tubulação. Certifique-se de deixar toda a água sair da tubulação e da agulha antes de desligar a bomba.

2. Coleta de amostras para microscopia eletrônica

1. Após a fixação da perfusão complementada com um fixador externo inicial de 2 min no caso de feridas de punção da artéria femoral, dissecar cuidadosamente a porção da veia jugular/artéria femoral que contém o local da punção e o trombo (Figura 2A). Com uma tesoura afiada, faça um corte diagonal na extremidade distal do segmento do vaso e faça um corte reto na extremidade proximal do segmento do vaso.
   NOTA: Fazer cortes dessa maneira ajuda a orientar o vaso mais tarde e a identificar a direção do fluxo sanguíneo no vaso.
2. Mergulhe o segmento do recipiente em paraformaldeído fresco à temperatura ambiente a 4% em solução tampão de cacodilato de sódio (cacodilato de sódio 0,2 M, cloreto de sódio 0,15 M a pH 7,4) e coloque em temperatura ambiente por 1 h.
3. Transferir o tecido fixo para 4 °C durante 24 h. No dia seguinte, pegue uma placa de cultura de 35 mm contendo um tapete de silicone de ~ 5 mm de espessura (preparado com antecedência de acordo com as instruções do fabricante). Despeje uma solução tampão de cacodilato de sódio suficiente no prato para submergir o segmento da veia fixa.
4. Durante a visualização sob um microscópio óptico (ampliação de ~ 15x), transfira cuidadosamente o tecido para o prato de 35 mm contendo a solução tampão e prenda cada extremidade do vaso no tapete de silicone usando pinos de minúcia de aço inoxidável e pinças finas.
5. Limpe cuidadosamente o segmento da veia jugular/artéria femoral usando uma microtesoura e uma pinça muito fina.
   1. Apenas para veia jugular: Remova um dos pinos e, usando a microtesoura, corte longitudinalmente a parede do vaso oposta ao local da punção/trombo. Abra suavemente o recipiente e, usando 4 a 5 pinos (cada um cortado ao meio com um alicate), prenda-o no tapete de silicone com o lado intraluminal voltado para cima.
6. Aspire a solução tampão, substitua-a rapidamente por uma solução de paraformaldeído a 1% em solução tampão de cacodilato de sódio e tampe o prato. Não deixe o tecido secar em nenhum momento. Mantenha-o sempre submerso em fluido.
7. Armazenar o tecido a 4 °C até ao momento de o processar para microscopia electrónica (figura 2B). Processar algumas amostras de feridas de punção da veia jugular/artéria femoral para imagem por SBF-SEM⁴ e outras para imagem por WA-TEM ^8,9. As etapas WA-TEM são descritas em detalhes abaixo.
   CUIDADO: Realize todos os trabalhos envolvendo formaldeído, óxido de propileno, OsO₄ e 2,4,6-Tris(dimetilaminometil)fenol (DMP-30) em uma capela de exaustão química. Estes são produtos químicos perigosos. A exposição ao OsO₄ pode causar cegueira e morte.
   NOTA: Todos os volumes de enxágue e mancha são pelo menos 2x o volume da amostra. A solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pode ser substituída pelo tampão cacodilato de sódio 0,1 M. Durante o procedimento de fixação, é muito importante nunca deixar as amostras secarem, pois isso afetaria significativamente a ultraestrutura. Use tubos de polipropileno.

3. Preparação da amostra para microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada (WA-TEM)

NOTA: Esta etapa representa um ponto de decisão no qual o investigador está se comprometendo a se preparar para o WA-TEM. Este procedimento preparativo não suporta SBF-SEM. Para o volume EM de SBF-SEM, toda a coloração deve ser feita antes de ser incorporada em plástico. Consulte⁴ para obter um protocolo de preparação SBF-SEM.

1. Lave a amostra de tecido no prato de 35 mm 2x com solução salina balanceada de Hank (HBSS) ou PBS em temperatura ambiente (RT). Mantenha a amostra fixada, permitindo rastrear a orientação da amostra por meio dessas etapas preparativas.
2. Fixe com 0,8 mL de 0,05% de verde malaquita / 2,5% de glutaraldeído / 0,1 M de cacodilato de sódio (pH 6,7 - 7,0) por 20 min no gelo.
3. Remova o fixador e lave a amostra 4x por 5 min cada com cacodilato de sódio 0,1 M. Remova o cacodilato de sódio 0,1 M.
4. Sufixo com 0,8 mL de 0,8% K₃Fe(CN)₆ ou K₄Fe(CN)₆ / 1,0% OsO₄ K₃Fe(CN)₆ em 0,1 M de cacodilato de sódio. Coloque uma tampa sobre o prato para manter a luz do lado de fora (OsO₄ é sensível à luz). Manchar por 20 min a 1 h em RT.
5. Remova o OsO₄ e enxágue 4x por 5 min cada com tampão de cacodilato de sódio 0,1 M. Remova o tampão de cacodilato de sódio e core com ácido tânico a 1% por 20 min no gelo.
6. Remova o ácido tânico e lave por 5 min com tampão de cacodilato de sódio 0.1 M 1x e 2x por 5 min cada com água destilada de grau molecular (DI).
7. Corar com acetato de uranilo (UA) a 0,5% durante 1 h RT ou durante a noite a 4 °C no escuro.
8. Remova o acetato de uranila e enxágue 5x por 5 min cada com água destilada de grau molecular. Antes da última lavagem e enquanto a amostra ainda estiver submersa em água DI, corte o tapete de silicone ao redor da amostra fixada com uma lâmina de barbear. Levante este pequeno pedaço de tapete de silicone da placa e coloque-o em um tubo de polipropileno.
   NOTA: É importante que a amostra permaneça presa à peça de silicone enquanto estiver no tubo. A mudança para tubos de polipropileno nesta etapa é necessária porque o óxido de propileno usado nas etapas subsequentes degradará o poliestireno das placas de 35 mm.
9. Após remover o último tampão, enxágue brevemente 1x com etanol a 25%. Descarte o etanol a 25% e incube com etanol a 25% por 3 min no gelo.
10. Remova o etanol a 25%. Enxágue brevemente 1x com etanol a 50%. Descarte o etanol a 50% e incube com etanol a 50% por 3 min no gelo.
11. Remova o etanol a 50% e enxágue brevemente 1x com etanol a 75%. Descarte o etanol 75% e incube com etanol 75% por 3 min no gelo.
12. Remova o etanol a 75% e enxágue brevemente 1x com etanol a 95%. Descarte o etanol a 95% e incube com etanol a 95% por 3 min no gelo.
13. Retire o etanol a 95% e lave 3x, pelo menos 10 min de cada vez, com etanol a 100% (prova 200). Remova o etanol 100% e adicione óxido de propileno (PO). Enxágue 3x pelo menos 10 min cada, com PO.
14. Prepare a mistura de resina conforme descrito abaixo.
    1. Aqueça os componentes de resina a 60 °C para liquefazer totalmente. Misture bem 12,5 mL de Embed-218, 7,5 mL de Araldite 502 e 27,5 mL de DDSA em um tubo de 50 mL a 60 ° C. Esta mistura pode ser conservada durante 6 meses a 4 °C. Aqueça-o a 60 °C antes de usar. Alíquota a quantidade necessária antes do uso.
15. Incorpore os exemplos conforme descrito abaixo.
    1. Coloque uma alíquota da mistura de resina em um tubo e adicione 20 μL / mL de ativador DMP-30. Misturar bem rodando a 60 °C; a cor deve escurecer.
    2. Diluir esta alíquota de resina activada em 50% em PO e deixar que a resina e o PO se misturem completamente.
    3. Remova o último enxágue PO do sample contendo tubo e substitua-o pela mistura de 50% de resina / PO, quase enchendo o tubo completamente. Gire a amostra durante a noite em temperatura ambiente.
    4. No dia seguinte, misture uma nova alíquota de resina (1 mL por amostra) com 20 μL/mL de DMP-30.
16. Coloque a amostra em um prato de polipropileno com um pequeno volume de mistura de resina / PO a 50% do tubo de amostra sob um microscópio de dissecação (ampliação de ~ 6x) e retire cuidadosamente os pinos do tecido. Transfira apenas o tecido para outra placa de polipropileno contendo uma pequena quantidade de resina 100% com um ativador DMP-30.
17. Encha um molde de incorporação de silicone com a resina 100% com o ativador DMP-30 e coloque cuidadosamente a amostra no molde. Coloque o molde no forno e leve ao forno a 60 °C por pelo menos 48 h. A amostra preparada é mostrada na Figura 2B.
18. Realize imagens de microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada (WA-TEM) conforme descrito em^10,11. Veja a Figura 3 para uma representação do processo que vai de uma punção inicial a um trombo de 1 minuto renderizado tridimensionalmente. A inclusão de um protocolo detalhado para imagens de microscopia eletrônica WA-TEM montada não está incluída aqui e está além do escopo dos presentes protocolos de preparação de amostras.
    NOTA: WA-TEM é uma capacidade subestimada da maioria dos microscópios eletrônicos de transmissão modernos com platina computadorizada. O software shareware que suporta essas funções^10,11 está disponível no grupo do Dr. David Mastronarde, da Universidade do Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Resultados

Quantificação dos efeitos da droga no tempo de sangramento da ferida perfurocortante
Os tempos de sangramento da ferida por punção fornecem um modelo fisiológico de risco de droga que pode ser prontamente realizado em camundongos. Os resultados que vêm de um experimento de ferida de punção são preditivos. Aqui, mostramos uma curva de sangramento dose-resposta do dabigatrano. A dabigatrana, um inibidor da trombina, é usada como anticoagulante oral de ação d...

Discussão

Apresentamos um procedimento detalhado de punção para produção de trombos hemostáticos em veias jugulares e artérias femorais, sua fixação de perfusão in situ e processamento de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada. Os procedimentos gerais são úteis para gerar trombos hemostáticos para análise ultraestrutural e para comparar tempos de sangramento em camundongos experimentais, por exemplo, camundongos tratados com diferentes ti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000