Agradecemos ao Dr. Naidenko para ajudar a otimizar as condições refolding. Este trabalho foi financiado pelo NIH pesquisa conceder AI58181 para Laurent Brossay. Cindy Banh é suportado pelo NIH NRSA F31 AI080230. Stephanie Terrizzi e Cindy Banh contribuem igualmente para este trabalho.

Preparação de Corpos de Inclusão <ol><li> Inocular 4 x 500 ml frascos de TB, cada uma contendo 50 mg / ml de cloranfenicol carbenicilina e com uma cultura de bactérias durante a noite expressando a construir KLRG1 plasmídeo. Quando o OD atinge 0,6 Å a 600 nm, induzir com a adição de 0,4 M IPTG e incubar a cultura para um adicional de 4 horas agitação a 37 ° C. </li><li> Ressuspender as células colhidas em pH = 8,0 ressuspensão (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) de sacarose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellets podem ser congeladas nesta fase. </li><li> Piscina não mais que 60 ml de resuspensions bacteriana em um copo de polipropileno. Se necessário, ajustar para 60 ml com tampão TE pH 8,0 e agitar a mistura com metade da velocidade. </li><li> A mistura mexendo add-drop sábio: lisozima (final = 1 mg / ml), MgCl2 (final = 5 mM), 2 mg DNAse I em glicerol a 50% continham 75 mM NaCl, Triton X100 (final = 1%), a TDT ( final = 10 mM). </li><li> Sonicate a solução em gelo por 1,5 min e centrifugar a lisados ​​em 5.000 RPM por 10 min a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Decantar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 15 ml de lavagem pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> No gelo, sonicate solução para 1,5 min até que a pelota é completamente ressuspenso. </li><li> Centrifugar as amostras a 5.000 RPM por 10 min a 4 ° C. </li><li> Repita a lavagem 5 vezes. </li></ol></li><li> Repita 5b com tampão de lavagem sem Triton X-100 centrífugas, e ressuspender em 4 ml de tampão TE. </li><li> Pegue o peso úmido inclusão lama corpos e armazenar em tampão TE para uma concentração de 30 a 100 mg / ml. </li></ol> Redobrando de KLRG1 <ol><li> Fazer 1 L de refolding pH = 8,0 (0,4 M-arginina HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA livre de comprimidos inibidores da protease, 5 GSH mM e 0,5 mM GSSG) frio e a 4 ° C, agitando. </li><li> Preparar os corpos de inclusão para injeção a mistura dobrar: É ideal para fazer 5 10 injeções cada um com 0,25 mM de concentração 0,5, para que a concentração final da proteína será 2 3 mM. <ol class="lalpha"><li> Derreta o volume de 50 mg de polpa corpos de inclusão em 7 M GnHCl com 10 mM β-mercaptoetanol. </li><li> Mantenha a inclusão corpos / mistura GnHCl a 37 ° C por 30 - 40 min e vórtice cada 5 minutos para garantir a fusão completa (chorume ficará claro quando completamente derretido). </li><li> Centrifugar a velocidade máxima por 30 minutos em microcentrífuga a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 15 ml. Não transferir qualquer um dos pelota pequena enegrecida. </li></ol></li><li> Ajustar o volume com tampão de injeção (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA). </li><li> Injectar 1 ml de corpos de inclusão diluído a cada hora. Ao injetar, mexa em alta velocidade, adicionar 1 ml de diluída gota a gota, corpos de inclusão com 2 segundos entre cada gota. Quando a injeção é feita, agitar a baixa velocidade. </li><li> Continue mexendo noite para o dia em baixa velocidade, a 4 ° C. </li></ol> Concentração de reações redobrando <ol><li> Seguindo o protocolo Millipore s, concentrar a L 1 de pré-filtrada reação (0,22 mM filtrada) refolding usando um Amicon Stirred Celular e YM10 membrana de ultrafiltração NMWL 10K (Millipore) para ~ 10 ml. </li><li> Concentre-se a ≤ 2 ml usando um Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> Purificação da KLRG1 tetrâmero <ol><li> Configurar o AKTAFPLC a 4 ° C de acordo com manuais GE Healthcare. </li><li> Purificar a forma de monômero de KLRG1 por cromatografia de exclusão utilizando um tamanho Sephacryl S-200 de alta resolução 16/60 coluna (GE Healthcare) em 20 mM HEPES e 150 mM NaCl. (Veja Figura 1). </li><li> Concentrado para 1 ml usando Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li> Use enzima Bira acordo com o protocolo de avidez s para biotinylate do monômero KLRG1. </li><li> A biotina livre é eliminado por cromatografia por exclusão de tamanho como em 2. </li><li> KLRG1 molécula é tetramerized misturando KLRG1 monômero com 4 vezes molar excesso PE estreptavidina conjugada (BD Biosciences). </li></ol> Resultados representante <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /></a> Figura 1. Representante resultados positivos da cromatografia de exclusão AKTA FPLC tamanho do refolded KLRG1. O gráfico mostra a separação do monômero (83,52 ml), dímero (56,36 ml), e multimer forma (36,26 ml) da KLRG1 redobrada. O pico em 94,25 ml representa a troca de buffer.

<ol>
	<li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1.">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li><li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1.">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li><li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity.">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li><li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition.">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li><li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+(KLRG1).">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , .</li></ol>

Neste protocolo, é mostrado como purificar, biotinylate e KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetrâmero pode ser usado para rotular KLRG1 ligantes por citometria de fluxo. Embora as condições refolding terá de ser testado empiricamente para cada proteína, outras lectinas tipo C pode ser tetramerized usando um protocolo similar. Uso de proteínas tetramerized como sondas, ligantes para receptores órfão tipo C lectina poderia ser identificado.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BirA Enzyme and Buffer</td>
<td>Biotinylation Kit</td>
<td>Avidity</td>
<td>BIRA500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>11 836 170 001</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon Stirred Cell</td>
<td>Equipment</td>
<td>Millipore</td>
<td>Model #8400</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane</td>
<td>Filtration Supply</td>
<td>Millipore</td>
<td>13642</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml YM10 concentrator</td>
<td>Filtration Supply</td>
<td>Millipore</td>
<td>4411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AKTAFPLC</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1900-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column</td>
<td>Equipment</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1166-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Strepavidin PE</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>554061</td>
<td>or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a protocol for the production of klrg1 tetramer

Assassino celular G1 receptor lectina-like (KLRG1) é um tipo de receptor da glicoproteína transmembrana II inibitória pertencentes à superfamília tipo C lectina-like. KLRG1 existe tanto como um monômero e como um homodímero dissulfeto ligadas. Este receptor bem conservada é encontrada na maioria das células maduras e recentemente activado NK, bem como em um subconjunto de células T efetoras / memória. Usando KLRG1 tetrâmero, bem como outros métodos, E, N, e R-caderinas foram identificados como KLRG1 ligantes. Estes Ca 2 + dependentes de célula-célula de moléculas de adesão compreende um domínio extracelular contendo cinco repetições caderina responsável por interações célula-célula, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático que está ligada ao citoesqueleto de actina. Geração do tetrâmero KLRG1 foi essencial para a identificação do KLRG1 ligantes. KLRG1 tetrâmero é também uma ferramenta única para elucidar a caderina papéis e jogar KLRG1 na regulação da resposta imune e integridade do tecido.

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A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Este protocolo descreve a produção de KLRG1 tetrâmero, que é uma ferramenta poderosa para a análise de KLRG1 ligantes.

Um protocolo para a Produção de KLRG1 tetrâmero

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

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Biology

9.9K visualizações.  Brown University. Este protocolo descreve a produção de KLRG1 tetrâmero, que é uma ferramenta poderosa para a análise de KLRG1 ligantes.