流细胞学和荧光活化细胞分拣（FACS）:血性B淋巴细胞的分离

1. 准备

1. 开始之前，戴上实验室手套和适当的防护服。
2. 消毒所有解剖工具，首先用洗涤剂，然后用70%乙醇，然后彻底干燥。
3. 准备50mL的汉克平衡盐溶液（HBSS），含有2%的胎儿小牛血清（FCS）。

2. 解剖

1. 使用二氧化碳输送系统，用缺氧对小鼠实施安乐死。将安乐死小鼠固定在上部位置的解剖板上，并使用剪刀和钳子进行纵向腹腔切除术。
2. 使用钳子，移动腹部右侧的肠道和胃，露出胃和脾脏。脾脏附着在胃上。
3. 使用钳子，小心地从胃分离脾脏，并将其放入含有5mL的HBSS 2%FCS的培养皿中。

3. 免疫细胞隔离

1. 将脾脏放在40μm细胞滤网中，放在同一个培养皿上。用柱塞压碎脾脏，将其分离在同一道菜中。
2. 将分离的脾脏和液体转移到15mL的离心管中。
3. 在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，然后丢弃上清液，避免颗粒。
4. 在2mL的醋酸钾中重新悬浮颗粒，以赖化红细胞。等待 2 分钟，然后用 HBSS 2% FCS 将音量补至 15mL。
5. 在 10°C 下，在 370 x g下再次将管离心 7 分钟。丢弃上清液，在 5mL 的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。
6. 使用锥蓝色染色测定对细胞进行计数，并使用适当的HBSS 2%FCS量将最终细胞浓度调整到10⁷细胞/mL。

4. 细胞染色

1. 将200μL的细胞悬浮液转移到6个FACS管中，标有1至6。
2. 在 370 x g下在 10°C 下将管离心 7 分钟，并丢弃上清液，避免颗粒。
3. 接下来，根据表1，通过在200μL HBSS 2%FCS中加入适量的抗体，制备6种新型抗体混合物。
4. 然后，将这些抗体混合物转移到相应的编号FACS管中。
5. 在黑暗中的冰上孵育与抗体混合的细胞悬浮液20分钟。
6. 在每个管中加入 1mL 的 HBSS 2% FCS，然后在 370 x g下在 10°C 下再次离心 3 分钟。
7. 丢弃上清液，在 200μL 的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。
8. 将重新悬浮的颗粒转移到新的 FACS 管中。

表1:抗体混合组合。为实验准备了六种200μL的HBSS+抗体混合物。混合 1 用于 PMT 设置，混合 2 到 5 用于补偿设置，混合 6 用于单元格排序。

5. FACS 校准

1. 首先，打开分拣机并执行"流体启动"。
2. 打开流，然后等待 15 分钟，使流稳定下来。
3. 调整流的振幅以获得分离的跌落形成。然后单击"甜蜜点"以完成振幅调整。
4. 将中性密度 （N.D.） 滤波器 - 1.0 打开代表细胞仪设置和跟踪的"CST"接口。
5. 要执行日常质量控制，首先按照制造商的说明，使用 FACS 介质稀释 CST 磁珠，然后执行 CST 控制。
6. CST 控制完成后，将 N.D. 1.0 过滤器替换为细胞仪上的 N.D. 2.0 滤波器。
7. 接下来，按照制造商的说明在 FACS 介质中稀释滴延迟磁珠，然后加载到 FACS 中。
8. 确保正确排序执行放置延迟-
   1. 首先单击"电压"，然后单击"光学滤波器"。右侧象限应等于 100%。如有必要，向左或向右调整细胞仪上的红色激光螺钉，以获得 100% 的右侧象限。
   2. 接下来，执行测试排序以确保流落入收集管。为此，请单击"废物抽屉"，然后开始"测试排序"。检查侧流落入收集管。如果没有，请调整电压，直到调整电压。
   3. 导航到实验模板。然后，打开"Aaccdrop 丢弃延迟"实验，然后单击"排序布局"。
   4. 更改流速以每秒获取 1000 到 3000 个事件。
   5. 单击"电压"，然后单击"光学滤波器"。左象限应等于 0，右象限应等于 100。
   6. 在"排序布局"窗口中单击"排序"，然后单击"取消"。左象限应等于 100，右象限应等于 0。如果左象限小于 95，请单击"自动延迟"以自动调整它。

6. 流动细胞测定和纯度控制

1. 从管1（未染色的细胞）开始流动细胞测定，以定义细胞形态和氟铬的负峰。设置正向和侧面散射，并定义每个荧光参数的电压。使用每个点图上的网格，在第一个十年中放置负总体。
2. 接下来，在细胞仪中加载管2（单色控制）。调整光谱重叠，直到负总体和正总体中位数对齐或使用自动计算软件。保持信号的刻度非常重要。补偿控制必须与实验荧光铬和探测器设置相匹配。记录 10，000 个事件。
3. 使用管 3、4 和 5（其他单色控件）重复这些步骤。
4. 接下来，加载管6（多染色细胞），并使用特定的浇注策略定义感兴趣的细胞群。
5. 在"排序布局"窗口中，选择感兴趣的单元格总体。在"目标事件"中选择单元格阈值，在"精度"中选择精度级别。这里只有一个人口被排序，但是，四个不同的人口可以同时排序。
6. 准备好后，单击"排序"和"确定"，然后等待单元格排序。
7. 细胞分拣完成后，首先将10μL的分类细胞移入带有90微升HBSS 2%FCS的新FACS管中，从而进行纯度控制。
8. 然后，将管装入细胞仪。记录和分析细胞的表型，以验证浇注策略是否按预期工作。

7. 数据分析

1. 打开"FlowJo"软件，在"所有样本"窗口中拖动每个管的文件。
2. 双击文件以在新窗口中打开该文件。
3. 单击"多边形"并重新创建以前使用到的浇注策略。
4. 对所有其他文件重复这些步骤。
5. 要可视化点图，请单击"布局编辑器"，然后从管 6 和布局编辑器选项卡中的纯度控制中拖动感兴趣的人群。
6. 要检查已排序单元格中 B 淋巴细胞的纯度，请单击"表编辑器"。从管6中拖动B淋巴细胞群和表中的纯度控制。
7. 在"统计"菜单上选择CD45+细胞的频率以测试这个细胞群的纯度，然后单击"创建表"。
8. 参数值将显示在新表中。在纯度控制窗口中，检查CD45+细胞内B淋巴细胞的频率，应高于98%（见图2，底部面板）。