我们感谢春新王建设pTSO2：：GUS和图1，德特勒夫威格尔的照片分享有益的意见的GUS万无一失的协议，帕哈Sijacic和考特尼荷伦德。 Z. L S实验室的研究是由美国国家科学基金会（IOB0616096和MCB0744752）的支持。 ZL是由美国马里兰大学农业试验站的部分支持。

一，花香浸拟南芥的转化<ol><li>改造前约1个月，大约有10-15％的盆栽植物拟南芥种子播撒到4至8盆（5平方英寸的花盆）。与正常生育的植物，4盆植物每质粒的构建就足够了。如果一个人改造拟南芥突变生育率下降，增加相应的盆数。 </li><li>植物生长标准条件下（16小时光照，8小时黑暗，在22 ° C）。如果较短的一天或更低的温度下生长的植物，他们将需要更长的时间，花和更长的改造做好准备。良好的植物护理，确保健康的植物，这是成功转型的关键。 </li><li>当植株只是狂奔，并开始开花。他们现在准备转型。为了提高转换效率，改造前的3-4天，剪掉主花序芽，尽快为他们狂奔，以鼓励更多中学拍摄形成。植物浇水改造前的一天。这确保土壤不会吸收太多渗透媒体在花香浸。 </li><li>改造前两天，接种40毫升含有适当的抗生素的LB农杆菌菌株GV3101中携带的pTSO2（pTSO2情况下的 GUS，50微克/ ml卡那霉素：）：：GUS的构造。 pTSO2：：GUS在pBIN20载体，拥有NPTII基因，赋予抗卡那霉素3克隆。在摇床过夜增长在28-30 ° C。 </li><li>翌日，转移到含有50微克/ ml卡那霉素LB400毫升8毫升过夜培养。在摇床过夜增长在28-30 ° C。 </li><li>在转型的一天，当外径 600农杆菌文化达到约0.8（ 外径 600 0.5 TO1之间是可以接受的），降速在8分钟在5000RPM农杆菌过夜培养。 </li><li>在1升悬浮农杆菌渗透介质颗粒（升）（10MM氯化镁2，5％的蔗糖，0.44mM 6 benzyladenine（BA），0.3％silwet L - 77，1X Gamborg的维生素解决方案和灭菌水）。媒介并不需要进行高压灭菌，但需要作出新鲜。成菜（如8“X15”X2“硼硅玻璃盘），倒入1升含农杆菌渗透介质。 </li><li>反转锅（植物不会脱落）和渗透液浸所有的植物地上部分，一锅煮5分钟举行一次。虽然植物的地上部分是渗透液中浸泡，避免让土壤浸泡渗透媒体，以减少对土壤真菌生长的机会。 </li><li>浸渍后，放在几层纸巾蘸盆就在自己身边，在一个托盘。纸巾浸泡渗透媒体的访问量。封面用保鲜膜，以确保高湿度的托盘。放置到植物生长室的托盘。 </li><li>翌日，除去保鲜膜和纸巾，和地方盆直立。不要将这些植物的水为四，五个多天。之后，维持植物正常，直到他们种子，并收集散装种子。 </li><li> MS培养基中含有50微克/ ml卡那霉素（重量2.2克Murashige和Skoog不含维生素基底盐倒入板（150x15mm培养皿），1M氢氧化钠溶解在500毫升的水，pH值至5.8，加4革兰氏琼脂，高压灭菌，冷却和添加卡那霉素50μg/ ml的终浓度）。板都保持在4℃直至需要。 </li><li>要选择抗生素耐药性的转基因植物，需要至少20000种子屏幕。 0.1克约5000种子。重量和估计的金额的种子。 </li><li>他们用70％乙醇30秒15毫升猎鹰管清洗消毒种子。用无菌水冲洗种子一次。包含商店买来的，5％漂白水（Clorox公司）1:10稀释的溶液中浸泡30秒的种子。无菌水冲洗3至6倍的种子。在无菌罩，吸管约5000到每个MS板（卡那霉素）的种子，传播的种子均匀板，微孔3M胶带密封板，以避免污染。 </li><li>孵育板在4 ° C在3-4天的黑暗，然后转板一腔（可能是相同的植物生长室）。经过约14天，转基因苗保持绿色，但非转基因​​的脸色苍白，奄奄一息。放缓拉根从中长期放置在土壤中，转基因苗转移到土壤。 </li></ol>二。检查pTSO2：：GUS表达模式<ol><li>收获pTSO2：：GUS转基因苗，他们在寒冷的90％丙酮在玻璃闪烁瓶或离心管保存在冰上。聚苯乙烯微孔板（聚丙烯），也可以使用，如果有大量的样品进行分析。 </li><li>所有样品都收获后，在室温下放置20分钟的小瓶。在这段时间内没有X - Gluc（0.2％Triton X - 100，50mm的NaHPO PH7.2缓冲4，2MM亚铁氰化钾，2MM钾铁氰化钾），并置于冰上新鲜的染色缓冲。 </li><li>从样本中删除丙酮和添加染色缓冲。 </li><li> X - Gluc染色的溶液（0.2％的Triton X - 100，4 NaHPO 50mm的缓冲液PH7.2，2MM钾亚铁氰化物，2mm的铁氰化钾，采用2mm x - gluc） 。从样品中取出染色缓冲和添加样品含有X - Gluc染色缓冲。 </li><li>下15至20分钟的真空渗透的样品。慢慢松开真空和验证，所有样品染色溶液的表面之下下沉。如有必要，重复，直到所有样本下沉渗透，被释放后的真空。 </li><li>孵育在37 ° C与X - Gluc染色缓冲过夜。 </li><li>从孵化器中取出样品取出染色缓冲。在连续乙醇系列清洗样品在室温（20％，35％和50％的乙醇）改变每次30分钟。 </li><li>在FAA固定液（50％乙醇，5％的甲醛，10％的醋酸，其余水）为30分钟，在室温下的组织修复。删除美国联邦航空局（FAA）​​和添加70％的乙醇。此时组织可配备一台数码相机在解剖显微镜下可视化和拍照。深蓝色的颜色表示 TSO2是表示（图1） 。另外，组织可存放在4 ° C以供日后观赏。 <img src="/files/ftp_upload/1952/1952fig1.jpg" alt="图1" /> 图1 pTSO2：：GUS 基因在转基因苗（一），（二）侧根，并根尖（C）。请注意，TSO2发起人是非常年轻和分裂组织中的积极。 （C）所示的零星的表达模式是在特定的细胞周期基因表达的典型。 </li></ol>代表性的成果如果做得正确，转化效率约为0.1-0.2％。换句话说，应该得到筛查每5000种子5-10转基因苗。平均，约100个​​转基因株系可转化野生型植株的4盆。 对于转基因苗含有pTSO2：：GUS基因构建3，深蓝色的色调反映了GUS活性，是在积极的分裂中的细胞，包括嫩叶，茎尖，根尖和侧根原基（图1）。非均匀的零星模式的特点是细胞周期阶段的具体体现。

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	<li>Clough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+agrobacterium-mediated+germ+line+transformation.">Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation.</a> Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).</li><li>Wang, C., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ribonucleotide+reductases+are+critical+for+cell+cycle+progression,+DNA+damage+repair,+and+plant+development.">Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development.</a> Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).</li></ol>

转化效率是由许多不同的因素，下面讨论的： <ol><li>植物的健康和他们的年龄是最重要的。约一个月的老厂生产大量未成熟的花芽，是理想的。修剪主芽，以鼓励中学改造前3-4天拍摄形成会增加转化效率。老厂将产生转化，但在较低的利率。 </li><li>生育的植物是重要的。如果一个人改造与生育率下降的突变体，植物将需要更多的浸渍。 </li><li> 0.3％Silwet L - 77渗透缓冲区中的表面活性剂被认为?...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>6-benzyladenine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>852430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silwet-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crompton Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Toxic, wear gloves</td>
</tr>
<tr>
<td>Murashige and Skoog Basal medium (MS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamborg's vitamin solution 1000X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta;-D-glucuronide cyclohexamine salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biosynth</td>
<td>B-7300</td>
<td>Toxic, light sensitive keep in the dark</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropore 3M Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>19027761</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

floral-dip transformation of arabidopsis thaliana to examine ptso2::&beta;-glucuronidase reporter gene expression

一个有机体，引入外源基因的能力，是现代生物学和生物技术的基础。在该模型中的开花植物<em&gt;拟南芥</em花浸变换方法<sup&gt; 1-2</sup&gt;已取代所有以前的方法，因为它的简单，效率，成本低。具体来说，年轻开花的芽<em&gt;拟南芥</em&gt;植物的溶液浸泡<em&gt;农杆菌</em&gt;携带特定的质粒结构。浸渍后，植物恢复到正常的生长和产量的种子，很小的比例，其中与外源基因的转化，可以选择含抗生素的培养基上。这花香浸方法，大大地促进<em&gt;拟南芥</em&gt;研究大大促进了我国植物基因功能的理解。在这项研究中，我们使用花香浸法记者基因改造，<em&gt;β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的</em&gt;下，控制<em&gt; TSO2</em&gt;推动者。<em&gt; TSO2</em&gt;，核苷酸还原酶（RNR）小亚基编码<sup&gt; 3</sup&gt;，是一个细胞周期调控基因在细胞周期S期dNDP合成的必要条件。审核<em&gt; GUS</em&gt;在转基因的表达<em&gt;拟南芥</em&gt;苗显示，<em&gt; TSO2</em&gt;表示积极分裂组织。报告的实验方法和材料可以很容易地适应不仅为研究，而且还对教育，在高中和大学水平。

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Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

本文介绍了花卉浸方法<em&gt;农杆菌</em&gt;介导的转化<em&gt;拟南芥</em&gt;。通过引入一个细胞周期调节的发起人，记者，<em&gt; pTSO2：β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的</em&gt;，到<em&gt;拟南芥</em&gt;，我们演示了如何检测到GUS基因在转基因苗记者表达。

花香浸改造拟南芥检查 pTSO2：β-葡萄糖醛酸酶报告基因的表达

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

floral-dip-transformation-arabidopsis-thaliana-to-examine-ptso2

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Biology

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

35.7K 次观看.  University of Maryland College Park. 本文介绍了花卉浸方法农杆菌介导的转化拟南芥。通过引入一个细胞周期调节的发起人，记者， pTSO2：β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的，到拟南芥，我们演示了如何检测到GUS基因在转基因苗记者表达。