ELISPOT 分析:检测 IFN-- 分泌性细胞

Overview

资料来源:托尼娅·韦伯¹
¹马里兰大学医学院微生物学和免疫学系，马里兰州巴尔的摩的马琳和斯图尔特·格林鲍姆综合癌症中心 21201

ELISPOT 是一种标准化的、可重复的检测，用于检测细胞免疫反应。该测定利用一种基于酶链接的免疫吸附测定（ELISA）方法检测单细胞免疫反应，这些反应可以通过斑点可视化，因此命名为ELISPOT。1983年，Czerkinsky首次将ELISPOT描述为一种列举产生抗原特异性免疫球蛋白（1）的B细胞杂交瘤数量的方法。同一组进一步开发了测定，以测量细胞因子产生T淋巴细胞的频率。现在，ELISPOT已成为在临床试验和疫苗候选中测量抗原特异性T细胞免疫的黄金标准。例如，在接种疫苗后或感染期间，血浆细胞和记忆B细胞分泌抗体，提供保护。通常，通过测量抗原特异性抗体的血清位子来评估这些B细胞反应。然而，这种类型的分析，通常由ELISA测量，可能不包括记忆B细胞，即使在没有可检测的血清抗体水平的情况下，也可能存在记忆B细胞。此外，循环记忆B细胞对于病原体重新暴露后观察到的快速保护性抗体反应非常重要，因此能够检测这些细胞至关重要。因此，为了清楚地评估抗原特异性记忆B细胞反应，应同时使用ELISA和ELISPOT（2）。

ELISPOT 测定使用含有膜衬里孔的板，这些孔被涂有抗体，以捕获感兴趣的分泌蛋白质。然后，板加载细胞和刺激，以诱导蛋白质生产。分泌的蛋白质被表面涂覆的抗体捕获。在适当的孵育时间后，细胞被移除，并且使用生物缩化抗体检测分泌的分子，该抗体是特定为不同表位，与捕获抗体相比。接下来，加入链球菌蛋白过氧化物酶，然后添加基板，允许检测斑点（图1）。这种测定的用量是，它允许定量出产生感兴趣的蛋白质的细胞数量。重要的是，人们可以评估产生特定蛋白质的细胞总数是否有变化，或者种群中的单个细胞是否产生更多的蛋白质。此外，它可以提供有关动力学的信息，并可用于评估与抗原特异性反应（抗原模拟）相关的整体免疫活化（米托根刺激）。ELISPOT测定将允许在线生成或抗原特异性激活后在300，000个细胞中检测一个活化细胞。

图 1:ELISPOT 协议概述。

这种测定的主要优点是它简单，协议相对简单明了。它不需要技术专长，b. 敏感性 - 它允许在单个细胞水平上检测免疫细胞，并且与其他方法（如流式细胞测量、c. 功能）相比，它只需要很少的细胞，它提供有关免疫的定量数据功能。

本实验演示了用于检测IFN-分泌-血细胞的ELISPOT协议，但如上所述，此测定也可用于评估B细胞（3）的抗体分泌。

Procedure

1. 设置

缓冲液和试剂

不含钙或镁的无菌磷酸盐缓冲盐（PBS）
涂层缓冲液 - 无菌 PBS 或碳酸盐缓冲器
PBS 中测定稀释 - 10% 胎儿牛血清（FBS）
细胞培养介质-RPMI 1640，带10%FBS、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺
洗涤缓冲液 - 含有 0.05% Tween20 的 PBS
双蒸馏水（ddH₂O）
检测基质- 100mg AEC（3-氨基-9-乙基-卡巴佐尔），在10mL DMF（N，N，二甲基甲酰胺）。

设备

拉米纳尔流量罩
加湿培养箱（设置在37°C，5%CO_2）
自动 ELISPOT 阅读器或解剖显微镜
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Results

在本次ELISPOT测定中，对野生型和肿瘤小鼠的脾白细胞进行了分析，以检测IFN-α。图 2 A 显示了检测结果的可视图像。绿色数字表示每口井的点数（TNTC 表示"太多，无法计数"）。请注意，斑点的数量随着细胞浓度的降低而减少。

Figure 2A
图2A:肿瘤小鼠免疫反应下降。

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Application and Summary

ELISPOT测定允许一个人通过确定分泌特定Anlyat的细胞数量来评估免疫细胞的激活。斑点的大小和强度提供有关每个细胞产生的麻醉剂量的信息。上述协议详细说明了单个细胞因子的检测。然而，最近的事态发展增强了这种测定的效用。目前，人们可以使用荧光检测染料来检测井内多个分析物。这允许检测分泌一种或两种分析物的细胞的不同亚群。

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References

Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., & Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods, 65 (1), 109-121(1983).
Wahid, R., Simon, J. K., Picking, W. L., Kotloff, K. L., Levine, M. M., & Sztein, M. B. Shigella antigen-specific B memory cells are associated with decreased disease severity in subjects challenged with wild-type Shigella flexneri 2a. Clinical Immunology, 148 (1), 35-43 (2013).
Roberts, T. J., Lin, Y., Spence, P. M., Van Kaer, L., & Brutkiewicz, R. R. CD1d1-dependent control of the magnitude of an acute antiviral immune response. The Journal of Immunology, 172, 3454-3461 (2004).

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1. 设置

缓冲液和试剂

不含钙或镁的无菌磷酸盐缓冲盐（PBS）
涂层缓冲液 - 无菌 PBS 或碳酸盐缓冲器
PBS 中测定稀释 - 10% 胎儿牛血清（FBS）
细胞培养介质-RPMI 1640，带10%FBS、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺
洗涤缓冲液 - 含有 0.05% Tween20 的 PBS
双蒸馏水（ddH₂O）
检测基质- 100mg AEC（3-氨基-9-乙基-卡巴佐尔），在10mL DMF（N，N，二甲基甲酰胺）。

设备

拉米纳尔流量罩
加湿培养箱（设置在37°C，5%CO_2）
自动 ELISPOT 阅读器或解剖显微镜

材料

埃利SPOT板
无菌和非无菌储液罐
移管器和提示
无菌血清学移液器
无菌、锥形聚丙烯管
两个挤压瓶，用于洗板

测定特异性试剂

细胞- 原细胞或细胞系（这里，使用C57BL/6小鼠的血细胞）
兴奋剂 - 线粒素或抗原（此处，使用磷脂 12-米精酸盐 13-醋酸酯（PMA， 50 ng/mL）和碘霉素（1 μM）
原发抗体-生物氨酸抗细胞因子检测抗体（在测定稀释剂中稀释至2微克/mL）
二次抗体-链球菌-马萝卜过氧化物酶（SAv-HRP）

2. 程序

涂层

保持无菌状态，在层流罩内，将纯化的抗细胞因子捕获抗体稀释至无菌涂层缓冲液中最终浓度为0.5-4.0 μg/mL。（注:对于IFN-α和IL-6使用5μg/mL）。
将捕获抗体溶液 100 μL/孔转移到 ELISPOT 板。
用板盖盖住板并密封，以防止蒸发。
在4°C下孵育板过夜。

阻塞

第二天，在层流罩中揭开 ELISPOT 板。快速将板倒置到无菌湿巾上，从每个孔中取出捕获抗体溶液。
然后，在每个孔中加入200μL的细胞培养基。此步骤将阻止在测定期间进行非特定绑定。
更换板盖，在 37°C 下孵育板 2 小时。

电镀和激活细胞

在培养板时，在细胞培养基中制备含有50纳克/mL PMA和1μM碘霉素的2X线粒体溶液。
然后，将目标细胞悬浮液制备到2 x 10⁶细胞/mL的库存浓度。
孵育完成后，通过快速将板倒置到层流罩内的无菌湿巾上，从每个孔中取出细胞培养基。
接下来，生成库存单元悬架溶液的 2 倍串行稀释。为此，首先将200 μL的制备蜂窝悬浮液添加到ELISPOT板顶行的井中。
然后，在包含细胞库存溶液的行下方的板的下五行中添加 100 μL 的普通细胞培养基。
之后，通过将细胞悬浮液的 100 μL 从顶行移入正下方的行，执行 2X 串行稀释。通过上下轻轻移液，确保正确混合，确保均匀分布电池。
对其余四行重复此过程。
仅保留第六行的区域性介质。它将作为实验控制。
接下来，将制备的线粒体溶液的100μL添加到板的前五行的实验井中。在对照井和第六行中，添加100μL的细胞培养基，不含线粒体。
在 37°C、5% CO₂的培养箱中更换板盖和孵育板 20-48 小时。（注:20-24小时通常足以检测IL-2和TNF-α，而48小时对于IL-4和IFN-*是最佳选择。

检测

原抗体

制备生物仿当化抗细胞因子检测抗体，在测定稀释剂中浓度为2μg/mL。
此时通过在 PBS 中混合 0.05% 补间-20 来制备 20-25 mL 的洗涤缓冲液。
孵育完成后，解盖板，并迅速将其倒置在水槽上，以清除井中的所有液体。（注意:在此之后，板不再需要保持无菌）。
然后，通过在每个孔中加入±200 μL洗涤缓冲液来洗板。通过快速反转和轻拂水槽上的盘子来排出这种液体。重复此过程，共进行五次处理。
接下来，在每个井中加入100μL的稀释生物氨酸抗细胞因子检测抗体溶液。在室温下孵育2小时，室温下孵育，或在4°C下孵育。

二次抗体

孵育完成后，通过反转和轻拂水槽上的板来排出检测抗体。
与之前一样，用+200 μL洗涤缓冲液清洗板5次，每次洗涤之间排出液体。
接下来，在每口井中加入100 μ0μL的稀释链球蛋白-马萝卜过氧化物酶溶液（稀释到其预先确定的最佳浓度测定稀释剂中）。
更换板盖，在室温下在37°C下孵育1.5-2小时。

衬底

孵育后，使用前不超过15分钟，根据制造商的说明首先激活AEC基板溶液。
接下来，丢弃井内的物品，像以前那样用洗涤缓冲液洗板五次。
然后，立即将100μL的制备AEC基板溶液加入每个井中。
在室温下孵育板约10-20分钟，同时监测现场发育。
用清水将盘子浸在水槽上，从而停止反应。
将盘子放在纸巾上，让盘子在一夜之间晾干，或直到完全干燥。取出板下的塑料托盘有助于干燥。

3. 数据采集和分析

干燥后，这些斑点已准备好使用自动板读取器计数。在这里，使用CTL免疫点读取器，但该协议可以适用于任何读取器。
首先打开仪器，然后打开计算机。然后，打开 CTL 程序并单击"扫描计数"。
推动"弹出"托盘从机器中伸出。然后，拆下塑料适配器，并在 ELISPOT 板和适配器上对齐行"A"。
选择要保存的文件的文件名和位置，并将板加载到托盘上。
然后，单击软件上的"加载"并关闭机器侧面的门。
按"计数后开始"。确保保存文件，然后打开质量控制"QC"软件来分析数据并计算点数。

笔记:

在初步实验中应确定细胞的最小数量。最佳点数为 +50/井。如果加载的单元格太多，将很难检测出不同的斑点。此外，细胞会重叠，可能不会在膜上形成单层，因此检测水平可能会降低。
优化实验时，考虑目标蛋白的预期表达水平。表达式越低，每口井所需的单元格数就越多。
与 ELISA 不同，最好用手洗盘子，而不是使用洗盘。ELISPOT板更细腻，应避免刺穿PVDF膜。
在孵育期间，应限制板块的运动，因为它可能导致斑点弄脏。
板应储存在黑暗中，因为暴露在直光下会导致斑点褪色。

PLAYLIST

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