这项工作是由加拿大创新基金会（CFI），加拿大卫生研究所（CIHR）学院，以及自然科学与工程研究理事会（NSERC），加拿大的赠款支持。

第1部分：中断一个流感病毒粒子<ol><li>添加到一个贝克曼聚碳酸酯离心管，设计成TLA - 120.2转子适合在贝克曼的Optima使用（11毫米× 34毫米）的750名产妇和新生儿破伤风缓冲液（MES的20毫​​米，150毫米氯化钠，30毫米的Tris，pH值7.5）马克斯 - E超速离心机。 </li><li>添加到该管的A型流感病毒（H3N2型X - 31 A/AICHI/68应变; 2毫克/毫升）500μL。移液器向上和向下几次与产妇和新生儿破伤风的缓冲区混合病毒。 </li><li> 109000 XG，4 ° C离心10分钟，在一个贝克曼舰最大- E使用TLA - 120.2转子离心机。 </li><li>去除上清，重新悬浮颗粒在500μL中断缓冲区（100毫米氯化钾，氯化镁2 5毫米，5％（W / V）甘油，50毫米octylglucoside，10毫克/毫升溶血卵磷脂，二硫苏糖醇1.5毫米，100毫米的MES， pH值5.5）。 </li><li>涡大力，然后摇在31℃20分钟在一个小指thermomixer彗星。 </li></ol>第2部分：甘油梯度泥沙速度离心<ol><li>准备放入一个贝克曼ultraclear离心管（13毫米× 51毫米）以下的甘油，甘油梯度：1毫升70％（V / V）甘油，0.75毫升50％甘油，0.375毫升40％甘油，和1.8毫升33％甘油。甘油的解决方案是由纯甘油的混合纳米缓冲区（MES，pH值5.5，50毫米150毫米氯化钠）。还准备同时含有甘油和缓冲的平衡管。 </li><li>旋涡再次扰乱了病毒样本，并加载到甘油梯度。 </li><li>离心机梯度为3.75小时，217000 XG 4 ° C，在一个贝克曼MLS - 50斗摆动转子。 </li><li>离心完成后，手动收集250μL等份，从管的顶部开始梯度。保持在冰上或在4 ° C的分数</li></ol>第3部分：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的甘油梯度分数<ol><li>从每个几分新鲜管取出20μL。 </li><li>新增5 5倍的SDS - PAGE样品缓冲液。 </li><li>加热至95 ° C 5分钟。 </li><li>简要离心样品，并加载到10％的聚丙烯酰胺凝胶，分子量标记，其中包括在井之一。 </li><li>凝胶上运行的样本，直到溴酚蓝上样染料达到接近凝胶底部。 </li><li>考马斯蓝染色的凝胶。 </li></ol>第4部分：vRNP分数的浓度<ol><li>选择含有主要NP甘油分数，将它们结合起来，和他们分配到两个贝克曼聚碳酸酯离心管（11毫米× 34毫米）。 </li><li>焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的超纯水，和吸管起来，几次下来混合填充每个管。 </li><li> 157000 XG，4 ° C离心4.5小时，在一个贝克曼TLA - 120.2转子。 </li><li>去除上清液，并在50μLDEPC处理过的水重新悬浮沉淀。 </li><li>如果需要，集中vRNPs 280可以衡量的。为NP是汇集分数的重要组成部分目前，估计的NP摩尔可以使用 M -1 厘米 -1（通过ProtParam 3确定）的55350消光系数计算。 </li><li> vRNPs纯化，分装和存储他们冻结在-80 ° C为以后使用。 </li></ol>第5部分：vRNPs负染<ol><li>到9μL稀释1μL纯化vRNP新鲜和过滤两次产妇和新生儿破伤风的缓冲区（三30毫米，20毫米的MES，150 mM氯化钠，pH值7.5）。其他缓冲区也确定淡化vRNPs洗试样的网格（步骤5.5），但如果不使用PBS醋酸铀负染。 </li><li>辉光放电的标本（铜透射电镜）电网之前30秒一个parlodion和碳薄膜的涂层。 </li><li>保持与镊子新鲜标本电网辉光放电，并应用到标本电网5μL稀释vRNP下降。 </li><li>保留标本8分钟电网下降。 </li><li>在等待，在板凳上的封口膜小片地方，并免除2滴10μL每个产妇和新生儿破伤风缓冲区（洗电网），和一个新鲜的染色溶液80μL下降（1％钼酸铵或1 ％醋酸双氧铀）上的封口膜。 </li><li>吸附的8分钟后，灯芯从样品溶液的滤纸标本网格（切成三角形）的一部分。不要让干的标本电网。 </li><li> 2含1分钟的总时间为产妇和新生儿破伤风缓冲区各10μL滴标本电网清洗。这样做是通过仔细的下降降低试样的网格，然后排汗关闭部分样品溶液的滤纸标本网格（而不让试样电网干）。 </li><li>后立即排汗的缓冲区从标本电网的最后一滴，完成LY淹没的标本染色液滴内的电网，并等待1分钟。 </li><li>完全灯芯染色滤纸标本电网解决方案。 </li><li>允许风干的标本透射电子显微镜下观察前几分钟电网。 </li></ol>第6部分：代表性的成果： <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_1/1105_Figure2.png" alt="图2" width="600" height="215" />图1 由于A型流感NP（〜56 kDa）的蛋白在病毒核蛋白复合物中发现的主要，NP带一般是最强的乐队在vRNPs（图1）的分数。除了到NP，每个流感vRNP还包含一个三聚体的RNA聚合酶（82，86和86.5 kDa的分子量）复杂的副本。这些可能会或可能不会考马斯亮蓝染色可见的，因为他们的丰度相比是低的NP。然而，聚合酶，可以检测到，而不是一个Commassie蓝染色，凝胶进行银染。流感基质蛋白M1（〜28 kDa）的，应最低限度在目前存在的NP蛋白峰分数的分数。 <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_2/1105_3.png" alt="图3" width="600" height="360" />图2 负染色透射电子显微镜下观察vRNPs应该产生类似于可变长度的杆状颗粒约30纳米，长度为120纳米（图2a）vRNPs。低聚NP是一个NP的分子链进一步折叠成一个双螺旋重复结构的组织，如此循环，有时可以看到（图2b），这些杆状颗粒的两端。

<ol>
	<li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins.">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> Virology. 202, 1028-1033 (1994).</li><li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes.">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Pant&#233;, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein.">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> Virol J. 4, 49-49 (2007).</li><li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes.">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).</li></ol>

vRNPs净化Kemler 等人 （1994年）所描述的程序的基础上，我们和其他人也用此协议隔离vRNPs，研究它们的核进口。2,4,5 我们建议使用无RNase的技巧和操纵vRNPs管时，因为病毒基因组RNA的组成，因此很容易降解的RNA的存在。此外，所有的缓冲区，应即核糖核酸免费的水。这里所描述的协议，是一种酸性提取（如中断缓冲区和甘油梯度的pH值是5.5）。同样，一个基本的?...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River Laboratories</td>
<td>490715</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-8250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G33-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O-8001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysolecithin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L-4129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-9779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coomassie brilliant blue G-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kodak</td>
<td>1367796</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>750024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>19481</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Molybdate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A-674</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optima MAX-E Ultracentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>434491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>367280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eppendorf Thermomixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brinkman</td>
<td>022670000</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

purification and visualization of influenza a viral ribonucleoprotein complexes

A型流感病毒的基因组由8负意义上说，单链RNA分子单独包装，与A型流感到的病毒ribonulceoprotein颗粒（vRNPs）核蛋白（NP）的多个副本。流感vRNPs封闭的病毒包膜内。然而，在进入细胞，这些vRNP复合物释放到细胞质，在那里他们获得主机核运输机械。为了研究核进口的流感vRNPs和流感基因组复制的，它与孤立的vRNPs工作，使病毒的其他组件不干扰这些进程是有益的。在这里，我们描述一个过程来净化这些vRNPs从A型流感病毒。程序启动以释放笼罩病毒粒子vRNP复合物，用清洁剂A型流感病毒粒子的干扰。 vRNPs是从A型流感病毒粒子在33-70％的速度沉淀间断甘油梯度的其他部分隔开。从甘油梯度获得的分数，然后通过SDS - PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色后。包含NP峰值分数，然后汇集在一起​​，并通过离心浓缩。浓度后，vRNPs的完整性是通过可视化的传输电子显微镜负染色后的vRNPs验证。甘油梯度纯化的修改，从Kemler<em&gt;等。</em&gt;（1994）<sup&gt; 1</sup&gt;和负染色进行吴<em&gt;等。</em&gt;（2007年）。<sup&gt; 2</sup

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Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

A型流感病毒的基因组由8个独立的复合物，RNA和蛋白质，称为病毒核蛋白复合物（vRNPs）。本文介绍的甘油梯度纯化和透射电子显微镜A型流感vRNPs可视化。

A型流感病毒的核蛋白复合物的分离纯化及可视化

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

purification-visualization-influenza-viral-ribonucleoprotein

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K 次观看.  University of British Columbia - UBC. A型流感病毒的基因组由8个独立的复合物，RNA和蛋白质，称为病毒核蛋白复合物（vRNPs）。本文介绍的甘油梯度纯化和透射电子显微镜A型流感vRNPs可视化。