1. 设置

1. 典型的染色协议涉及以下步骤：
   1. 使用一系列分级乙醇对幻灯片上的组织部分进行重新保湿。
   2. 用阻塞缓冲液孵育组织部分，这将有助于阻断抗体与组织的非特异性结合，并减少背景荧光。
   3. 去除阻塞缓冲液，在原抗体中孵育该部分，此时抗体将结合其肽靶点。
   4. 去除原抗体，在洗涤缓冲液中广泛清洗各部分。
   5. 如果原抗体没有直接标记有荧光团，并且需要二级抗体，则用二级抗体孵育部分，以便与原抗体结合。
   6. 将次级抗体从滑轨上洗掉。
   7. 在安装介质中安装幻灯片，使其在荧光显微镜可视化之前干燥。
2. 需要以下物品：滑动支架（玻璃或塑料）、罐、移液器、纸笔、潮湿室、盖玻片以及带 DAPI 的安装介质。
3. 二甲苯用于幻灯片的补液。二甲苯是危险的，应与适当的PPE一起使用，包括手套和实验室外套。
4. 缓冲剂、溶液和试剂的配方
   1. 分级乙醇
      乙醇 - 160 mL 200 防艾图和 40mL ddH₂O
      乙醇 - 140 mL 200 防艾图和 60mL ddH₂O
   2. 抗原检索解决方案
      10 mM 柠酸钠，pH 6.0
   3. 阻塞缓冲区
      来自宿主动物的100μL血清，从中产生二级抗体
      900 μL 1X PBS
      注意：这是 10 个部分的卷;根据需要调整每个截面约 100 μL 缓冲液的音量。
   4. 洗涤缓冲液 （1X PBS）

2. 议定书

1. 用二甲苯和乙醇补液
   1. 将幻灯片放入滑架中，然后将幻灯片浸入 100% 二甲苯等构体溶液中，确保幻灯片完全覆盖解决方案。
   2. 在100%二甲苯等体中孵育幻灯片3分钟，重复两次，共孵育3次。在转移到新解决方案之前，请务必用纸巾擦拭滑架，以尽量减少污染。
      注意：建议在三个单独的容器中进行这些孵育。
   3. 在 100% EtOH 中孵育幻灯片 2 分钟，重复两次，共孵育 3 次。
      注意：建议在三个单独的容器中进行这些孵育。
   4. 在 95% EtOH 中孵育幻灯片 2 分钟。
   5. 在 80% EtOH 中孵育幻灯片 2 分钟。
   6. 在 70% EtOH 中孵育幻灯片 2 分钟。
   7. 在 1X PBS 中孵育幻灯片 5 分钟。
2. （可选）抗原检索，以揭开由原抗体识别的表位
   注1：此过程高度依赖于所使用的抗体，建议执行初始优化程序以确定抗原检索的要求。
   注2：此过程未在下面显示的 F4/80 染色下执行。抗原检索的要求应结合每个新的抗体进行优化。
   1. 将滑轨放在耐热塑料或玻璃滑片支架中，并确保机架充满滑轨，以确保均匀地分配热量。如果机架中的样本少于插槽，可以使用空白幻灯片。
   2. 将机架放入 1000 mL 的抗原解合溶液中，放入 2L 烧杯 - 10 mL 抗原解掩蔽液，至 990mL 水中。
   3. 微波炉高20分钟，确保幻灯片仍然覆盖水。
   4. 在烧杯中冷却幻灯片 20 分钟。
   5. 在包含 ddH₂O 的滑轨支架中清洗滑动机架，每次 5 分钟。每次使用新鲜的ddH₂O对总共3次单独的孵育重复两次。每次清洗时，滑块可以在同一滑架上清洗。
   6. 在 1X PBS 中孵育幻灯片 5 分钟。
3. 用纸笔圈截面。这将允许使用覆盖组织部分所需的最小缓冲液。不要让组织部分干燥。
4. 向每个部分添加阻塞缓冲区。覆盖截面所需的缓冲量会因截面的大小而异，但范围可能为25-500 μL。
   注意：阻塞缓冲液的选择可能因所使用的抗体而异。例如，来自引发二级抗体的宿主动物的10%血清可用于减少二次抗体的非特异性结合（例如，如果在山羊中升起二级抗体，可以使用正常的山羊血清）。应针对每种主要抗体优化阻塞缓冲液。使用F4/80染色乳腺肿瘤部分，0.1ml10%正常山羊血清在PBS中使用。
5. 在室温下在加湿室中孵育块缓冲液1小时，或4°C至24小时。加湿室确保各部分不干燥。
6. 将阻塞缓冲区从幻灯片上排出，将其清除。或者，可以使用移液器移除阻塞缓冲器，但注意不要用移液器尖端触摸该部分。
7. 稀释阻塞缓冲液中的原抗体。
   注意：需要为每个抗体和样品类型确定正确的稀释。优化将包括执行一系列稀释，以确定最佳染色。为了用F4/80染色乳腺肿瘤部分，组织部分在4°C下孵育过夜，在0.1 mL大鼠抗F4/80抗体中稀释1：100在PBS中1%的正常山羊血清中。
8. 将原抗体添加到每个部分，并在4°C的加湿室中孵育长达16小时（过夜）。在无原抗体的阻断缓冲液中至少留出一个部分作为对照，这将有助于识别二级抗体的非特异性结合。
9. 将滑片放入滑架并放入带 1x PBS 的滑块支架中，将原抗体排空或阻塞该部分，用 PBS 清洗部分。每次洗3次10分钟。
10. 稀释二级抗体1：200在阻断缓冲液。稀释可以根据二级抗体进行优化。
11. 将次级抗体添加到所有部分（包括对照部分），并在防光室中孵育1小时。
12. 将二级抗体排干，并在PBS中每次洗涤3次，每次10分钟。
13. 在幻灯片中添加 2-3 滴含有 DAPI 的安装介质，并在样品上放置一个盖玻片。如果安装介质不是快速干燥类型的介质，则可能需要使用熔化的石蜡或指甲油密封滑道边缘，以防止泄漏并长期维护样品。
14. 让幻灯片在黑暗中过夜干燥，并使用荧光显微镜对部分进行成像。

3. 数据分析和结果

1. 使用荧光显微镜分析染色部分。图像捕获和分析的具体细节将取决于显微镜的规格和用于执行分析的软件。通常，图像可以作为单色图像拍摄并重叠以生成多色图像。正细胞百分比可以通过计算正染色细胞的数量并除以一节中DAPI染色细胞的总数来量化。对于乳腺肿瘤部分的F4/80染色，使用软件Leica应用套件，版本3.8，在获取选项卡和图像叠加采集模式下，都启用了DAPI和RFP。对暴露、增益和伽玛进行了调整（DAPI 分别为 20.0 ms、1.0x 和 1.53，RFP 分别为 944.2 ms、1.0x 和 1.08），但实验因实验而异。"获取叠加"按钮用于创建 DAPI 和 RFP 曝光的叠加图像。
2. 下图（图1）显示了一个沾有F4/80的肿瘤部分的免疫荧光图像，该图像检测巨噬细胞和其他骨髓细胞上的抗原。该部分使用包含 DAPI 的安装介质安装，原子核以蓝色显示。