我们感谢博士Naidenko优化复性条件的帮助。这项工作是支持由美国国立卫生研究院的研究经费AI58181洛朗Brossay。辛迪迪班是由美国国立卫生研究院NRSA F31 AI080230支持。 斯蒂芬妮Terrizzi和辛迪迪班平等作出贡献，对这项工作。

包涵体的制备<ol><li>接种4 × 500毫升烧瓶结核病每个过夜培养的细菌，表达KLRG1质粒构建含有50微克/ ml的羧苄青霉素和氯霉素。当外径达到0.6 A，在600 nm与0.4 M IPTG诱导，并在37孵育一个附加的4小时晃动文化° C。 </li><li>中提取的干细胞重悬在再悬浮缓冲液的pH值= 8.0（50 25％（W / V）蔗糖，1 mM的EDTA，MM的Tris - HCl，10 mM的数码地面电视）。注：颗粒可以在这个阶段被冻结。 </li><li>池不超过60毫升细菌resuspensions的聚丙烯烧杯。如果有必要调整到60毫升，用TE缓冲液pH值8.0，并在半速搅拌混合。 </li><li>以搅拌混合添加下降明智的：溶菌酶（终= 1毫克/毫升），氯化镁（终= 5毫米），2毫克DNA酶我包含在50％的甘油75毫米氯化钠，TRITON - X100（最终= 1％），数码地面电视（最终= 10毫米）。 </li><li>超声冰1.5分的解决方案，并在10分钟5000转离心裂解液在4 ° C。 <ol class="lalpha"><li>倾倒上清液。 </li><li>添加15毫升的洗涤缓冲液的pH值= 8.0（50毫米的Tris - HCl，0.5％Triton X - 100的的氯化钠，100毫米，1毫米EDTA，1 mM的数码地面电视）。 </li><li>在冰上，超声1.5分钟的解决方案，直到沉淀完全重悬。 </li><li> 10分钟5000转离心样品在4 ° C。 </li><li>重复洗5次。 </li></ol></li><li>洗没有TRITON X - 100，离心机和4毫升TE缓冲液中的悬浮缓冲液重复5B。 </li><li>以湿重包涵体浆在30至100毫克/毫升的浓度，并存储在TE缓冲液。 </li></ol>复性KLRG1 <ol><li> 1 L复性缓冲液pH = 8.0（0.4 M精氨酸盐酸的0.1 M Tris pH值8-8.3，2毫米EDTA，0.2毫米PMSF，EDTA - 免费蛋白酶抑制剂药片，5毫米GSH和0.5毫米的GSSG）和寒意到4 ° C，边搅拌。 </li><li>准备注入折叠混合物包涵体：这是非常理想，使每5 10注射用0.25 0.5微米的浓度，使终浓度的蛋白质将于2 3微米。 <ol class="lalpha"><li>融化10毫米的β-巯基乙醇50毫克包涵体浆量在7米GnHCl。 </li><li>保持包涵体/ GnHCl混合物在37 ° C为30 - 40分钟和涡每5分钟，以确保完全融化（完全融化时，泥浆就会清楚）。 </li><li>离心机最大速度离心30分钟在4 ° C，将上清转移至15 mL离心管。做不转让任何黑色的小颗粒。 </li></ol></li><li>注射缓冲液（3米GnHCl，10毫米NaAcetate mM的EDTA，pH值4.2,10），调整音量。 </li><li>注入1毫升稀释后的包涵体每隔一小时。注射时，在高速搅拌，添加1毫升稀释包涵体下降，下降2秒之间每下降。当注射完成后，在低速搅拌。 </li><li>隔夜继续低速搅拌，在4 ° C。 </li></ol>浓度的复性反应<ol><li> Millipore公司S协议，集中1升的预过滤（0.22μm的过滤），复性反应使用Amicon搅拌细胞和YM10 NMWL 10K超滤膜（Millipore公司）〜10毫升。 </li><li>集中≤2毫升，使用一个Centriplus YM - 10 10K截留分子量（Millipore公司）。 </li></ol> KLRG1四聚体的纯化<ol><li>安装在4 ° C，符合GE医疗手册的AKTAFPLC。 </li><li>使用Sephacryl S - 200 16/60高分辨率柱（通用电气医疗集团）在20毫米的HEPES和150 mM氯化钠尺寸排阻色谱纯化单体形式存在的KLRG1。 （见图1）。 </li><li>浓缩至1 ml，使用Centriplus YM - 10 10K截留分子量（Millipore公司）。 </li><li>根据以亲和力S协议，使用比拉酶biotinylate KLRG1单体。 </li><li>免费素是体积排阻色谱2淘汰。 </li><li> KLRG1分子tetramerized KLRG1单体与4倍超额摩尔聚乙烯共轭链霉亲和素（BD Biosciences公司）混合。 </li></ol>代表性的成果 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="图1" border="0" /></a> AKTA FPLC尺寸排阻色谱图1。代表从积极的成果复性KLRG1。图表显示分离（83.52毫升）的单体，二聚体（56.36毫升），和multimer（36.26毫升）的复性KLRG1形式。 94.25毫升峰代表缓冲区交换。

<ol>
	<li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1.">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li><li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1.">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li><li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity.">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li><li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition.">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li><li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+(KLRG1).">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , .</li></ol>

在这个协议中，它是如何净化，biotinylate，tetramerize KLRG1。 KLRG1四聚体可以用来标记流式细胞仪KLRG1配体。虽然复性条件进行测试，每个蛋白质的经验，其他的C型凝集素可tetramerized使用了类似的协议。使用tetramerized蛋白作为探针，对孤儿的C型凝集素受体的配体可能被确定。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BirA Enzyme and Buffer</td>
<td>Biotinylation Kit</td>
<td>Avidity</td>
<td>BIRA500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>11 836 170 001</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon Stirred Cell</td>
<td>Equipment</td>
<td>Millipore</td>
<td>Model #8400</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane</td>
<td>Filtration Supply</td>
<td>Millipore</td>
<td>13642</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml YM10 concentrator</td>
<td>Filtration Supply</td>
<td>Millipore</td>
<td>4411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AKTAFPLC</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1900-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1166-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Strepavidin PE</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>554061</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a protocol for the production of klrg1 tetramer

杀伤细胞凝集素样受体G1（KLRG1）是II型跨膜糖蛋白抑制性受体，属于C型凝集素样超家族。 KLRG1存在单体和二硫键相连的二聚体。这种保守的受体上最成熟，最近激活NK细胞，以及效应/记忆性T细胞的一个子集。 使用KLRG1四聚体，以及其他的方法，E，N，和R -钙粘素被确定为KLRG1配体。这些CA 2 +依赖的细胞，细胞粘附分子由胞外域包含五个cadherin的细胞间的相互作用，跨膜结构域和细胞质域与肌动蛋白细胞骨架的重复。 KLRG1四聚体的生成，是必不可少的KLRG1配体的识别。 KLRG1四聚体，也是一个独特的工具，以澄清在调节免疫反应和组织的完整性的作用cadherin和KLRG1发挥。

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A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

这个协议描述KLRG1四聚体的生产，这是一个强大的工具KLRG1配体的分析。

KLRG1四聚体的生产协议

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

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